辛伐他汀對大鼠腎缺血再灌注損傷后心肌組織p53和caspase-3蛋白表達的影響

荊嬌，張永忠，馬海玲，閆文升，張玉清，焦宗偉

他汀類藥物是三羥基三甲基戊二酰輔酶A（HMG-COA）還原酶抑制劑。自1976年Endo等[1]于桔霉素提取液中發(fā)現(xiàn)了美伐他汀，隨后洛伐他汀等他汀類藥物相繼問世。他汀類藥物通過對該酶特異性抑制作用，使HMG-CoA不能轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢u戊酸，從而阻斷膽固醇的合成，這一作用目前在臨床上廣泛用于高血脂的治療。有研究發(fā)現(xiàn)，普伐他汀預處理可以通過抑制細胞凋亡保護腎缺血再灌損傷[2]。他汀類藥物在防治心臟疾病方面也日益重視，也有研究指出辛伐他汀可劑量依賴性地延遲因缺氧誘導的新生心肌細胞的壞死，減輕心肌初始缺血和再灌注損傷，改善心功能[3]。但他汀類藥物對腎缺血再灌后心肌組織的影響卻少有報道。我們就此進行了初步研究，通過建立腎缺血再灌注損傷模型，并用辛伐他汀干預，檢測血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）及組織丙二醛（MDA）含量，乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性以及p53和caspase-3的表達。探討辛伐他汀對腎缺血再灌后心肌的作用， 結(jié)果如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，清潔級，體重160～230 g，購自河北省實驗動物中心（合格證號DK1411015）。

1.1.2 藥品與試劑 辛伐他?。ㄅ朒20000009），杭州上虞京新藥業(yè)有限公司提供；SCr、血清BUN測試盒，購自北化康泰臨床試劑有限公司；MDA、SOD、LDH、CK試劑盒均購自南京建成生物制品公司；β-actin，p53和caspase-3購自Santa cruz biotechnology。

1.2 分組與模型建立

1.2.1 分組 將大鼠在20℃～26℃實驗室喂養(yǎng)2 d，然后隨機分成3組：①假手術(shù)組（Sham）；②腎缺血再灌注組（IR）；③辛伐他汀組（Sim）。每組各12只。完全隨機分組方法如下：先將動物按1， 2， 3， 4.......36編號，在隨機數(shù)字表中第三行第一個數(shù)16為開始數(shù)，取數(shù)取36個隨機數(shù)，將對應(yīng)的隨機數(shù)放在鼠號下面，用隨機數(shù)除以組數(shù)3，余數(shù)為1歸為假手術(shù)組，余數(shù)為2歸腎缺血再灌注組，余數(shù)為3歸為辛伐他汀組，再進行隨機分組調(diào)整完成分組。辛伐他汀組20 mg/kg/d灌胃，持續(xù)2周。假手術(shù)和缺血組每天給同量的生理鹽水灌胃，2周后復制模型。

1.2.2 模型建立 本次實驗采用河北省醫(yī)學科學院的以往方法[4]，復制腎缺血再灌注損傷模型，10%水合氯醛腹腔麻醉，剖腹手術(shù)，雙側(cè)腎動靜脈暴露。腎缺血再灌注組和辛伐他汀組夾閉雙側(cè)腎動靜脈，45 min后去除動脈夾再恢復血流灌注，然后逐層縫合腹壁。假手術(shù)組開腹但不夾閉血管，其余相同。再灌后24 h各組分別于腹主動脈取血4～5 ml，分離留取血清于冰箱中低溫保存，待測定血清Scr、BUN含量。然后摘取心臟，冰生理鹽水沖凈血液， 取左心室前壁部分組織，制備勻漿待檢測MDA含量，LDH、CK和SOD的活性及Western blot法檢測p53和caspase-3的表達水平。

1.3 檢測方法

1.3.1 心肌組織勻漿制備 制備勻漿前除去組織血液，用濾紙吸干，準確稱重。將干凈、干燥的勻漿管置于冰水混合物中，將組織塊放于勻漿管中，盡快剪碎組織，然后按1:9（W/V）加入冰生理鹽水，將組織勻漿。而后將勻漿移入干燥的試管中，置于4℃離心機中，以3000 r/min的速度離心10 min。取上清液儲存待測。

1.3.2 生化檢查 Scr、BUN、一氧化氮（NO）及MDA含量，SOD、LDH、和CK活性。各項指標檢測方法嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3.3 Western blot法檢測p53和caspase-3的表達 組織蛋白的提?。?80℃低溫冰箱保存標本，提取蛋白時取出標本稱重，每100 mg組織加入1 ml RIPA，加入10μl PMSF，組織勻漿，低溫離心15 min，10000～14000 r/min，取上清加入5×蛋白上樣buffer，煮沸5 min分裝，-70℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)取。提取蛋白后灌膠上樣，加樣后先用恒流（10 mA），再用恒壓（100 V）電泳至溴酚藍到凝膠底部。待電泳停止后，將凝膠轉(zhuǎn)移PVDF膜上，轉(zhuǎn)移電壓為100 V，時間120 min。然后將PVDF膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下?lián)u床上搖動封閉2 h。取出PVDF膜，加入稀釋后的一抗（1:1000）冰箱里4℃過夜。再用TBST室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min。然后加入1:1000稀釋的辣根酶標記羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h，用TBST室溫下脫色搖床上洗5次，每次10 min。將顯色劑滴加于晾干的PVDF膜上，顯色照相。最后用quantity one軟件對條帶進行分析。

1.4 統(tǒng)計學分析 用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀對BUN和Scr含量的影響 與假手術(shù)組比較，腎缺血再灌注組腎功能受損，BUN和Scr含量均增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與腎缺血再灌注組比較，辛伐他汀組BUN和Scr含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表1。

表1 各組血清Scr和BUN含量的比較

2.2 辛伐他汀對CK、LDH、SOD活性及MDA含量的影響 腎缺血再灌注組和辛伐他汀組LDH和CK活性均高于假手術(shù)組， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與腎缺血再灌注組比較， 辛伐他汀組LDH、CK活性降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。腎缺血再灌注組和辛伐他汀組心肌組織SOD活性均低于假手術(shù)組（P＜0.05），MDA高于假手術(shù)組（P＜0.05），均有統(tǒng)計學意義。與腎缺血再灌注組相比，辛伐他汀組SOD升高（P＜0.05），MDA減少（P＜0.05）有統(tǒng)計學意義，表2。

2.3 各組心肌p53和caspase-3蛋白的表達測定Western blot法蛋白含量檢測顯示，與假手術(shù)組組比較，腎缺血再灌注組p53和caspase-3表達均顯著增高；與腎缺血再灌注組組比較辛伐他汀組p53和caspase-3蛋白表達降低（圖1～ 2）。

3 討論

腎缺血再灌注損傷涉及多種因素，如自由基損傷、白細胞和內(nèi)皮細胞之間的作用、胞內(nèi)鈣的超載、NO等[5-7]。以往研究指出[8]，缺血缺氧可引起血管內(nèi)皮細胞的損傷和脂質(zhì)過氧化物增多，這是引起腎缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素之一。氧化應(yīng)激是機體內(nèi)氧自由基生成和去除失衡，或者由于外源性氧化劑超量攝入，導致活性氧（ROS）的積累而引起的毒性過程。在生理狀態(tài)下，機體產(chǎn)生SOD能快速清除氧自由基等，防止氧自由基的過量積累。Laude研究報道缺血再灌注期間可以產(chǎn)生的大量的氧自由基（OFR），這些過量的自由基經(jīng)過血液循環(huán)到達相應(yīng)的靶器官造成器官的損傷[9]。目前，缺血再灌注損傷的研究已不僅限于本身，遠端器官肺、腎、腦、心等也常常是受累靶器官[10]。戎浩等的研究也發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷時遠端腦組織丙二醛含量增多，超氧化物歧化酶的活性下降，腦組織在此過程中也受到了影響[11]。說明腎缺血后對遠端器官是有影響的。雖然經(jīng)過循環(huán)后的OFR濃度有所降低，但產(chǎn)生的各種損失因子也能引起相關(guān)器官的OFR相對增加，而導致器官損傷。

圖1 辛伐他汀對腎缺血再灌注后心肌p53蛋白表達的影響

圖2 辛伐他汀對腎缺血再灌注后心肌caspase-3蛋白表達的影響

表2 各組CK、LDH、SOD活性和MDA含量的比較

細胞凋亡是在一定的病理情況下，機體為維護內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，通過基因調(diào)控和酶促反應(yīng)進行的細胞程序化死亡。caspase-3是介導凋亡途徑中關(guān)鍵的啟動因子。能通過寡聚而自身切割活化，并能激活下游半胱氨酸蛋白酶，在誘發(fā)細胞凋亡及細胞增殖抑制等方面發(fā)揮著重要的作用[12,13]。有報道指出Caspase-3抑制劑對兔體外循環(huán)心肌細胞凋亡具有明顯的抑制作用，其機制與抑制凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白酶Caspase-3的活性有關(guān)[14]。張瓊等研究表明高、中劑量阿托伐他汀可減少大鼠急性缺血心肌細胞損傷，與能減少心肌細胞凋亡及抑制caspase-3 mRNA表達有關(guān)[15]。p53蛋白是廣譜的腫瘤抑制因子，在細胞生長周期中的起負調(diào)節(jié)作用，與細胞周期的調(diào)控、DNA 修復、細胞凋亡與腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移等重要生物學功能有關(guān)[16,17]。Long[18]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)乳鼠心肌細胞在缺氧48 h后可誘導心肌細胞凋亡，同時伴有p53基因表達產(chǎn)物的增加。有研究指出在心肌梗死過程中心肌細胞p53表達明顯增加，而且其表達程度與細胞凋亡增加的時相一致，表明p53可能是心肌細胞凋亡的機制之一[19]。宋顯晶通過研究阿托伐他汀對心梗后心衰大鼠心肌細胞凋亡作用發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可通過抑制細胞凋亡減輕心臟重構(gòu)，改善心功能[20]。

本實驗采取河北省醫(yī)學科學院以往的方法[4]復制腎缺血再灌注損傷模型（夾閉大鼠雙側(cè)腎動脈靜脈45 min后去夾再灌注），觀察再灌24 h后各項指標變化。結(jié)果表明，缺血再灌組腎功能明顯受損，Scr和BUN高于假手術(shù)組，動物模型復制成功。觀察缺血再灌后，心肌脂質(zhì)過氧化物丙二醛的產(chǎn)生增多，同時作為重要的抗氧化劑的超氧化物歧化酶活性顯著降低。LDH是催化乳酸和丙酮相互轉(zhuǎn)化的同工酶，屬于氫轉(zhuǎn)移酶。該酶存在于所有動物的組織中，心肌細胞LDH活性遠高于血清數(shù)百倍。CK是一個與細胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶1，2，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)，同工酶MB型主要存在于心肌細胞中，目前同時LDH、CK已作為診斷心肌疾病的有效指標， 本實驗觀察缺血再灌組LDH、CK活性增加。這說明缺血再灌后，心肌組織過氧化物產(chǎn)生過多，抗氧化劑減少，組織明顯受損。而給予辛伐他汀干預后，丙二醛含量降低，而超氧化物歧化酶活性明顯升高，LDH、CK活性減弱。這說明辛伐他汀對缺血再灌注器官心肌組織有保護作用。與假手術(shù)組比較，p53和caspase-3蛋白表達在腎缺血再灌注組增多，與缺血組相比，p53和caspase-3表達在辛伐他汀組明顯降低。這表明在腎的缺血再灌過程中，心肌組織損傷同時過量細胞凋亡也伴有發(fā)生，凋亡的大量發(fā)生與缺血再灌注時產(chǎn)生的大量自由基可能有一定關(guān)系。而辛伐他汀可清除多余氧自由基，減少心肌細胞的氧化損傷，降低p53和caspase-3表達蛋白的表達， 從而抑制細胞凋亡。

[1]Endo A,Kuroda M. Citrinin, an inhibitor of cholesterol synthesis[J].Antibiot (Tokyo),1976,29(8):841-3.

[2]金健,樸尚國,金順英,等. 普伐他汀對腎缺血再灌注損傷的保護作用及其機制的探討[J].中華腎臟病雜志,2014,30(3):138-44.

[3]Gheorghiade M,Klein L,Stone NJ,et al. Improvement in the function of hibernating myocardium in a patient with heart failure due to coronary artery disease receiving high dose simvastatin[J]. Ital Heart J,2004;5(2):160-2.

[4]謝怡華,夏曉紅. 辛伐他汀及缺血后處理對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究[J]. 中國病理生理雜志,2016,32(8):77.

[5]仝飛,夏曉紅. 短暫反復缺血預處理對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究[D]. 河北醫(yī)科大學,2011.

[6]張世卿,茍欣. 腎缺血再灌注損傷細胞凋亡的分子生物學研究[J].國外醫(yī)學. 泌尿系統(tǒng)分冊,2005(2):59-62.

[7]張艷華,李丹,陳少杰,等. P38MAPK、JNK在大鼠腎缺血再灌注損傷模型中的表達[J]. 中國急救醫(yī)學,2011,31(3):227-32.

[8]Yi SH. L-arginine and research progress of cardiovascular disease[J].Cardiovascular epidemiology,2000,21(4):234-6.

[9]Laude K,Favre J,Thuillez C,et al. NO produced by endothelial NO synthase is a mediator of delayed preconditioning-induced endothelial protection[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,284(6):2053-60.

[10]MAGDI MIY,DENIS WH,AIRES AB,et al. Lower limb ischemiareperfusion injury triggers a systemic inflammatory response and multiple organ dysfunction[J].World J Surg,2002,26(1):115-21.

[11]戎浩,夏曉紅. 褪黑素對腎缺血再灌注損傷大鼠腦組織氧自由基和細胞凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志,2015,10 (6):148.

[12]趙雅瑞,張立凡. 姜黃素上調(diào)caspase-3和p53表達后對人肺癌干細胞增殖與侵襲的影響[J]. 中國臨床醫(yī)學,2013,20(3):259-62.

[13]毛德文,陳月橋. Caspase-8及Caspase-3與細胞凋亡[A]. 第十八次全國中西醫(yī)結(jié)合肝病學術(shù)會議論文匯編,2009.

[14]姜明,曹士奇,陳鎖成,等. Caspase-3抑制劑對兔體外循環(huán)心肌細胞凋亡的影響[J]. 江蘇大學學報,2007,17(3):205-8.

[15]張瓊,陳書艷. 阿托伐他汀對大鼠心肌急性缺血細胞凋亡及caspase-3基因表達影響[J]. 實用診斷與治療雜志,2010,(10):965-7.

[16]Shadfan M,Lopez-Pajares V,Yuan ZM. MDM2 and MDMX: Alone and together in regulation of p53[J]. Transl Cancer Res,2012,1(2):88-9．

[17]Inoue K,Kurabayashi A,Shuin T,et al. Overexpression of p53 protein in human tumors[J]. Med Mol Morphol,2012,45(3):115-23．

[18]Long X,Blluyt MO,Ilipoito ML,et al. p53 and the hypoxia-induced apoptosis of cultured neonatal rat cardiac myocytes. J Clin Invest,1997,99(11):2635-43.

[19]尹瑞興,蔡捷,李佳荃,等. 急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達的研究. 中華老年心腦血管病雜志,2004,6(1):37-40.

[20]宋顯晶. 阿托伐他汀抑制心梗后心衰大鼠心肌細胞凋亡作用機制的研究[D]. 吉林大學,2011.