辛伐他汀對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈微栓塞后心肌微小血管的影響及潛在機(jī)制

馬麗，韓紅彥，戴文琴

冠狀動(dòng)脈微栓塞（CME）在臨床較常見(jiàn)，嚴(yán)重影響患者的心功能及預(yù)后。CME引起心肌微循環(huán)灌注障礙，因而恢復(fù)心肌組織的血流灌注成為CME治療的切入點(diǎn)[1]。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[2]，他汀類(lèi)藥物具有明顯改善心肌微循環(huán)和促進(jìn)血管再生的作用，其機(jī)制為減少甲烴戊酸通路中間產(chǎn)物異戊烯類(lèi)生物合成，進(jìn)而使絲氨酸-蘇氨酸磷酸化而活化，增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOs）的穩(wěn)定性和活性，提高心肌一氧化氮（NO）水平[3,4]。本研究分析了辛伐他汀干預(yù)對(duì)大鼠CME后心肌微小血管的影響及可能機(jī)制，旨在為CME的臨床治療提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 選取SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量230～260 g，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（鄂）2004-0007。所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食全價(jià)顆粒飼料，溫度控制在18℃～24℃。將其隨機(jī)分成4組，各15只：對(duì)照組（A組）、假手術(shù)組（B組）、冠狀動(dòng)脈微栓塞組（C組）、辛伐他汀干預(yù)組（D組）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 辛伐他?。ㄉ綎|魯抗制藥有限公司），高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、內(nèi)皮素-1（ET-1）等檢測(cè)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。多功能生理記錄儀及TKR-200C動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟儀器廠）、5-MHZ多平面經(jīng)食道超聲探頭及V超聲心動(dòng)圖儀（美國(guó)GE公司）、Image pro 4.0顯微鏡聯(lián)合計(jì)算機(jī)纖維分析系統(tǒng)（日本尼康公司）。

1.3 冠狀動(dòng)脈微栓塞模型制作方法 自心尖部注入大鼠自體血栓微粒造成心肌微小血管栓塞建立冠狀動(dòng)脈微栓塞模型。每只大鼠尾靜脈取血2 ml凝固形成血栓，恒溫箱（37℃）過(guò)夜烘干，研磨器研磨后過(guò)濾使之成均勻顆粒，每只動(dòng)物稱(chēng)8 mg血栓顆粒備用[5]。次日大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，取仰臥位，氣管插管，呼吸機(jī)通氣輔助。在大鼠第2肋間水平橫切，剪斷胸骨，切開(kāi)心包后充分暴露主動(dòng)脈根部。取備用的血栓顆粒于生理鹽水0.5 ml混勻，用1 ml的注射器吸取0.5 ml血栓懸浮液注入心尖，同時(shí)鉗夾升主動(dòng)脈，10 s后松開(kāi)，壓迫穿刺口止血成功后關(guān)胸復(fù)蘇。術(shù)后每天肌肉注射青霉素（40萬(wàn)U/只），持續(xù)3 d。

1.4 干預(yù)方法 D組：制備CME模型后，辛伐他汀溶于5 ml生理鹽水，灌胃給藥（2 mg/kg），1/d；C組：制備CME模型后，給予5 ml生理鹽水灌胃，1/d；B組：手術(shù)過(guò)程自心尖注入生理鹽水替代血栓微粒，給予5 ml生理鹽水灌胃，1/d；A組：為健康大鼠，給予5 ml生理鹽水灌胃，1/d。所有大鼠均于持續(xù)干預(yù)28 d后處死。

1.5 指標(biāo)測(cè)定方法

1.5.1 微小血管免疫組化染色 處死大鼠，分離心臟，游離肉眼可見(jiàn)的冠狀動(dòng)脈栓塞，微小血管密度及數(shù)量變化按照文獻(xiàn)[6]的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，加入CD31抗體進(jìn)行免疫組化染色，計(jì)算動(dòng)脈栓塞內(nèi)著色的微小血管。管腔并非確認(rèn)微血管的唯一標(biāo)準(zhǔn)，凡呈現(xiàn)棕黃色單個(gè)或成群無(wú)管腔的染色細(xì)胞均作為1個(gè)微血管計(jì)數(shù)，其中血管直徑＞8倍紅細(xì)胞直徑或管腔直徑≥50 μm及肌層較厚的血管不計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法為：先在低倍視野下觀察整張切片的血管分布情況，然后選取栓塞灶內(nèi)5個(gè)微血管最豐富的區(qū)域，在400倍視野下（每個(gè)視野0.37 mm2）進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值并觀察各組大鼠微小血管密度及數(shù)量變化。

1.5.2 hs-CRP、NO和ET-1水平檢測(cè) 將大鼠心臟置于4℃冰浴下進(jìn)行勻漿，3000轉(zhuǎn)/min，離心10 min，取上清，采用Au2700全自動(dòng)生化分析儀（日本Olympus）檢測(cè)hs-CRP，采用放射免疫法檢測(cè)NO，采用硝酸還原酶法檢測(cè)心臟勻漿中的ET-1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LDS-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠微小血管密度變化 與A組和B組比較，C組和D組微小血管密度明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。同時(shí)，與C組比較，D組的血管密度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。免疫組化染色結(jié)果，A組和B組的棕黃色單個(gè)或成群無(wú)管腔的染色細(xì)胞較多且密集，C組和D組的棕黃色單個(gè)或成群無(wú)管腔的染色細(xì)胞較少且稀疏，與C組比，D組的著色細(xì)胞明顯增多（圖1）。

2.2 各組大鼠hs-CRP、NO和ET-1水平比較 與A組和B組比較，C組NO和ET-1水平明顯降低，hs-CRP水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與C組比較，D組NO和ET-1水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表2）。

表1 各組大鼠微小血管密度比較

圖1 各組大鼠心臟微小血管免疫組化染色（×400）

表2 各組大鼠hs-CRP、NO和ET-1水平比較

3 討論

對(duì)急性心肌梗死的研究發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈造影TIMI 3級(jí)的患者，35%左右心肌組織的血液供應(yīng)尚未完全恢復(fù)[7]。在PCI過(guò)程中，CME引發(fā)的心肌梗死可達(dá)35%且經(jīng)血栓回收裝置發(fā)現(xiàn)絕大部分患者均存在微小栓子[8]。CME可造成心肌組織灌注障礙，在急性期主要表現(xiàn)為低復(fù)流或無(wú)復(fù)流現(xiàn)象、微小心肌梗死或心肌梗死、心肌標(biāo)志物升高、心律失常及血流動(dòng)力學(xué)障礙等；慢性期還可發(fā)生心功能進(jìn)行性降低及心肌重塑，CME發(fā)生后慢性過(guò)程仍可出現(xiàn)心功能進(jìn)行性或持續(xù)性惡化，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)患者猝死[9,10]。

他汀類(lèi)藥物是現(xiàn)階段強(qiáng)效降脂藥物，臨床已廣泛用于冠心病的一級(jí)、二級(jí)預(yù)防和高膽固醇血癥的治療。他汀類(lèi)藥物不僅具有降脂作用，還有其他作用，很可能是獨(dú)立于降脂作用以外的對(duì)心肌功能和結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用[11]。他汀類(lèi)藥物的作用機(jī)制主要有以下幾點(diǎn)[12,13]：①抗氧化作用可發(fā)揮心肌保護(hù)作用；②心肌纖維化和肥厚是發(fā)生充血性心力衰竭和冠心病的危險(xiǎn)因素，中樞及外周血管緊張素Ⅱ水平升高。他汀類(lèi)藥物可抑制血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的心肌纖維化和心肌肥厚；③他汀類(lèi)藥物可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，保護(hù)缺血再灌注心肌。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與A組和B組比較，C組和D組微小血管密度明顯下降，同時(shí)，與C組比較，D組的血管密度增加。提示經(jīng)辛伐他汀干預(yù)后，可減少CME對(duì)心肌微小血管的破壞。

NO和ET-1均是調(diào)節(jié)心血管舒張和收縮功能的重要細(xì)胞因子，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中作用顯著。正常生理?xiàng)l件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)調(diào)整NO和ET-1的濃度保證血管正常的舒縮功能，避免斑塊的形成。病理?xiàng)l件下，血管內(nèi)皮受動(dòng)脈粥樣硬化的影響分泌的ET-1增加，但NO的合成下降[14]。與A組和B組比較，C組NO和ET-1水平明顯降低，hs-CRP水平明顯增加；與C組比較，D組NO和ET-1水平明顯增加。上述結(jié)果提示辛伐他汀主要是通過(guò)影響NO信號(hào)通路發(fā)揮血管新生的作用。

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