杞黃顆粒對實驗性脈絡膜新生血管VEGF蛋白及其mRNA表達的影響*

全 穎 ，梁鳳鳴，王 莉 ，王 燕 ，黎紅梅，關玉雙 ，王瑩瑩

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193 2.廣東省中醫(yī)院，廣東 510000）

脈絡膜新生血管（CNV）是濕性老年性黃斑變性（WAMD）區(qū)別干性老年性黃斑變性的主要特征，其發(fā)生是由于脈絡膜的病理性增殖血管突破Bruch膜，長到視網膜色素上皮（RPE）或視網膜神經上皮層下，造成視網膜的滲出、出血甚至瘢痕，導致視力下降、視物變形、視野缺損等[1]。研究顯示，VEGF是公認最強的促血管生成因子[2]。抗VEGF藥物治療CNV已成為時下最快速有效的治療手段之一[3]。而該治療方式價格昂貴，長效性有待進一步探究，推動研究者去尋找更有效且不良反應小的治療方案。杞黃顆粒方是梁鳳鳴教授總結臨床經驗而得，治療黃斑變性取得了確切的療效，故認為其在治療CNV方面可發(fā)揮功用，改善AMD患者的生活質量。本研究致力于觀察杞黃顆粒對BN大鼠VEGF蛋白含量及mRNA表達的影響，探討杞黃顆粒治療CNV的效果。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1動物及試劑 BN大鼠81只，雄性，體質量200～250 g（北京維通利華實驗動物有限公司）、10%熒光素鈉注射液（廣州白云山明興制藥有限公司）、若丹明標記的蓖麻子凝集素（Vector公司）、雷珠單抗注射液（Genentech公司）、VEGF抗體（Prteintech公司）等。

1.1.2實驗儀器 532 nm倍頻Ng：YAG激光機（Quantel·Medical公司）、LV-100激光共焦顯微鏡（Olympus公司）、光學相干斷層掃描（OCT，Heidelberg公司）等。

1.1.3藥物 杞黃顆粒（江蘇江陰藥業(yè)公司）由枸杞子、褚實子、茺蔚子、丹參等藥物組成。功效：補益肝腎，祛瘀明目等。雷珠單抗注射液（0.2 mL）：Genentech公司。

1.2動物模型的制作 BN大鼠81只，隨機分組，13只為空白對照組，68只造模后驗證，再分組。將68只大鼠麻醉（1%戊巴比妥腹腔注射，45 mg/kg），右眼散瞳，532 nm激光圍繞視盤1.5-2PD光凝，約10個點（功率300 mw，直徑 50 μm，曝光 0.05 S）。造模后第7天，68只大鼠中隨機選取3只，行OCT、熒光眼底造影（FFA）、激光共聚焦顯微鏡驗證CNV形成。

1.3OCT和FFA檢測 隨機選取的3只大鼠予OCT、FFA以觀察CNV形態(tài)及滲漏情況。OCT采用視網膜顳側后極部和視盤中心連線的直線橫向線性掃描，長度2.8 mm，深度2 mm。FFA在腹腔推注10%熒光素鈉1 mL/kg，使用海德堡眼底血管造影儀間斷拍攝。

1.4激光共焦顯微鏡檢測RPE-脈絡膜-鞏膜鋪片的CNV 隨機選取的3只大鼠行OCT、FFA后，行過量麻醉，經心臟灌注400 mL生理鹽水和400 mL 4%多聚甲醛，處死，摘除右眼球，固定并洗滌，去除多余組織，RPE-脈絡膜-鞏膜復合體做6～8個放射狀切口，置于TritonX-100中室溫24 h。與若丹明標記的蓖麻子凝集素（1∶1 000）室溫下避光孵育24 h，洗滌后封片，觀察CNV并拍照。

1.5分組及給藥方法 造模后第7天，65只大鼠隨機分為5組：杞黃A組，給藥60天；杞黃B組，給藥90 d；雷珠單抗組；杞黃+雷珠組；模型組。每組13只。杞黃A組和杞黃B組和杞黃+雷珠組予杞黃顆粒灌胃，每日1次，藥量按照《實驗動物學》[4]規(guī)定方法折算，不超過2 mL；模型組和空白對照組予生理鹽水灌胃，每日1次，用量折算方法同杞黃顆粒；雷珠單抗組和杞黃+雷珠組行右眼玻璃體腔注射雷珠單抗注射液，每次3 μL，每月1次，共3次。

1.6Westen-Blot檢測VEGF的蛋白含量 RPE-脈絡膜-鞏膜復合體用10倍體積的組織裂解液，提取蛋白，電泳，轉膜，加入VEGF多克隆抗體，4℃下孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 h，應用ECL顯色劑顯影，Lab Works TM凝膠成像分析系統(tǒng)攝像，分析各條帶的亮度值并繪制柱狀圖。

1.7RT-PCR檢測VEGF mRNA表達水平 依據Trizol試劑說明提取總RNA，取2 μL溶解RNA，紫外線光光分度法測定其純度及濃度后反轉錄，PCR擴增VEGF，同時擴增β-actin作為內參。應用Primer 5.0軟件，設計上下游引物擴增VEGF、βactin的部分CDS區(qū)（VEGF-S：5'-CACCACGCTCTT CTGTCTACTGAAC-3'，VEGF-AS：5'-TGCCACAAG CAGGAATGAG-3'，PCR 產物長度應為 117bp；βactin-S：5'-GCTATTTGGCGCTGGACTT-3'，β-actin-AS：5'-GCGGCTCGTAGCTCTTCTC-3'，PCR 產物長度應為78bp），運用SYBR?Premix Ex Taq TM（TaKaRa）進行實時定量PCR反應。數據處理：Folds=2-ΔΔCt。

1.8統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計和分析。除治療后杞黃顆粒不同時間點VEGF mRNA的比較，選用獨立樣本t檢驗外；其余各組治療之間比較用非參數檢驗，檢驗標準α=0.05。

2 結果

2.1OCT和FFA檢查結果 OCT圖像示：脈絡膜不規(guī)則增厚，色素上皮下可見團塊狀或條形或不規(guī)則形狀的高反射，為CNV（見圖1）；激光斑位置視網膜色素上皮層中斷，周圍呈現環(huán)形或不均勻反射信號（見圖2）。FFA結果顯示：早期可見激光及周邊呈現低熒光，部分中期可見點、片狀或不規(guī)則高熒光，晚期部分滲漏明顯，可見片狀、盤狀或不規(guī)則高熒光。大量滲出時伴有大片圓形或不規(guī)則遮蔽熒光，邊界不清晰，提示有眼底出血（見圖3）。

圖1 OCT檢查結果1

圖2 OCT檢驗結果2

圖3 FFA檢查結果

2.2共焦結果 造模后鋪片可見團簇狀或條帶狀或不規(guī)則形狀熒光，顯示區(qū)域多于50%時，則認為CNV（見圖 4）。

圖4 共焦檢查結果

2.3VEGF的蛋白含量的變化 以60 d各組VEGF蛋白含量為檢驗對象，不符合正態(tài)性分布，予非參數檢驗，結果示：模型組和空白組的VEGF蛋白含量對比明顯增多，P＜0.01，具有統(tǒng)計學意義。杞黃A組、雷珠單抗組相比模型組，雷珠單抗組相比杞黃A組，杞黃+雷珠組相比雷珠單抗組，VEGF的蛋白含量均有所降低，但P＞0.05，不具有統(tǒng)計學差異；杞黃+雷珠組相比模型組VEGF的蛋白含量有所降低，P＜0.05，具有統(tǒng)計學差異；杞黃+雷珠組相比杞黃A組VEGF的蛋白含量明顯降低，P＜0.05，具有統(tǒng)計學差異，見圖5、圖6、表1和表2。

以不同時間點兩組VEGF蛋白含量為檢驗對象，不符合正態(tài)性分布，予非參數檢驗，結果示：杞黃B組相比杞黃A組的VEGF蛋白含量有所降低，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義。

2.4VEGF mRNA表達水平的變化 以60 d各組VEGF mRNA為檢驗對象，不符合正態(tài)性分布，予非參數檢驗，結果示：與空白對照組相比，模型組VEGF mRNA表達水平均明顯增加，P＜0.05，具有統(tǒng)計學差異。杞黃A組、雷珠單抗組相比模型組，雷珠單抗組相比杞黃A組，VEGF mRNA有所降低，但P＞0.05，不具有統(tǒng)計學差異。杞黃+雷珠組相比模型組VEGF mRNA有所降低，P＜0.05，具有統(tǒng)計學差異。見表3和表4。

圖5 60 d各組RPE-脈絡膜-鞏膜復合體中VEGF蛋白含量的表達

圖6 杞黃A組與杞黃B組VEGF蛋白含量的表達

表1 60 d各組RPE-脈絡膜-鞏膜復合體中VEGF蛋白含量的表達（±s）

表1 60 d各組RPE-脈絡膜-鞏膜復合體中VEGF蛋白含量的表達（±s）

注：＃表示兩兩比較時，與模型組對比具有顯著性差異，P＜0.05；*表示兩兩比較時，與杞黃+雷珠組對比具有顯著性差異，P＜0.05。

組別 n 蛋白含量空白對照組 13 552.00±331.98＃模型組 13 1 557.25±493.14杞黃A組 13 1 506.92±516.40*雷珠單抗組 13 1 199.67±393.57杞黃+雷珠組 13 857.25±321.55＃

表2 杞黃A組與杞黃B組VEGF蛋白含量的表達（±s）

表2 杞黃A組與杞黃B組VEGF蛋白含量的表達（±s）

注：*表示與杞黃A組對比具有顯著性差異（P＜0.05)。

組別 n 蛋白含量杞黃A組 13 821.83±334.11杞黃B組 13 560.17±288.20*

表360 d各組VEGFmRNA 表達（±s）

表360 d各組VEGFmRNA 表達（±s）

注：*:表示兩兩比較時，與模型組對比具有顯著性差異（P＜0.05）。

組別 n mRNA空白對照組 13 20.12±0.55*模型組 13 18.25±0.80杞黃A組 13 18.77±0.66雷珠單抗組 13 19.19±0.57杞黃+雷珠組 13 19.65±0.58*

表4 杞黃A組與杞黃B組VEGF mRNA表達（±s）

表4 杞黃A組與杞黃B組VEGF mRNA表達（±s）

注：*：表示與杞黃A組對比具有顯著性差異（P＜0.05）。

分組 動物數 mRNA杞黃A組 13 32.81±0.13杞黃B組 13 33.46±0.20*

以不同時間點兩組VEGF mRNA為檢驗對象，符合正態(tài)性分布，采用獨立樣本T檢驗，結果示：杞黃B組相比杞黃A組的VEGF mRNA有所降低，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義。

3 討論

CNV是諸多眼部疾病的主要病理特征，如WAMD、糖尿病性視網膜病變、息肉樣脈絡膜視網膜病變、高度近視等疾病[5]。CNV的結構與功能的異常，伴有視網膜的滲出、出血等病變，對視力和視覺造成嚴重的沖擊。有研究認為CNV形成與缺氧、炎癥等相關，主要是血管生長因子與血管抑制因子之間的抗衡[6]。VEGF作為主導刺激因子，能夠增加血管的滲透性，促進內皮細胞趨化、遷移，降解細胞外基質，為血管形成提供條件，誘導WAMD發(fā)病，故國際臨床指南多推薦抗VEGF為治療WAMD的一線治療[7]。當前抗VEGF的臨床研究主要分為2個方面：1）是競爭性結合VEGF受體，阻滯VEGF與其受體結合，抑制VEGF表達，減少CNV形成。如雷珠單抗，是一種人源化單克隆抗體片段，靶向抑制人血管內皮生長因子A與其受體的結合，有效減少VEGF表達，該藥治療經典型或隱匿型WAMD經三期（隨機、雙盲、對照）臨床研究證明，玻璃體腔注射該藥可有效提高多數患者的視力，抑制CNV的生成，控制WAMD的進程，并于2013年獲得批準，用于治療CNV致病[8-11]。2）是阻擋VEGF與受體結合后信號通路下游相關激酶的表達，削弱VEGF的作用，如X-82（中國代號CM082），是一種酪氨酸激酶抑制劑，通過抑制VEGF受體和PDGF受體，阻斷CNV的形成，前期應用于抗腫瘤和新生血管。X-82是全球首個治療WAMD的口服藥，2015年其臨床試驗進入臨床IIb期，尚未批準使用[12-14]。綜合考慮，雷珠單抗治療WAMD效果明顯且安全性高，認為是當前行之有效的選擇。

《靈樞·邪氣臟腑病形篇》[15]中認為：十二經脈，三百六十五絡，其氣血皆上于面而走空竅，其精陽氣上走于目而為之睛?！秾徱暚幒穂16]中則曰：目，內有大絡者五，乃心、肝、脾、肺、腎各主一絡……通乎血氣往來以滋目。眼睛與各臟腑、經絡關系密切，氣血正常運行得以明視物。近代眼科大家陳達夫先生依據內眼與臟腑經絡的關系，提出“中醫(yī)眼科六經法要之說[17]”，認為視網膜屬于足厥陰肝經，而視網膜黃斑區(qū)屬于足太陰脾經，眼內一切色素屬于腎經。WAMD患者多年邁體弱，素體肝血不足，目視不明，腎氣不固，瞳神失養(yǎng)，久病致脈絡氣血虧虛，不能上榮于目，目珠失于涵養(yǎng)。若脾虛失常，津液不能輸布，聚濕成痰，痰濁傷于黃斑，氣血溢于脈外，脈絡瘀阻閉塞，久絡傷血，更加影響視物功能，故本病特點為因虛生痰，由虛致瘀，痰瘀互結，虛實夾雜,與肝脾腎緊密相關，治宜從肝脾腎入手,審證求因，區(qū)分虛實，健脾滋補肝腎同時祛瘀通絡活血。杞黃顆粒經過多年臨床證明在治療干性肝腎陰虛型老年性黃斑變性上有顯著療效[18]，方由枸杞子、褚實子、茺蔚子、丹參等組成。枸杞子入肝腎經，作用為滋補肝腎，養(yǎng)血明目。褚實子入肝腎經，功能為補腎益精，利水消腫。茺蔚子入心包、肝經，功效為養(yǎng)肝明目，活血通經。三者合為君藥，既補益肝腎之不足，又能夠通經活血以消散脈絡之瘀阻，補虛泄實，標本兼顧。

總之，杞黃顆粒經證實治療干性AMD確有明顯的療效[18-20]，而本實驗在其對治療WAMD的研究中發(fā)現，60 d的干預上杞黃顆粒對VEGF的調控作用不明顯，但經過90 d的對比后，其呈現出逐步增效的趨勢，且與雷珠單抗聯(lián)合使用時表現出明確下調VEGF表達的效果，治療WAMD有一定的意義，值得進一步探究。

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