ADAMTS-4 在心力衰竭患者心肌中的表達及意義

姜慧敏，王夢龍，劉劍芳，葉晶，徐瑤，王震，萬軍

慢性心力衰竭（CHF）是指心臟的收縮功能和（或）舒張功能發(fā)生障礙，是大多數(shù)心臟疾病的終末階段，可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括惡性心律失常和心源性猝死。研究表明心肌重構(gòu)在心力衰竭中發(fā)揮重要作用。心肌重構(gòu)包括心肌組織結(jié)構(gòu)、電生理及代謝等方面的改變，其中心肌組織結(jié)構(gòu)改變是心肌重構(gòu)的一個重要特征，包括心肌細胞凋亡、心肌纖維化等[1]。

ADAMTS即含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶，是繼基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）后新發(fā)現(xiàn)的一類依賴Zn2+的分泌型金屬蛋白酶。通過粘附、細胞融合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白水解等作用參與一系列的病理生理過程，包括血管生成、細胞凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移、炎癥等[2,3]。有研究表明ADAMTS蛋白家族可調(diào)控多種疾病的發(fā)展，包括骨關(guān)節(jié)炎、冠心病、心肌肥厚等[4-6]。

ADAMTS-4是ADAMTS家族中的一員。研究顯示，ADAMTS-4與心血管疾病密切相關(guān)。Chen等研究發(fā)現(xiàn)血清中ADAMTS-4水平與冠心病患者病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[7]。同時，ADAMTS-4基因敲除小鼠高脂飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化明顯改善，且明顯下調(diào)血漿促炎因子的水平，提示ADAMTS-4可能通過炎癥反應(yīng)在冠狀動脈粥樣硬化中發(fā)揮作用[8]，但ADAMTS-4在心力衰竭患者中的表達及作用尚不清楚。本研究通過檢測心力衰竭患者心肌組織中ADAMTS-4的表達改變，探討心力衰竭的可能發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 心臟標(biāo)本收集 收集2012年7月～2017年3月武漢大學(xué)人民醫(yī)院終末期心力衰竭患者心臟移植后的病變心臟及配型不成功的正常供體心臟標(biāo)本，心力衰竭患者17例，納入心力衰竭組，男性12例，女性5例，年齡（46.5±9.7）歲，左室舒張末期內(nèi)徑為（67.82±9.25）mm，左室射血分?jǐn)?shù)為（27.35±6.17）%。心力衰竭診斷符合歐洲心臟病協(xié)會2012年發(fā)布的“急性與慢性心力衰竭的診斷及治療指南”中的標(biāo)準(zhǔn)[9]。配型不成功的正常供體心臟8例，納入對照組，均為男性，年齡（37.6±6.9）歲。取左室心尖部心肌組織作為檢測樣本，心臟離體后立即分離樣本，用0.9%生理鹽水沖洗后部分置于液氮中速凍，在-80℃的冰箱中保存用于蛋白及mRNA檢測，另一部分放入10%中性福爾馬林中用于病理學(xué)檢測。所有標(biāo)本的收取及處理均取得患者及其家屬的知情同意。

1.2 主要實驗器材與試劑 實時熒光定量PCR檢測儀（Roche，Light Cycler 480）、PCR擴增儀（Thermal Block）、超聲裂解儀（Misonix，XL-200）、蛋白/核酸電泳儀（北京六一生物科技有限公司，DYY-6C）、Western-blot電轉(zhuǎn)儀（Invitrogen，XCell SureLock）、轉(zhuǎn)膜槽（北京六一生物科技有限公司，DYCP-31DN）；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Roche，anti-ADAMTS-4抗體購于Abcam，anti-GAPDH抗體購于CST公司，常用試劑購于國藥公司。

1.3 方法

1.3.1 心肌組織HE染色 蘇木精-伊紅染色觀察心肌組織病理學(xué)改變，10%中性福爾馬林固定后進行石蠟包埋及切片，常規(guī)HE染色，經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明及樹脂封片等步驟后使用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3.2 天狼星紅染色 心肌組織在10%中性福爾馬林固定后進行石蠟包埋及切片，將切片置于染色盒中，天狼星紅充分染色90 min，經(jīng)脫水、二甲苯透明及封片等步驟后用光學(xué)顯微鏡拍照，紅色為心肌細胞間基質(zhì)中的膠原，計算膠原容積分?jǐn)?shù)，膠原容積分?jǐn)?shù)=膠原面積/圖像面積×100%。1.3.3 實時熒光定量PCR檢測 以Trizol法提取心肌組織總RNA，取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用羅氏Light Cycler 480 Real-time PCR儀進行相應(yīng)指標(biāo)的PCR擴增，反應(yīng)條件為：95℃10 min，95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)；72℃ 10 min。GAPDH為內(nèi)參，以2-△△CT法進行定量分析。ADAMTS-4引物序列：上游5'- ACATTCTTGTCCGGCAGCAG-3'，下游5'-GGAGGGCATCAGCGTGTATT-3'；GAPDH引物序列：上游5'-GGATTTGGTCGTATTGGGCG-3'，下游5'-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3'，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.4 蛋白印記檢測（Western-blot） 取心肌組織，加入預(yù)冷的裂解液充分研磨混勻后進行超聲裂解，離心30 min后吸取上清中的總蛋白，以BCA法測定蛋白濃度。制備電泳樣品，樣品上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜取出放置在含5%脫脂奶粉的TBS液中封閉1 h，用TBST洗膜，放入一抗中孵育，4℃過夜，洗膜，加入相應(yīng)種屬的二抗孵育1 h，洗膜后加入發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)成像，以GAPDH為內(nèi)參分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組心肌組織病理學(xué)改變 光鏡下，對照組心肌細胞形態(tài)完整，胞漿均勻致密，細胞排列整齊，可見清晰的細胞核；心力衰竭組患者心肌細胞腫大，細胞形態(tài)不規(guī)整，肌絲斷裂，細胞排列紊亂，可見畸形、增大的細胞核（圖1）。

2.2 兩組心肌纖維化程度比較 天狼星紅染色顯示，心力衰竭組患者心肌組織膠原纖維含量較對照組增多，膠原纖維增粗、排列紊亂，膠原容積分?jǐn)?shù)較對照組升高，（10.18±0.63）% vs. （2.56±0.25）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示心力衰竭患者心肌組織纖維化、心肌重構(gòu)明顯（圖2）。

2.3 兩組心肌組織ADAMTS-4 mRNA相對表達水平比較 與對照組相比，心力衰竭組患者心肌組織ADAMTS-4 mRNA相對表達水平明顯增高，（1.00±0.03） vs. （1.50±0.03），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖3）。

2.4 兩組心肌組織ADAMTS-4蛋白表達水平比較 與對照組相比，心力衰竭組患者心肌組織ADAMTS-4蛋白表達水平明顯升高，（1.00±0.06） vs. （2.01±0.09），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。

3 討論

圖1 對照組與心力衰竭組心肌組織HE染色對比（200×）

圖2 對照組與心力衰竭組心肌膠原纖維含量比較

圖3 對照組與心力衰竭組ADAMTS-4mRNA相對表達情況

圖4 對照組與心力衰竭組ADAMTS-4蛋白表達情況

心肌組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)包括心肌細胞及胞外基質(zhì)的變化，即心肌細胞凋亡、心肌纖維化等[1]，這一系列變化涉及炎癥、氧化應(yīng)激等[10,11]，而多種炎癥介質(zhì)與心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)相關(guān)，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）等[12,13]。心力衰竭的發(fā)生機制目前尚不十分明確，分析心肌重構(gòu)可為治療心力衰竭提供參考。

ADAMTS是一種含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的基質(zhì)金屬蛋白酶，能夠調(diào)控細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，研究顯示，ADAMTS的表達或功能異常與關(guān)節(jié)炎、癌癥及心血管疾病相關(guān)[14]。Liu等研究發(fā)現(xiàn)大黃素可減輕大鼠肺間質(zhì)纖維化，同時在使用大黃素后，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）表達下調(diào)，而ADAMTS-1表達上調(diào)，提示ADAMTS-1通過TGF-β1途徑參與大黃素介導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化減輕[15]。Bukong等發(fā)現(xiàn)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝臟纖維化模型中，ADAMTS-5、9、15、20的表達均上調(diào)，提示這些ADAMTS與纖維化的相關(guān)性[16]。

ADAMTS-4屬于ADAMTS家族中蛋白聚糖酶亞組，目前認為ADAMTS-4是最有活性的蛋白聚糖酶之一，對維持蛋白聚糖的合成及分解代謝起著重要的作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化模型中，ADAMTS-4的表達增加，提示ADAMTS-4可能與心肌纖維化相關(guān)[18]。Mark等通過基因表達檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化肺組織中ADAMTS-4的表達發(fā)生改變，提示ADAMTS-4與特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化相關(guān)[19]。另有研究表明巨噬細胞在TNF-α和IL-1β的刺激下合成ADAMTS-4增加[20]，而TNF-α和IL-1β被認為與心肌重構(gòu)相關(guān)，提示炎癥因子如TNF-α和IL-1β等可能通過刺激ADAMTS-4表達增加引起心肌重構(gòu)。

本研究中，心力衰竭患者心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，心臟纖維化程度明顯重于正常心臟，心肌組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)明顯，并且，ADAMTS-4的mRNA及蛋白相對表達水平均明顯高于對照組，提示ADAMTS-4可能在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。本研究僅檢測了ADAMTS-4在心力衰竭及正常供體心臟中的表達，而表達發(fā)生變化的具體機制尚不明確，有待進一步研究。

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