丹曲膠囊抗心肌缺血再灌注損傷的線粒體保護(hù)機(jī)制

田心 徐攀 劉超峰

[摘要] 目的 探討丹曲膠囊對(duì)心肌缺血再灌注損傷的線粒體保護(hù)機(jī)制。 方法 將健康雄性SD大鼠30只按隨機(jī)數(shù)字表法分為五組，每組6只，分別為假手術(shù)組、模型組、丹曲膠囊300 mg/kg組、丹曲膠囊600 mg/kg組、單硝酸異山梨酯組（10 mg/kg）。采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎的方法造模，分別記錄缺血/再灌注不同時(shí)間點(diǎn)ST段變化，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物[心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）]水平，并用透射電鏡觀察心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)，用免疫印跡法測(cè)定線粒體分裂蛋白p-Drp1以及融合蛋白Mfn2的表達(dá)。 結(jié)果 丹曲膠囊300、600 mg/kg組均能夠降低心肌損傷標(biāo)志物水平（P < 0.01），明顯緩解心電圖ST段上抬（P < 0.01），并能夠減輕心肌細(xì)胞線粒體分裂，使線粒體分裂蛋白p-Drp1的表達(dá)減少（P < 0.01），而線粒體融合蛋白Mfn2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 丹曲膠囊能夠減輕心肌缺血/再灌注損傷，改善心肌缺血狀態(tài)，減少心肌細(xì)胞線粒體的分裂，可能與其抑制線粒體分裂蛋白p-Drp1的表達(dá)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 丹曲膠囊;心肌缺血/再灌注損傷;線粒體;保護(hù)機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R542.2;R285.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2018）12（c）-0016-04

[Abstract] Objective To explore the mitochondrial protective mechanism of Danqu Capsules on myocardial ischemia /reperfusion injury. Methods Thirty healthy male SD rats were divided into 5 groups by random number table method （n = 6）： sham operation group， model group， 300 mg/kg of Danqu Capsules group， 600 mg/kg of Danqu Capsules group， and Isosorbide Mononitrate group （10 mg/kg）. The method of ligation of the left anterior descending branch of coronary artery was used to make model， and the changes of ST segment at different time points of ischemia / reperfusion were recorded. The levels of myocardial injury markers [cardiac troponin T （cTnT）， creatine kinase isoenzyme （CK-MB）] were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method. The ultrastructure of myocardial mitochondria was observed with transmission electron microscope， and the expression of mitochondrial fission protein p-Drp1 and fussion protein Mfn2 was measured by immunoblotting. Results 300， 600 mg/kg of Danqu Capsules groups could reduce the levels of myocardial injury markers （P < 0.01）， relieve the ST segment elevating of ECG （P < 0.01）， reduce mitochondrial fission of myocardial cells and lessen the expression of mitochondrial protein p-Drp1 （P < 0.01）， but there was no significant difference in the expression of mitochondrial fusion protein Mfn2 （P > 0.05）. Conclusion Danqu Capsules can alleviate myocardial ischemia / reperfusion injury， improve myocardial ischemia and reduce mitochondrial fission of myocardial cells， which may be related to the inhibition of the expression of mitochondrial fission protein p-Drp1.

[Key words] Danqu Capsules; Myocardial ischemia / reperfusion injury; Mitochondria; Protective mechanism

心血管疾病已經(jīng)成為世界公認(rèn)的健康殺手，而冠脈病變的治療予以行冠狀支架植入術(shù)后，存在著心肌缺血/再灌注（MI/R）損傷，由此造成許多心血管癥狀，引發(fā)一系列心血管事件。中醫(yī)藥治療MI/R損傷有著很大的優(yōu)勢(shì)，天然植物藥材的選擇以及相對(duì)較小的毒副作用是主要原因。丹曲膠囊是陜西省中醫(yī)醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）心病科研發(fā)的院內(nèi)制劑，已應(yīng)用于臨床。本研究用MI/R損傷動(dòng)物模型，從線粒體形態(tài)和功能角度探討丹曲膠囊改善MI/R損傷的藥效學(xué)機(jī)制，為丹曲膠囊的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 ?成年健康雄性SD大鼠30只，1.5～2月齡，體重250～300 g，SPF級(jí)飼養(yǎng)條件，飼養(yǎng)條件為恒溫（25±2）℃，相對(duì)濕度（60±10）%，每日光照12 h，飼養(yǎng)期間大鼠自由攝食、飲水。大鼠均購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（軍）字第2007-007號(hào)。

1.1.2 藥物及試劑 ?丹曲膠囊購(gòu)自我院（規(guī)格：0.3 g×45粒，批號(hào)：20170601）;單硝酸異山梨酯緩釋片（山東齊都藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：60 mg×14片，批號(hào)：1D1712011）;兔抗p-Drp1（#4494）購(gòu)自美國(guó)CST公司;兔抗Drp1（ab184247）、Mfn2（ab101055）、GAPDH（ab181603）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司（批號(hào)分別為E30062、E30024）。

1.1.3 儀器設(shè)備 ?酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devises公司）;多道生理記錄儀及分析處理軟件（RM-6280）（成都儀器廠）;透射電鏡（日本JEOL公司）;電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模 ?各組大鼠術(shù)前禁食12 h，不限制飲水，測(cè)體重后予以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（1.5 mL/kg），仰臥位固定，予以氣管插管，微型動(dòng)物呼吸機(jī)通氣，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電活動(dòng)，于胸骨左側(cè)4～5肋開(kāi)胸，暴露心臟后于左心耳下緣處穿線（6/0絲線），結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，以直徑約0.2 cm塑料管穿過(guò)結(jié)扎線，以心電ST段明顯抬高并與T波融合作為心肌缺血標(biāo)志。缺血/再灌注時(shí)間：缺血30 min，再灌注3 h。

1.2.2 分組及給藥 ?將30只大鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（MI/R組）、丹曲膠囊300 mg/kg組（DQ300組）、丹曲膠囊600 mg/kg組（DQ600組）、單硝酸異山梨酯組（ISMN組，10 mg/kg），共五組（n = 6）。所有藥物劑量依據(jù)人與大鼠體表面積換算，ISMN依據(jù)成人用量60 mg/d進(jìn)行換算。Sham組與MI/R組給予同等劑量的生理鹽水。手術(shù)處理前灌胃2周，術(shù)前6 h進(jìn)行末次給藥。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 心肌損傷標(biāo)志物cTnT、CK-MB的檢測(cè) ?于再灌注3 h后，取主動(dòng)脈血5 mL，室溫靜置1 h，3000 r/min離心15 min（離心半徑為16 cm），留取血清，-20℃凍存。按照使用說(shuō)明書(shū)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清cTnT、CK-MB活性。

1.3.2 心電圖檢測(cè) ?分別在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)（結(jié)扎冠脈前，結(jié)扎后0.5 h，再灌注1、2、3 h）記錄心電圖，觀察Ⅱ?qū)?lián)ST段變化，以游標(biāo)卡尺記錄ST段高度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[1]。

1.3.3 透射電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體形態(tài) ?術(shù)后取出心臟，擠壓出殘留血液并進(jìn)行漂洗。剪裁結(jié)扎部位旁約2 mm×2 mm長(zhǎng)條心肌3塊（缺血區(qū)域），于2.5%戊二醛固定2 h，PBS漂洗后，放置于1%鋨酸固定2 h，接著用PBS漂洗，梯度乙醇脫水處理、浸透，環(huán)氧樹(shù)脂包埋處理。超薄切片機(jī)切割后經(jīng)鈾鉛等染色處理，置于透射電鏡下進(jìn)行觀察心肌線粒體排列分布、大小改變以及結(jié)構(gòu)變化[2]。

1.3.4 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)p-Drp1、Drp1、Mfn2水平 ?留取結(jié)扎部位旁心肌組織，以組織裂解液加蛋白磷酸酶抑制劑提取蛋白，然后蛋白定量，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，快速封閉液封閉5 min后，于1∶1000稀釋后的抗p-Drp1、Drp1、Mfn2抗體中孵育4℃過(guò)夜，常規(guī)漂洗后，以二抗室溫孵育1 h后洗膜（5 min，5次），曝光顯影用Quantity One軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，方差齊采用LSD法，方差不齊用Dunnett′s-T3法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹曲膠囊對(duì)MI/R大鼠血清cTnT、CK-MB水平的影響

與Sham組比較，MI/R組大鼠血清cTnT、CK-MB水平明顯升高（P < 0.01）;與MI/R組比較，DQ300組、DQ600組、ISMN組均能夠降低血清中cTnT、CK-MB的表達(dá)（P < 0.01）;與DQ300組比較，DQ600組的cTnT水平降低（P < 0.01），ISMN組的cTnT、CK-MB水平明顯下降（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 丹曲膠囊對(duì)MI/R損傷大鼠心電圖ST段的影響

與Sham組比較，MI/R組于缺血0.5 h和再灌注1、2、3 h的心電圖ST段上抬明顯（P < 0.01）;與MI/R組比較，DQ300組、DQ600組、ISMN組均能夠降低心電圖ST段上抬，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;與DQ300組比較，ISMN組能夠明顯降低心電圖ST段上抬，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 丹曲膠囊對(duì)MI/R損傷大鼠心肌線粒體形態(tài)的影響

Sham組心肌細(xì)胞線粒體排列整齊，未見(jiàn)明顯異常;MI/R組大鼠心肌細(xì)胞線粒體變性明顯，呈碎片狀分布;DQ600組以及DQ300組線粒體變性減少，碎片化程度下降，此形態(tài)改變與ISMN組相似。見(jiàn)圖1。

2.4 丹曲膠囊對(duì)MI/R損傷Drp1磷酸化水平、Mfn2表達(dá)水平的影響

與Sham組比較，MI/R組大鼠心肌的Drp1磷酸化水平升高（P < 0.01）;與MI/R組比較，DQ600組、ISMN組均能夠降低Drp1的磷酸化水平（P < 0.01），DQ300組與MI/R組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;與DQ300組比較，ISMN組能夠明顯降低Drp1的磷酸化水平（P < 0.05）;各組Mfn2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖2、表3。

3 討論

對(duì)于急性心肌梗死，及時(shí)地進(jìn)行冠狀動(dòng)脈介入術(shù)或者進(jìn)行溶栓治療是有效開(kāi)通罪犯血管的治療手段。然而，心肌在缺血后血管再通形成新的平衡會(huì)導(dǎo)致再灌注損傷，此種類別的損傷較開(kāi)通血管前更為嚴(yán)重[4-5]。在MI/R期間，心肌細(xì)胞線粒體的功能十分重要，從有氧代謝進(jìn)入無(wú)氧代謝，然后又轉(zhuǎn)復(fù)為有氧代謝，這一過(guò)程中必然伴隨著糖酵解，酸性產(chǎn)物堆積，ATP產(chǎn)能的減少，以及相應(yīng)的線粒體膜通透孔開(kāi)放增加，從而損傷超微結(jié)構(gòu)[6-7]。近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)線粒體的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了詳細(xì)的研究，發(fā)現(xiàn)線粒體的動(dòng)力學(xué)方式主要是融合和分裂[8]，線粒體功能及其融合分裂動(dòng)態(tài)平衡在心血管保護(hù)中十分關(guān)鍵[9-10]。在線粒體動(dòng)力學(xué)的融合分裂中，起主導(dǎo)作用的是線粒體分裂蛋白Drp1以及融合蛋白Mfn2[11-13]。

我們前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)[14]，丹曲膠囊對(duì)冠心病心絞痛具有顯著的改善作用，臨床應(yīng)用于冠心病心絞痛的患者大多效果良好，能夠改善患者的癥狀，降低炎性指標(biāo)超敏C反應(yīng)蛋白以及同型半胱氨酸的表達(dá)。丹曲膠囊主要有丹參、紅曲、銀杏葉、三七等中藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參素對(duì)MI/R具有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)激活PI3K/Akt和ERK1/2信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，丹參酮ⅡA 亦可以抑制MI/R損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[15-16];紅曲含有天然他汀類成分，能夠有效地降低血脂，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[17];銀杏苦內(nèi)酯可選擇性地抵抗血小板活化因子[18];三七總皂苷具有明顯改善MI/R損傷的作用，主要通過(guò)抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)能量代謝、抑制細(xì)胞凋亡等途徑保護(hù)心肌[19]。

基于該復(fù)方中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，本研究應(yīng)用基礎(chǔ)的ELISA以及心電圖測(cè)定指標(biāo)，并以透射電鏡以及免疫印跡法闡述丹曲膠囊的抗MI/R損傷的線粒體保護(hù)機(jī)制。目前普遍的共識(shí)認(rèn)為，心肌特異性損傷標(biāo)志物加上心電圖動(dòng)態(tài)改變情況可以較為準(zhǔn)確地診斷心肌梗死[20]。本研究結(jié)果顯示丹曲膠囊能減輕模型大鼠MI/R的心肌損傷標(biāo)志物水平（cTnT、CK-MB），在MI/R過(guò)程中有效減輕心電圖ST段上抬，使心肌缺血程度減輕，提示丹曲膠囊能夠減輕MI/R損傷。

本研究結(jié)果顯示，丹曲膠囊能減少M(fèi)I/R損傷細(xì)胞線粒體的分裂，使線粒體分裂蛋白Drp1的磷酸化水平下降，抑制了Drp1的活性，而其對(duì)線粒體融合蛋白Mfn2的表達(dá)無(wú)顯著影響，提示在丹曲膠囊抗MI/R損傷的過(guò)程中，減少線粒體分裂與調(diào)節(jié)分裂蛋白Drp1的作用相關(guān)聯(lián)，與調(diào)節(jié)融合蛋白Mfn2的作用無(wú)關(guān)。然而，是否存在其他的融合機(jī)制參與其中尚待進(jìn)一步探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1] ?胡滿燕，吳珍妮，龍子江，等.欣怡膠囊對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后炎癥及氧化應(yīng)激的影響[J].中成藥，2016， 38（2）：406-409.

[2] ?田心，王淵博.丹紅注射液激活A(yù)MPK保護(hù)心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2017， 26（12）：2083-2138.

[3] ?田心，王淵博，馮嘉豪，等.紅景天苷對(duì)乳鼠缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞及線粒體損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2017， 26（10）：1714-1717.

[4] ?謝倩倩，張俊峰.再灌注治療中缺血心肌的保護(hù)策略[J].醫(yī)學(xué)綜述，2014，20（4）：584-587.

[5] ?國(guó)科，劉達(dá)興，容松.心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制及其防治策略[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（29）：37-40.

[6] ?丁士驁，梅舉.線粒體與心肌缺血/再灌注損傷的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2016，22（1）：37-41.

[7] ?向仕釗，張萌，江波.線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔對(duì)缺血/再灌注損傷心肌細(xì)胞的影響[J].中國(guó)分子心臟病學(xué)雜志，2016，16（6）：1940-1944.

[8] ?Ishihara N，Nomura M，Jofuku A，et al. Mitochondrial fission factor Drp1 is essential for embryonic development and synapse formation in mice [J]. Nat Cell Biol，2009，11（8）：958-966.

[9] ?Chen Z，Jin Z，Xia Y，et al. The protective effect of lipid emulsion in preventing bupivacaine-induced mitochondrial injury and apoptosis of H9C2 cardiomyocytes [J]. Drug Delivery，2017，24（1）：430-436.

[10] ?Leboucher GP，Tsai YC，Yang M，et al. Stress-induced phosphorylation and proteasomal degradation of mitofusin 2 facilitates mitochondrial fragmentation and apoptosis [J]. Mol Cell，2012，47（4）：547-557.

[11] ?陳慧娟，劉金東.線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白Drp1與心肌缺血再灌注損傷機(jī)制的研究進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2016， 47（5）：369-374.

[12] ?陶婷，張榮.線粒體融合蛋白2在心血管疾病方面的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2017，33（7）：668-672.

[13] ?Ong SB，Subrayan S，Lim SY，et al. Inhibiting mitochondrial fission protects the heart against ischemia/reperfusion injury [J]. Circulation，2010，121（18）：2012-2022.

[14] ?范虹，安靜，劉超峰，等.丹曲方治療冠心病心絞痛痰瘀毒互結(jié)證療效觀察[J].陜西中醫(yī)，2014，35（8）：973-975.

[15] ?Yin Y，Guan Y，Duan J，et al. Cardioprotective effect of Danshensu against myocardial ischemia/reperfusion injury and inhibits apoptosis of H9c2 cardiomyocytes via Akt and ERK1/2 phosphorylation [J]. Eur J Pharmacol，2013，699（1/2/3）：219-226.

[16] ?湯世民，吳詠梅，周雨亭，等.丹參酮ⅡA對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激的保護(hù)作用[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，14（4）：8-11.

[17] ?殷夢(mèng)梅，葉暉，張學(xué)智.紅曲單藥及復(fù)方制劑治療高脂血癥的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2017，23（2）：344-347.

[18] ?龐會(huì)心.活血化瘀中藥配合紅曲對(duì)心腦血管疾病的作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管病雜志，2016，4（15）：137-138.

[19] ?張毅，戴勝云，徐冰，等.三七總皂苷抗心肌缺血再灌注損傷的藥理研究進(jìn)展[J].江蘇中醫(yī)藥，2017，49（1）：82-85.

[20] ?陳可冀，張敏州，霍勇，等.急性心肌梗死中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34（4）：389-395.

（收稿日期：2018-06-19 ?本文編輯：張瑜杰）