鹽裂皮膚間接免疫熒光及BP180 NC16a酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定在大皰性類天皰瘡診斷中的意義

李鎖 李志量 荊可 向睿宇 張寒梅 馮素英

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院皮膚科 江蘇省皮膚病與性病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

大皰性類天皰瘡（bullous pemphigoid，BP）是一種自身免疫性表皮下水皰?。?］。BP典型皮損為正常皮膚或紅斑及風(fēng)團(tuán)基礎(chǔ)上出現(xiàn)張力性水皰、大皰，體表任何部位均可受累，但常見(jiàn)于軀干和四肢，常伴瘙癢，有時(shí)有燒灼感，尼氏征通常陰性，黏膜受累不常見(jiàn)［2］。BP患者血清中產(chǎn)生針對(duì)皮膚基底膜帶的循環(huán)自身抗體，靶抗原為BP抗原1（BPAg1，又稱BP230，相對(duì)分子質(zhì)量為230 000）和BP抗原2（BPAg2，又稱BP180，相對(duì)分子質(zhì)量為180 000），它們是位于半橋粒上的兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白。目前研究認(rèn)為，BP180在BP發(fā)病上起主要作用，其NC16a表位與BP病情活動(dòng)度和嚴(yán)重程度相關(guān)［3］。BP病理變化為表皮下水皰，直接免疫熒光顯示基底膜帶有IgG和（或）C3沉積，行鹽裂皮膚間接免疫熒光檢查（indirect immunofluorescence on salt-split skin，IIFSSS）可發(fā)現(xiàn)免疫復(fù)合物沉積在表皮側(cè)［4］。BP的診斷基于臨床表現(xiàn)、病理和免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果，目前少有對(duì)中國(guó)人群BP采用血清學(xué)診斷方法的大樣本臨床研究。基于此，我們分析IIF-SSS及BP180 NC16a酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)在BP診斷中的敏感性、特異性、相關(guān)性，從而更好地指導(dǎo)血清學(xué)診斷方法在BP的應(yīng)用。

對(duì)象與方法

一、臨床資料

2015年1月至2017年8月，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院初診為BP患者174例，所有入選病例符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①典型臨床以皮膚紅斑基礎(chǔ)上緊張性水皰為主要表現(xiàn)，尼氏征陰性；②組織病理證實(shí)為表皮下水皰，真皮內(nèi)有嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；③患者正常皮膚DIF示基底膜帶有IgG和（或）C3沉積；④IIF-SSS檢查示免疫復(fù)合物［IgG和（或）C3］線狀沉積在表皮側(cè)；⑤行BP180抗體檢測(cè)陽(yáng)性（即＞9 U/ml）；其中BP診斷符合④⑤；或者符合①②③+［④或⑤］［4-6］。174例中男108例，女66例，年齡2～95歲，平均70.25歲，均在病情活動(dòng)期抽取全血。對(duì)照組129例中男76例，女53例，年齡5～90歲，平均53.12歲；對(duì)照組中健康體檢30例，天皰瘡38例，濕疹21例，膿皰性銀屑病7例，多形紅斑7例，扁平苔蘚4例，藥疹4例，丘疹性蕁麻疹5例，癢疹3例，單純性大皰性表皮松解癥4例，獲得性大皰性表皮松解癥2例，P200類天皰瘡1例，紅皮病2例，增殖性膿皮病1例。本研究通過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選者均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

1.IIF-SSS：取包皮切除術(shù)后新鮮正常人包皮皮膚，去除皮下脂肪，切成0.5 cm×0.5 cm，放入預(yù)冷的1 mol/L NaCl溶液中，4℃，連續(xù)、緩慢、勻速攪拌24～48 h，每24小時(shí)換液1次，至表皮微微皺起，OCT包埋，切成6 μm厚冰凍切片，制成底片，-80℃保存。制好的鹽裂皮膚冰凍切片取出，PBS清洗5 min 2次，并用去離子水漂洗1次。用PBS 1∶10稀釋受檢血清，滴加30 μl稀釋的血清至底片上，37℃濕盒內(nèi)孵育切片30 min，PBS清洗5 min 3次，雙蒸水漂洗1次，吹干后加入以1∶50稀釋異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊抗人IgG及C3（FITC-IgG及C3購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），重復(fù)上述孵育、清洗、漂洗步驟，吹干后熒光顯微鏡（日本Nikon公司）下觀察結(jié)果。以鹽裂皮膚表皮側(cè)或真皮側(cè)見(jiàn)熒光沉積判斷為陽(yáng)性（圖1）。

2.BP180 NC16a-ELISA和定量方法：嚴(yán)格按照BP180 NC16a-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（日本MBL公司）說(shuō)明書(shū)操作。將待測(cè)血清（1∶101稀釋）及Calibrator 1和Calibrator 2各100 μl分別加入至抗原包被的微孔。室溫（20～25℃）孵育1 h，洗滌4次；各孔加入100 μl結(jié)合液，室溫孵育1 h，洗滌4次；各孔加入100 μl底物溶液，室溫孵育30 min；各孔加入100 μl終止液終止酶反應(yīng)。酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）A450 nm下讀取每孔吸光度值，根據(jù)結(jié)果判定公式計(jì)算：Units（U/ml）=（A450＜Sample＞-A450＜Calibrator1＞）/（A450＜Calibrator2＞-A450＜Calibrator1＞）×100，每個(gè)樣品做2個(gè)復(fù)孔，取均值。結(jié)果判定：抗BP180NC16a-ELISA值（U/ml）＜9為陰性；＞9為陽(yáng)性。

圖1 表皮下水皰病鹽裂皮膚間接免疫熒光檢測(cè)（箭頭）1A：裂隙表皮側(cè)可見(jiàn)熒光沉積；1B：裂隙表皮側(cè)和真皮側(cè)均可見(jiàn)熒光沉積；1C：裂隙真皮側(cè)可見(jiàn)熒光沉積；1D：裂隙表皮側(cè)和真皮側(cè)未見(jiàn)熒光沉積

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)法。計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）及ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）反映BP180 NC16a-ELISA法敏感性和特異性。用Spearman非參數(shù)雙變量相關(guān)分析方法分析IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA法相關(guān)性。

結(jié)果

一、IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA敏感性及特異性比較

174例BP患者及129例對(duì)照IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA結(jié)果見(jiàn)表1。BP患者及對(duì)照者BP180 NC16a-ELISA值及BP180 NC16a-ELISA ROC曲線見(jiàn)圖2。IIF-SSS敏感性為93.67%，特異性為100%，BP180 NC16a-ELISA的敏感性為96.55%，特異性為96.12%。BP180 NC16a-ELISA與IIF-SSF敏感性比較，P值0.214，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BP180 NC16a-ELISA與IIF-SSF特異性比較，P值為0.024，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BP180 NC16a-ELISA AUC值為0.978。

表1 大皰性類天皰瘡（BP）患者組與對(duì)照組鹽裂皮膚間接免疫熒光檢查（IIF-SSS）與BP180 NC16a酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）結(jié)果比較

圖2 大皰性類天皰瘡（BP）患者組與對(duì)照組BP180 NC16a酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）值及BP180 NC16a-ELISA ROC曲線

二、IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA相關(guān)性分析

IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA法相關(guān)系數(shù)為0.147，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)系數(shù)＞0.7是強(qiáng)相關(guān)，0.4～0.7是中度相關(guān)，0.1～0.3是弱相關(guān)。

三、直接免疫熒光（DIF）、IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA敏感性

從174例BP患者選取25例具有典型BP臨床表現(xiàn)，尼氏征陰性，組織病理檢查證實(shí)為表皮下皰，真皮內(nèi)有嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并有DIF、IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示DIF敏感性為80%，IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA敏感性為96%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討論

BP好發(fā)于70～80歲老年人，＜50歲的人群很少患BP，偶見(jiàn)于兒童，隨著社會(huì)的老齡化及皰病血清學(xué)診斷的應(yīng)用，BP患者人數(shù)呈上升趨勢(shì)［7］。不典型BP可模擬多形紅斑、出汗不良性濕疹、扁平苔蘚、藥疹、結(jié)節(jié)性癢疹、紅皮病等疾病，此外BP還需與表皮內(nèi)水皰病以及其他表皮下水皰病鑒別，為臨床診斷帶來(lái)了挑戰(zhàn)［8］。研究認(rèn)為，BP180在BP發(fā)病上起主要作用，BP180屬于Ⅱ型跨膜蛋白，N末端位于細(xì)胞內(nèi)，C末端位于細(xì)胞外，其細(xì)胞外肽鏈含有15個(gè)膠原樣節(jié)段，故又稱為ⅩⅦ膠原（COL17），BP患者血清學(xué)研究及BP動(dòng)物模型、冰凍切片模型和細(xì)胞模型的相關(guān)研究表明，COL17的NC16a結(jié)構(gòu)域是BP主要的致病靶抗原，Hofmann等［3］和Zhao等［9］通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NC16a自身抗體與BP病情活動(dòng)度和嚴(yán)重程度相關(guān)。BP病理變化為表皮下水皰，直接免疫熒光顯示基底膜帶有IgG和（或）C3沉積。BP的傳統(tǒng)診斷基于臨床表現(xiàn)、病理和DIF檢測(cè)結(jié)果，基于此，我們對(duì)BP血清學(xué)診斷方法（IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA）進(jìn)行相關(guān)分析并與DIF進(jìn)行比較，從而更好地指導(dǎo)血清學(xué)診斷方法在BP的應(yīng)用。

以往其他報(bào)道的IIF-SSS敏感性70%～85%，特異性96%～100%［10］，我們研究發(fā)現(xiàn)，IIF-SSS的敏感性為93.67%，特異性為100%，與之相比特異性一致，敏感性有所提高，說(shuō)明IIF-SSS是BP診斷的重要標(biāo)準(zhǔn)。除BP以外，表皮側(cè)IgG和（或）C3沉積還可見(jiàn)于瘢痕性類天皰瘡，這種情況時(shí)靶抗原是表皮側(cè)抗原BP180NC16a表位和α6β4整合素。然而瘢痕性類天皰瘡靶抗原具有異質(zhì)性，還包括真皮側(cè)抗原BP180羧基端表位、層粘連蛋白5和Ⅶ型膠原。瘢痕性類天皰瘡?fù)卸鄠€(gè)抗原受累，因此多數(shù)IIFSSS為雙側(cè)沉積模式（IgG和/或C3同時(shí)沉積在表皮側(cè)和真皮側(cè)），有時(shí)還可表現(xiàn)為單獨(dú)真皮側(cè)沉積［11］。

BP180 NC16a-ELISA的敏感性為96.55%，特異性為96.12%，BP180 NC16a-ELISA的AUC值為0.978，說(shuō)明BP180 NC16a-ELISA在BP診斷中具有較高價(jià)值。我們既往研究BP180 NC16a-ELISA特異性和敏感性均為97.62%［12］，與之相比，兩次研究結(jié)果一致。為了更好地探討血清學(xué)診斷方法在BP診斷中的價(jià)值，我們從174例BP患者選取25例具有典型BP臨床表現(xiàn)，尼氏征陰性，組織病理檢查證實(shí)為表皮下皰，真皮內(nèi)有嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并有DIF、IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示DIF敏感性為80%，IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA敏感性均為96%，BP血清學(xué)診斷方法（IIF-SSS，BP180NC16a-ELISA）的敏感性與DIF差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明血清學(xué)診斷方法和DIF均是BP診斷的重要方法。

IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA法相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)為0.147，P＜0.05，提示IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA法有相關(guān)性，但相關(guān)系數(shù)偏小。研究結(jié)果說(shuō)明，IIF-SSS不僅與BP180自身抗體有關(guān)，可能還與BP230有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，IIFSSS與BP180 NC16a-ELISA法無(wú)相關(guān)性，分析差異原因可能與IIF-SSS敏感性差異有關(guān)［1，12］。

BP血清學(xué)診斷方法特異性強(qiáng)、敏感性高，值得臨床推廣應(yīng)用。BP血清學(xué)診斷我們推薦IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA法聯(lián)合使用，原因如下：①I(mǎi)IFSSS熒光結(jié)果可作為BP診斷的重要標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)抗體沉積模式對(duì)表皮下水皰病進(jìn)一步分類診斷；②BP180 NC16a-ELISA法不僅能夠?yàn)榕R床提供客觀、定量、重復(fù)性好的數(shù)據(jù)，而且能夠?yàn)椴∏樵u(píng)估提供參數(shù)。

［1］Schmidt E,Zillikens D.Pemphigoid diseases［J］.Lancet,2013,381（9863）：320-332.DOI：10.1016/S0140-6736（12）61140-4.

［2］della TR,Combescure C,Cortés B,et al.Clinical presentation and diagnostic delay in bullous pemphigoid：a prospective nationwide cohort［J］.Br J Dermatol,2012,167（5）：1111-1117.DOI：10.1111/j.1365-2133.2012.11108.x.

［3］Hofmann S,Thoma-Uszynski S,Hunziker T,et al.Severity and phenotype of bullous pemphigoid relate to autoantibody profile against the NH2-and COOH-terminal regions of the BP180 ectodomain［J］.J Invest Dermatol,2002,119（5）：1065-1073.DOI：10.1046/j.1523-1747.2002.19529.x.

［4］Venning VA,Taghipour K,Mohd MMF,et al.British Association of Dermatologists′guidelines for the management of bullous pemphigoid 2012［J］.Br J Dermatol,2012,167（6）：1200-1214.DOI：10.1111/bjd.12072.

［5］中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)皮膚科醫(yī)師分會(huì)自身免疫性疾病亞專業(yè)委員.大皰性類天皰瘡診斷和治療的專家建議［J］.中華皮膚科雜志,2016,49（6）：384-387.DOI：10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.06.003.

［6］de Vega IF,Iranzo-Fernández P,Mascaró-Galy JM.Bullous pemphigoid：clinical practice guidelines［J］.Actas Dermosifiliogr,2014,105（4）：328-346.DOI：10.1016/j.ad.2012.10.022.

［7］Nishie W.Update on the pathogenesis of bullous pemphigoid：an autoantibody-mediated blistering disease targeting collagenⅩⅦ［J］.J Dermatol Sci,2014,73（3）：179-186.DOI：10.1016/j.jdermsci.2013.12.001.

［8］Cozzani E,Gasparini G,Burlando M,et al.Atypical presentations of bullous pemphigoid：clinical and immunopathological aspects［J］.Autoimmun Rev,2015,14（5）：438-445.DOI：10.1016/j.autrev.2015.01.006.

［9］Zhao CY,Murrell DF.Advances in understanding and managing bullous pemphigoid［J］.F1000Res,2015,4.DOI：10.12688/f1000research.6896.1.

［10］Sárdy M,Kostaki D,Varga R,et al.Comparative study of direct and indirect immunofluorescence and of bullous pemphigoid 180 and 230 enzyme-linked immunosorbent assays for diagnosis of bullous pemphigoid［J］.J Am Acad Dermatol,2013,69（5）：748-753.DOI：10.1016/j.jaad.2013.07.009.

［11］Xu HH,Werth VP,Parisi E,et al.Mucous membrane pemphigoid［J］.Dent Clin North Am,2013,57（4）：611-630.DOI：10.1016/j.cden.2013.07.003.

［12］Feng S,Lin L,Jin P,et al.Role of BP180NC16a-enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）in the diagnosis of bullous pemphigoid in China［J］.Int J Dermatol,2008,47（1）：24-28.DOI：10.1111/j.1365-4632.2007.03531.x.