肥大細(xì)胞在金黃色葡萄球菌腸毒素B誘導(dǎo)小鼠特應(yīng)性皮炎樣炎癥反應(yīng)中的作用

王珊 趙作濤 王譽(yù)涵 涂平 劉玲玲

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科 皮膚病分子診斷北京市重點實驗室（第一作者現(xiàn)在國家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院皮膚科，100045北京）

感染與免疫的相互作用是特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）的發(fā)病機(jī)制研究中的熱點之一，而金黃色葡萄球菌（金葡菌）的感染或定植在AD中的作用已得到公認(rèn)［1］。與誘發(fā)加重AD炎癥相關(guān)的金葡菌產(chǎn)物目前認(rèn)為主是與金葡菌超抗原（staphylococcal superantigen，SsAg）的作用有關(guān)。已有研究顯示，SsAg誘發(fā)加重AD的機(jī)制主要與T細(xì)胞［2］、B細(xì)胞［3］、樹突細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞［4］、嗜酸性粒細(xì)胞［5］等作用有關(guān)。然而，SsAg對另一在AD中起重要作用的肥大細(xì)胞尚未見報道。我們研究［6］發(fā)現(xiàn)，金葡菌腸毒素B（Staphylococcus aureusenterotoxins B，SEB）可直接活化肥大細(xì)胞，使其釋放類胰蛋白酶及組胺，但在體內(nèi)微生物如金葡菌感染或定植是否作用于肥大細(xì)胞并參與AD尚不清楚。因此，本研究用SEB來構(gòu)建小鼠AD模型，初步探討肥大細(xì)胞在SEB誘導(dǎo)的AD樣炎癥反應(yīng)中的作用。

資料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物：SPF級純系BALB/c小鼠24只，6～8周齡，體重20 g左右，雌性，購自斯貝福（北京）試驗動物科技有限公司，合格證號SCKK（京）2011-0004，許可證號SYXK（軍）2012-0014。

2.主要實驗試劑：卵清蛋白（OVA，北京華越洋生物科技有限公司），SEB（美國AnaSpec公司），抗肥大細(xì)胞類胰蛋白酶抗體（ab2378）（英國Abcam公司），PV-二步法免疫組化檢測試劑盒PV-9002、濃縮DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

二、方法

1.小鼠AD模型造模：24只BALB/c小鼠分為4組，每組6只。分為OVA組：1 g/LOVA；SEB組：0.1 g/L SEB；OVA+SEB組：含1 g/LOVA及0.1 g/L SEB的混懸液；對照組：生理氯化鈉溶液。將小鼠戊巴比妥鈉麻醉后電剃刀剔除背部頸部毛發(fā)，3M膠帶在除毛部位反復(fù)粘貼6次，以上背部中央1 cm2皮膚作為靶部位。依據(jù)分組將各組需配制的100μl致敏物質(zhì)加入斑試器中的濾紙片，將斑貼器用繃帶固定于背部，每2～3天更換，1周后取下，間隔2周再循環(huán)封閉斑貼1周，共循環(huán)封閉斑貼3輪。7周造模結(jié)束后去除斑試器，觀察靶部位的臨床表現(xiàn)并參照EASI評分法［7］評估小鼠背部皮損炎癥的嚴(yán)重程度，即分別對皮損的紅斑、浸潤（水腫）或丘疹、鱗屑和苔蘚樣變4項進(jìn)行評分。每項嚴(yán)重程度以0～3分計分：0計無，1計輕度，2計中度，3計重度，4項評分之和為皮損嚴(yán)重程度評分。

2.皮損標(biāo)本收集及處理：第7周第3輪封閉斑貼誘導(dǎo)結(jié)束后收集組織標(biāo)本，使用5mm環(huán)鉆取各組小鼠接觸斑試器部位皮膚，以4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切取4μm石蠟切片（免疫組化切片使用專用陽離子防脫片），行HE染色、甲苯胺藍(lán)染色及免疫組化類胰蛋白酶染色。免疫組化采用常規(guī)二步法，常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)、3%H2O2孵育15min，分別加入稀釋的類胰蛋白酶一抗，4℃孵育過夜，滴加通用二抗IgG抗體-HRP多聚體，室溫孵育20min，DAB顯色2～5min，常規(guī)復(fù)染、風(fēng)化、透明化及封片，光鏡下觀察染色情況。

3.肥大細(xì)胞計數(shù)：肥大細(xì)胞使用甲苯胺藍(lán)染色的切片計數(shù)。每張切片取獨立10個高倍視野（HPF，×400），每個視野分別計數(shù)甲苯胺藍(lán)（+）細(xì)胞數(shù)，累加為肥大細(xì)胞總數(shù)目，除以10取均值為該切片高倍視野肥大細(xì)胞均數(shù)（肥大細(xì)胞數(shù)/HPF）；同時計數(shù)該視野中處于脫顆粒形態(tài)的肥大細(xì)胞數(shù)，即脫顆粒肥大細(xì)胞均數(shù)（脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)/HPF），并計算脫顆粒肥大細(xì)胞百分比。脫顆粒百分比=脫顆粒肥大細(xì)胞均數(shù)/肥大細(xì)胞均數(shù)×100%。為減少人為計數(shù)誤差，采用兩位實驗者同時計數(shù)的方法，將每人計數(shù)的結(jié)果相加取均值。

4.統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析采用SPSS14.0統(tǒng)計分析軟件。數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗，若為正態(tài)分布，采用±s描述，若不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）描述。分析不同處理的組間差別，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用Tukey-kramer法。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用多重比較Wilcoxon方法。相關(guān)分析采用二元變量相關(guān)分析Pearson法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 經(jīng)皮刺激BALB/c小鼠背部7周后皮損表現(xiàn) 卵清蛋白（OVA）組、金黃色葡萄球菌腸毒素B（SEB）組及OVA+SEB組均見不同程度的紅斑、鱗屑及結(jié)痂，OVA+SEB組最嚴(yán)重

結(jié) 果

一、模型小鼠AD樣皮損炎癥反應(yīng)和評分

分別使用OVA、SEB及OVA+SEB聯(lián)合組經(jīng)皮誘導(dǎo)BALB/c小鼠后背7周后，3個組背部接觸斑試物部位皮膚均出現(xiàn)不同程度炎癥反應(yīng)：表現(xiàn)為紅斑、鱗屑以及少許結(jié)痂。其中，OVA+SEB組的紅斑和鱗屑表現(xiàn)較OVA組及SEB組明顯嚴(yán)重，OVA組較SEB組紅斑和鱗屑略嚴(yán)重，對照組未見明顯的紅斑、鱗屑、結(jié)痂表現(xiàn)。見圖1。

皮損嚴(yán)重程度評分OVA組為6.0（0.75），SEB組為6.00（1.50），OVA+SEB組為7.50（1.75），對照組為1.00（0.75）。其中OVA+SEB組皮損嚴(yán)重程度評分最高，采用多重比較Wilcoxon法與OVA組、SEB組及對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Z值分別為2.124、2.084和 2.381，P值分別為 0.034、0.037和0.017）；OVA組和SEB組皮損嚴(yán)重程度平均評分均高于對照組，分別與對照組比較，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z值分別為2.428和2.381，P值分別為0.015和0.017），OVA組和SEB組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=0.500，P=0.617）。見圖2。

圖2 不同組別皮損嚴(yán)重程度評分均值比較 a：與對照組比較，P＜0.05；b：與OVA+SEB組比較，P＜0.05。OVA：卵清蛋白；SEB：金黃色葡萄球菌腸毒素B

二、模型小鼠AD樣皮損的組織病理表現(xiàn)

光鏡下觀察皮損HE染色組織，OVA組、SEB組和OVA+SEB聯(lián)合組與對照組相比，均表現(xiàn)出不同程度的表皮角化過度和角化不全，部分區(qū)域表皮增厚，海綿水腫，真皮全層、皮下脂肪、肌肉間隙以淋巴細(xì)胞為主的單個核細(xì)胞浸潤，小血管擴(kuò)張充血。各組單個核細(xì)胞細(xì)胞浸潤程度由重到輕依次為OVA+SEB組、OVA組、SEB組和對照組。見圖3。

三、模型小鼠AD樣皮損組織的甲苯胺藍(lán)染色與類胰蛋白酶免疫組化染色對比

觀察甲苯胺藍(lán)染色（+）及類胰蛋白酶免疫組化染色（+）的細(xì)胞的分布、數(shù)目、形態(tài)基本一致（圖4）。但類胰蛋白酶染色有部分假陽性，而甲苯胺藍(lán)非特異性染色較少，更為清晰，故肥大細(xì)胞計數(shù)依據(jù)甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果。

四、模型小鼠AD樣皮損組織的肥大細(xì)胞數(shù)目、脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)目及脫顆粒肥大細(xì)胞百分比

1.甲苯胺藍(lán)染色（+）肥大細(xì)胞數(shù)目：在光鏡下OVA組、SEB組和OVA+SEB組的平均甲苯胺藍(lán)染色（+）肥大細(xì)胞數(shù)目均較對照組顯著增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（多重比較Wilcoxon法，Z值分別為2.647、2.807和 2.807，P值分別為 0.008、0.005和0.005），其中OVA+SEB組肥大細(xì)胞數(shù)目最多，高于OVA組及SEB組，但組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Z值分別為1.201和1.201，P值分別為0.230和0.230）。OVA組和SEB組平均肥大細(xì)胞數(shù)目接近，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=0，P=1）。見表1。

圖3 卵清蛋白（OVA）組、金黃色葡萄球菌腸毒素B（SEB）組和OVA+SEB聯(lián)合組和對照組皮損HE染色及甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果 各組單個核細(xì)胞細(xì)胞浸潤程度由重到輕依次為OVA+SEB組、OVA組、SEB組和對照組

圖4 甲苯胺藍(lán)染色與類胰蛋白酶免疫組化染色 4A：甲苯胺藍(lán)染色×100；4B：甲苯胺藍(lán)染色×400；4C：類胰蛋白酶免疫組化染色×100；4D：類胰蛋白酶免疫組化染色×400。甲苯胺藍(lán)染色（+）及類胰蛋白酶免疫組化染色（+）的細(xì)胞分布、數(shù)目、形態(tài)基本一致

2.甲苯胺藍(lán)染色（+）脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)目及百分比：在光鏡下計數(shù)各組脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)目及計算百分比見表1。采用單因素方差分析計算各組肥大細(xì)胞脫顆粒比例差異，F(xiàn)=20.465，P＜0.001，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步應(yīng)用Tukey-kramer法進(jìn)行組間比較顯示，SEB組及OVA+SEB組的脫顆粒肥大細(xì)胞比例較高，均明顯高于對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為6.261和4.636，均P＜0.001），而SEB組與SEB+OVA組比較，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.625，P=0.388）。OVA組脫顆粒肥大細(xì)胞比例較低，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.057，P=0.999）。見表1。

五、模型小鼠AD樣皮損組織中甲苯胺藍(lán)染色（+）肥大細(xì)胞數(shù)目與臨床皮損嚴(yán)重程度的相關(guān)性

將OVA組、SEB組、OVA+SEB組和對照組甲苯胺藍(lán)染色（+）肥大細(xì)胞數(shù)目與臨床皮損嚴(yán)重程度評分做二元變量相關(guān)分析，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.940，P=0.040，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。故認(rèn)為肥大細(xì)胞數(shù)目與皮損嚴(yán)重程度評分呈線性正相關(guān)。即肥大細(xì)胞數(shù)目越多，臨床皮損炎癥程度越重。

討 論

表1 甲苯胺藍(lán)染色（+）肥大細(xì)胞數(shù)目、脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)目及脫顆粒肥大細(xì)胞百分比

OVA誘導(dǎo)BALB/c小鼠AD模型是由1998年Spergel等首先建立［8-9］，SEB作為超抗原刺激小鼠皮膚建立的AD模型是由Laouini等［10］建立。Skov等［11］發(fā)現(xiàn)在人身上以SEB封閉斑貼實驗也可產(chǎn)生紅斑、炎癥等皮膚表現(xiàn)，SEB可通過超抗原的方式激活皮膚T細(xì)胞并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。本研究使用OVA誘導(dǎo)模擬AD皮損，而使用OVA+SEB聯(lián)合誘導(dǎo)模擬了在AD皮損基礎(chǔ)上合并金葡菌感染的模型。

OVA+SEB聯(lián)合刺激時，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的皮損臨床表現(xiàn)如紅斑鱗屑等局部皮炎反應(yīng)程度、皮損嚴(yán)重程度評分及病理上單個核細(xì)胞的浸潤程度明顯重于單用OVA刺激的皮損，表明聯(lián)合刺激時的皮損炎癥更重。甲苯胺藍(lán)染色顯示，OVA+SEB聯(lián)合組皮損的肥大細(xì)胞平均數(shù)也明顯地高于單獨使用OVA誘導(dǎo)的皮損，雖然差異無統(tǒng)計學(xué)意義（可能與OVA+SEB組的組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差較大及實驗鼠樣本量較少有關(guān)），但肥大細(xì)胞明顯增多的趨勢仍可表明：SEB的作用可以加重OVA誘導(dǎo)的AD樣皮膚炎癥反應(yīng)；且肥大細(xì)胞的數(shù)目越多，AD樣皮損越嚴(yán)重。相關(guān)性分析也表明，肥大細(xì)胞的數(shù)目與AD樣皮損的嚴(yán)重程度是平行的。

OVA與SEB建立的AD小鼠模型在肉眼觀察皮損外觀、皮損處病理模式及肥大細(xì)胞數(shù)目方面均有相似，表明SEB與OVA同樣能經(jīng)皮誘導(dǎo)AD樣的皮炎并導(dǎo)致皮損局部肥大細(xì)胞增多，共同參與AD皮損發(fā)生過程中的機(jī)制。但不同的是，使用SEB以及OVA+SEB聯(lián)合刺激產(chǎn)生的模型小鼠AD樣皮損中脫顆粒肥大細(xì)胞的百分比明顯高于單用OVA組，表明與OVA相比，SEB更能刺激活化肥大細(xì)胞，使其脫顆粒。原因可能為OVA是蛋白抗原，其對肥大細(xì)胞的活化需要經(jīng)過APC的提呈，依次活化T細(xì)胞和B細(xì)胞，產(chǎn)生IgE活化肥大細(xì)胞；而SEB是超抗原，既可通過該IgE依賴途徑也可通過非IgE依賴途徑直接活化肥大細(xì)胞，故更加增強(qiáng)了活化肥大細(xì)胞作用，在皮損中表現(xiàn)為更多的肥大細(xì)胞處于脫顆粒狀態(tài)。

肥大細(xì)胞經(jīng)典的甲苯胺藍(lán)染色與類胰蛋白酶免疫組化染色的對比顯示二者有比較好的一致性，表明肥大細(xì)胞活化后所釋放的介質(zhì)主要成分之一即是類胰蛋白酶。本研究證實，肥大細(xì)胞在SEB誘導(dǎo)的模型小鼠AD樣皮損中發(fā)揮作用，而類胰蛋白酶是介導(dǎo)該作用的炎癥介質(zhì)之一。AD患者的皮損部位伴發(fā)的嚴(yán)重瘙癢癥狀困擾著大多數(shù)AD患者，臨床上第一、二代抗組胺藥物治療AD瘙癢的效果均不甚理想，此與類胰蛋白酶可能是比組胺更加重要的介導(dǎo)AD瘙癢介質(zhì)［12］有關(guān)。近年來有研究證實，類胰蛋白酶抑制劑具有穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜的作用，如雙苯甲瞇、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑、乳鐵蛋白等［13］。本研究結(jié)果提示，臨床可研發(fā)抑制肥大細(xì)胞活性藥物或可嘗試使用類胰蛋白酶抑制劑來控制及緩解AD的瘙癢癥狀和皮膚炎癥反應(yīng)。

本實驗不足之處在于獲得模型標(biāo)本后檢測內(nèi)容有限，尚不能全面描述肥大細(xì)胞在SEB誘導(dǎo)的AD樣皮損中的作用，且樣本量有限。未來研究將進(jìn)一步檢測更多炎癥介質(zhì)在其中的表達(dá)，并探索該過程與IgE的關(guān)系，同時著眼結(jié)合肥大細(xì)胞基因敲除小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)試驗，以求更加完善地闡明肥大細(xì)胞在AD中的作用。

綜上所述，本研究進(jìn)一步驗證了SEB經(jīng)皮刺激可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生AD樣皮損，并可加重OVA誘導(dǎo)小鼠AD樣皮損嚴(yán)重程度；證實了肥大細(xì)胞增殖、活化脫顆粒釋放類胰蛋白酶等參與此炎癥過程。

［1］Ong PY,Leung DY.The infectious aspects of atopic dermatitis［J］.Immunol Allergy Clin North Am,2010,30（3）：309-321.DOI：10.1016/j.iac.2010.05.001.

［2］Cardona ID,Cho SH,Leung DY.Role of bacterial superantigens in atopic dermatitis：implications for future therapeutic strategies［J］.Am JClin Dermatol,2006,7（5）：273-279.

［3］Leung DY,Harbeck R,Bina P,etal.Presenceof IgE antibodies to staphylococcal exotoxins on the skin of patients with atopic dermatitis.Evidence fora new group ofallergens［J］.JClin Invest,1993,92（3）：1374-1380.DOI：10.1172/JCI116711.

［4］Kim KH,Han JH,Chung JH,et al.Role of staphylococcal superantigen in atopic dermatitis：influence on keratinocytes［J］.JKorean Med Sci,2006,21（2）：315-323.DOI：10.3346/jkms.2006.21.2.315.

［5］ Wedi B,Wieczorek D,Stünkel T,et al.Staphylococcal exotoxins exert proinflammatory effects through inhibition of eosinophil apoptosis,increased surface antigen expression（CD11b,CD45,CD54,and CD69）,and enhanced cytokine-activated oxidative burst,thereby triggering allergic inflammatory reactions［J］.J Allergy Clin Immunol,2002,109（3）：477-484.

［6］王珊,趙作濤,王譽(yù)涵,等.金黃色葡萄球菌腸毒素B對LAD2肥大細(xì)胞系活化作用的研究［J］.中華皮膚科雜志,2017,50（10）：626-630.

［7］趙辨.濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)評分法［J］.中華皮膚科雜志,2004,37（1）：3-4.DOI：10.3760/j.issn：0412-4030.2004.01.002.

［8］Spergel JM,Mizoguchi E,Brewer JP,et al.Epicutaneous sensitization with protein antigen induces localized allergic dermatitis and hyperresponsiveness tomethacholine after single exposure to aerosolized antigen inmice［J］.JClin Invest,1998,101（8）：1614-1622.DOI：10.1172/JCI1647.

［9］Jin H,He R,OyoshiM,et al.Animalmodels of atopic dermatitis［J］.J Invest Dermatol,2009,129（1）：31-40.DOI：10.1038/jid.2008.106.

［10］LaouiniD,Kawamoto S,Yalcindag A,et al.Epicutaneous sensitization with superantigen induces allergic skin inflammation［J］.J Allergy Clin Immunol,2003,112（5）：981-987.DOI：10.1016/j.jaci.2003.07.007.

［11］Skov L,Olsen JV,Giorno R,et al.Application ofStaphylococcalenterotoxin B on normal and atopic skin induces up-regulation of T cells by a superantigen-mediatedmechanism［J］.JAllergy Clin Immunol,2000,105（4）：820-826.DOI：10.1067/mai.2000.105524.

［12］Kawakami T,Ando T,Kimura M,et al.Mast cells in atopic dermatitis［J］.Curr Opin Immunol,2009,21（6）：666-678.DOI：10.1016/j.coi.2009.09.006.

［13］ Caughey GH.Mast cell proteases as pharmacological targets［J］.Eur JPharmacol,2016,778：44-55.DOI：10.1016/j.ejphar.2015.04.045.