通竅散瘀滴鼻液與微乳刺激性及其中藥效成分葛根素大鼠在體鼻循環(huán)吸收比較研究*

賈 山，張紫薇，孫如煜，鄭夢(mèng)成，楊 冰，杜守穎，陸 洋，白 潔，李鵬躍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

通竅散瘀方是王永炎院士的臨床經(jīng)驗(yàn)方，用于治療急性期腦中風(fēng)，療效確切。與注射給藥相比，鼻腔給藥具有顯著的腦靶向性[1-5]，同時(shí)鼻腔給藥還具有較高的生物利用度[6]。方中主要藥效成分有葛根素、芍藥苷和薄荷腦，分別是難溶性、水溶性、脂溶性的[7-10]。微乳具有載藥量高、刺激性小的特點(diǎn)，前期實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究出通竅散瘀微乳的制備工藝。本課題擬比較通竅散瘀微乳與通竅散瘀滴鼻液對(duì)大鼠鼻黏膜的刺激性。采用體積校正法[11]，利用大鼠在體鼻循環(huán)灌流模型考察通竅散瘀滴鼻液與通竅散瘀微乳中有效成分葛根素的鼻腔吸收變化[12-13]，為通竅散瘀鼻腔給藥制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

TK-20B智能透皮試驗(yàn)儀（上海皆凱科技貿(mào)易有限公司）；SartoriusBT125D電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BT100－2J電子蠕動(dòng)泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；SPD-M20A島津高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器）。實(shí)驗(yàn)室自制通竅散瘀微乳（通過滴水法繪制偽三元相圖制備通竅散瘀微乳，微乳粒徑為17.86 nm，Zeta電位為-4.90 mV，含葛根素70.0 mg/mL，含芍藥苷28.0 mg/mL，含薄荷腦35.0 mg/mL）；實(shí)驗(yàn)室自制通竅散瘀滴鼻液（含葛根素70.0 mg/mL，含芍藥苷28.0 mg/mL，含薄荷腦35.0 mg/mL）；葛根素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110752201514），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.5%；1，2-丙二醇（批號(hào)：20140821，北京化工廠）；去氧膽酸鈉（北京索萊寶科技有限公司）；聚氧乙烯-35-蓖麻油（北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司）；肉豆蔻酸異丙酯（上海麥克林生化科技有限公司）；氯化鈉（北京化工廠）；乙酸（色譜純，F(xiàn)isher公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Merck公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)）；其他試劑均為分析純。

蟾蜍（雌雄兼用，50 g左右，由北京金牧羊?qū)嶒?yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供）；SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（240～260）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證編號(hào)SCXK（京）2016-0011。

2 方法和結(jié)果

2.1通竅散瘀滴鼻液和微乳的纖毛毒性考察

2.1.1生理鹽水的配制 稱取Nacl4.5g，加水500mL，配制成0.9%濃度的生理鹽水溶液，備用。

2.1.2去氧膽酸鈉溶液的配制 稱取去氧膽酸鈉0.15 g，加水 10 mL，配制成 1.5%（w/v）的去氧膽酸鈉溶液，備用。

2.1.3通竅散瘀滴鼻液和微乳的纖毛毒性考察實(shí)驗(yàn) 將15只蟾蜍隨機(jī)分為5組，即生理鹽水組、通竅散瘀微乳組、陽性組(1.5%去氧膽酸鈉組)、空白微乳組、通竅散瘀滴鼻液組，將蟾蜍仰臥固定，于上顎黏膜處滴加0.5 mL藥物，使藥液完全浸沒上顎，接觸30 min后，用生理鹽水洗凈雜物，分離蟾蜍兩眼之間的黏膜，面積為3 mm×3 mm，用生理鹽水洗凈，黏膜面向上，平鋪于載玻片上，于黏膜表面滴加少許生理鹽水，蓋上蓋玻片，于10×40倍顯微鏡下觀察黏膜纖毛的擺動(dòng)情況，隨后置于加有少量蒸餾水的層析缸中，密閉，使水蒸氣呈近飽和狀態(tài)，環(huán)境溫度25℃。每隔30 min取出標(biāo)本，陽性組每隔15 min取出，置顯微鏡下觀察，如纖毛繼續(xù)擺動(dòng)則放回層析缸中，直至纖毛擺動(dòng)停止，記錄從給藥開始至纖毛擺動(dòng)停止所持續(xù)的時(shí)間（纖毛擺動(dòng)時(shí)間），并計(jì)算各給藥組纖毛運(yùn)動(dòng)時(shí)間的相對(duì)百分率，結(jié)果見表1。

表1 纖毛運(yùn)動(dòng)時(shí)間表（n=3）

2.2統(tǒng)計(jì)方法 用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行2組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。

2.3葛根素大鼠在體鼻循環(huán)吸收研究

2.3.1葛根素含量測(cè)定方法學(xué)專屬性考察 結(jié)果說明，在該條件下，陰性樣品對(duì)葛根素的測(cè)定沒有影響。

2.3.2色譜條件 色譜柱：DIKMA Platisil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-1%乙酸水（37∶63）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。

圖1 葛根素對(duì)照品及樣品圖

2.3.3線性關(guān)系考察 精密稱取葛根素對(duì)照品4.01 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并配制成每1mL含180.4 μg的溶液，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL，至10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì) 量濃度 分 別 為 180.4、90.02、36.08、18.04、9.02、3.608、1.804 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。在選定的色譜條件下，測(cè)定葛根素的峰面積，以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=83 830.055 3C+33 500.498 3，r=0.999 9，葛根素在（1.804～180.4）μg/mL，與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.4精密度考察 精密吸取4號(hào)對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.22%，表明儀器的精密度良好。

2.3.5穩(wěn)定性考察 以生理鹽水為循環(huán)液，將蠕動(dòng)泵進(jìn)液口接一根聚乙烯管，插入盛有50 mL生理鹽水的燒杯中，蠕動(dòng)泵出液口連接進(jìn)入大鼠鼻腔的聚乙烯管，開啟蠕動(dòng)泵使生理鹽水通過鼻腔，速度2.5 mL/min，循環(huán)2 h后，得大鼠鼻腔分泌液。以鼻腔分泌液將通竅散瘀微乳和通竅散瘀滴鼻液分別稀釋100倍，并置于37℃水浴中，孵育振蕩，分別于0、2、4、6 h取樣，測(cè)定葛根素的含量。結(jié)果顯示，在前6 h里，通竅散瘀滴鼻液中葛根素的RSD值為1.09%，在通竅散瘀微乳中葛根素的RSD值為2.45%，表明葛根素在大鼠鼻腔分泌液中6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6蠕動(dòng)泵管路對(duì)藥物物理吸附的考察 考察循環(huán)裝置對(duì)藥物物理吸附作用，將用生理鹽水稀釋50倍的通竅散瘀微乳和滴鼻液分別放置在10 mL置于量筒中，37℃恒溫水浴，蠕動(dòng)泵硅膠管插入藥液中，于體外空循環(huán)，在 0、15、30、60、90、120、300、360 min取樣，測(cè)定葛根素的質(zhì)量，微乳RSD值為1.63%，滴鼻液RSD值為1.36%。說明6 h內(nèi)，葛根素在循環(huán)管路中基本不吸附。

2.3.7大鼠鼻腔循環(huán)灌流實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物模型的準(zhǔn)備：體質(zhì)量（240～260）g，SD 雄性大鼠，飼養(yǎng) 2 d，待其充分適應(yīng)環(huán)境后，正常飲水，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉（4.8 mL/kg），仰臥固定于鼠板上，于頸部切口暴露氣管和食管。取聚乙烯管2支，一支向大鼠下端插入氣管，另一支的一端向大鼠上端插入食管，直至鼻腔后端。用膠黏劑將鼻腔與口腔的鼻顎通道封閉，蠕動(dòng)泵另一端插入裝有藥液的5 mL量筒底部，啟動(dòng)蠕動(dòng)泵使藥液循環(huán)。循環(huán)液體積流量設(shè)為2.5 mL/min。首先以生理鹽水10 mL循環(huán)10 min，測(cè)定循環(huán)前后的生理鹽水體積，體積變化為0.05 mL，說明整個(gè)環(huán)路密封性良好，無漏液情況。排盡生理鹽水后，藥液循環(huán)1min，使藥液充滿管路。取藥液5 mL置量筒中，以一小玻璃漏斗與大鼠鼻部緊密貼合，漏斗下接量筒，保證藥液經(jīng)大鼠鼻腔流出后直接經(jīng)漏斗進(jìn)入量筒中。開啟蠕動(dòng)泵使藥液經(jīng)過蠕動(dòng)泵灌流，待大鼠鼻中藥液滴出時(shí)開始計(jì)時(shí)，設(shè)為 0 min，分別在灌流后的 0、15、30、45、60、90、120 min，讀取量筒中剩余藥液體積Vn后取樣0.25 mL，補(bǔ)加循環(huán)藥液0.25 mL，以高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定各時(shí)間剩余藥物濃度Cn。其中循環(huán)死體積為VD=5-V0，剩余藥量Qn的計(jì)算方法（體積校正法）為：

式中Qn為第n個(gè)時(shí)間點(diǎn)的剩余藥量（μg），（Vn+VD）為第n個(gè)時(shí)間點(diǎn)循環(huán)液的實(shí)際體積（mL），Cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度（mg/L），Cx為補(bǔ)加的循環(huán)藥液 (母液)的質(zhì)量濃度（mg/L），0.25代表取樣0.25 mL。通過不同時(shí)間的剩余藥量Qn，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)剩余藥量百分率X，取對(duì)數(shù)后與相應(yīng)時(shí)間t進(jìn)行回歸，回歸直線的斜率即為吸收速度常數(shù)K，K的大小可反映藥物的鼻腔吸收情況。X=Q/Q0，lnX=-Kt，文獻(xiàn)報(bào)道鼻循環(huán)灌流過程中鼻腔對(duì)水分的分泌和重吸收可忽略不計(jì)，但根據(jù)實(shí)驗(yàn)中的實(shí)際情況，大鼠在2 h左右一般會(huì)吸收1 mL左右的吸收液，溶液體積的變化對(duì)藥物吸收量的計(jì)算影響極大，經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)確定以體積法計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的Qn。將已知濃度的通竅散瘀滴鼻液和已知濃度的通竅散瘀微乳用生理鹽水稀釋50倍后，按上述方法進(jìn)行大鼠鼻腔循環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1通竅散瘀滴鼻液和微乳的纖毛毒性考察 通竅散瘀微乳組、通竅散瘀滴鼻液組與生理鹽水組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），通竅散瘀微乳組、通竅散瘀滴鼻液組與去氧膽酸鈉溶液組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05=，說明通竅散瘀方做成制劑后有一定毒性與刺激性，但刺激性比去氧膽酸鈉溶液組小。通竅散瘀微乳組與空白微乳組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。另外通竅散瘀微乳組與通竅散瘀滴鼻液組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），通竅散瘀微乳組刺激性小于通竅散瘀滴鼻液組。結(jié)果見表1。

3.2葛根素大鼠在體鼻循環(huán)吸收研究 通竅散瘀滴鼻液組與通竅散瘀微乳組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），通竅散瘀滴鼻液的吸收速率大于通竅散瘀微乳。結(jié)果見表2、3，圖2。

表2 葛根素大鼠在體鼻循環(huán)吸收率比較研究（n=5）

表3 葛根素大鼠在體鼻循環(huán)吸收速率常數(shù)比較（±s，n=5)×10-3/min

表3 葛根素大鼠在體鼻循環(huán)吸收速率常數(shù)比較（±s，n=5)×10-3/min

注：與通竅散微乳比較，*P＜0.05。

組別 吸收速率常數(shù)通竅散瘀微乳組 2.73±0.29通竅散瘀滴鼻液組 3.66±0.25*

圖2 葛根素在體鼻循環(huán)吸收（-lnx）-t圖

4 討論

鼻用制劑需要滿足載藥量高和刺激性小兩大要求。而刺激性可能來自藥物有效成分和微乳基質(zhì)。所以在設(shè)計(jì)刺激性實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，設(shè)計(jì)空白微乳組[14]。通過研究發(fā)現(xiàn)，空白微乳組和載藥微乳組都有刺激性，并且沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故猜測(cè)是藥物基質(zhì)產(chǎn)生了刺激性。通竅散瘀方里的主要藥效成分葛根素、芍藥苷、薄荷腦，分別是難溶性、水溶性和脂溶性。常用的滴鼻液難以達(dá)到較高的載藥量。本實(shí)驗(yàn)制備的微乳載藥量高，滿足臨床上患者對(duì)于藥物的需求。

通竅散瘀微乳是將薄荷、白芍、葛根分離提取得到的有效成分，薄荷腦、芍藥苷、葛根素，以聚氧乙烯-35-蓖麻油作為乳化劑，1，2-丙二醇作為助乳化劑，IPM作為油相，通過磁力攪拌的方法制得的，制得微乳粒徑為17.86 nm，Zeta電位為-4.90 mV，含葛根素70.0 mg/mL，含芍藥苷28.0 mg/mL，含薄荷腦35.0 mg/mL。通竅散瘀滴鼻液與微乳載藥量相同，其中薄荷腦中加入與微乳中相同量的IPM，以溶解薄荷腦。滴鼻液中含有與微乳中相同濃度的薄荷腦、芍藥苷、葛根素。

本研究結(jié)果表明，通竅散瘀微乳比通竅散瘀滴鼻液的刺激性小，可能是因?yàn)榉街写碳ば运幬锉『赡X被O/W型微乳包裹在油相里，存在在微乳的內(nèi)核中。沒有直接和蟾蜍的上顎皮膚接觸，從而減小了刺激性。文獻(xiàn)里也有報(bào)導(dǎo)揮發(fā)性藥物會(huì)刺激黏膜，并且促進(jìn)黏膜的吸收的相關(guān)研究[15]。

本實(shí)驗(yàn)采用體積校正法，通過大鼠在體鼻循環(huán)灌流方法研究通竅散瘀微乳和通竅散瘀滴鼻液的吸收速率。使用體積校正法是發(fā)現(xiàn)在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠在2 h的實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)吸收1～1.5 mL的液體。所以采用體積校正法會(huì)更準(zhǔn)確。在鼻腔灌流的實(shí)驗(yàn)中，通竅散瘀滴鼻液吸收速率比通竅散瘀微乳吸收快，可能是因?yàn)橥ǜ[散瘀滴鼻液在一定程度上損傷了鼻黏膜，加快了葛根素的吸收。也有可能是因?yàn)楸『赡X對(duì)葛根素和芍藥苷的吸收起到了促進(jìn)作用[16-19]。

雖然葛根素在微乳中的吸收速率比滴鼻液中小，但是通竅散瘀微乳的刺激性比滴鼻液中小很多，而且載藥量大。因此此部分的研究對(duì)通竅散瘀鼻用制劑的開發(fā)有一定的意義。另外還需進(jìn)一步對(duì)方中其他有效成分(芍藥苷及薄荷腦)進(jìn)行鼻腔吸收研究。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，循環(huán)管路可能會(huì)吸附非極性的成分[20],如果薄荷腦對(duì)管路有吸附也可以考慮改進(jìn)循環(huán)裝置進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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