葛根素參與的可注射鈣離子敏感凝膠構(gòu)建和性質(zhì)研究*

岳占龍，崔元璐

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病。65歲以上的老年人，其骨關(guān)節(jié)炎的患病率高達(dá)33.9%[1]。骨關(guān)節(jié)炎自我修復(fù)能力差，傳統(tǒng)治療僅能夠在一定程度上緩解癥狀、延緩病情發(fā)展，缺少有效的治療措施。關(guān)節(jié)腔內(nèi)直接給藥和干細(xì)胞注入修復(fù)，是骨關(guān)節(jié)炎治療的新策略。海藻酸鈉（SA）是生物相容性良好的天然多糖，能與Ca2+絡(luò)合形成經(jīng)典的蛋盒結(jié)構(gòu)凝膠[2-4]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葛根素（Pu）可參與海藻酸鈣凝膠構(gòu)建，增加海藻酸鈣凝膠的強(qiáng)度，同時(shí)Pu具有誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的活性[5]。研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中鈣離子濃度較高[6-7]，利用這一特點(diǎn)，構(gòu)建SA、Pu參與的可注射型離子敏感凝膠，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中較高濃度的Ca2+產(chǎn)生響應(yīng)，在關(guān)節(jié)腔中由液體狀態(tài)迅速形成凝膠，作為藥物控釋或者負(fù)載干細(xì)胞的載體，通過(guò)干細(xì)胞的多向分化潛能，修復(fù)重建軟骨組織來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎。

1 試劑與儀器

海藻酸鈉，生工生物工程(上海)股份有限公司，中國(guó)；葛根素（純度＞99%），上海永恒生物科技有限公司，中國(guó)；粉防己堿（Tet，純度＞98%），上海永恒生物科技有限公司，中國(guó)；無(wú)水氯化鈣（CaCl2純度≥96%），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，中國(guó)；色譜純甲醇，天津康科德有限公司，中國(guó)；色譜純乙腈，天津康科德有限公司，中國(guó)；苯甲酸，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，中國(guó)；粉防己堿標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)食品藥品檢定研究院；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

DV-III程序式黏度計(jì)，Brookfield公司，美國(guó)；智能溫控式恒溫金屬浴，杭州博日公司，中國(guó)；AR1000流變儀，TA公司，美國(guó)；Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡，F(xiàn)EI公司，美國(guó)；SPH-111B大容量恒溫培養(yǎng)搖床，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國(guó)；2695型高效液相色譜儀，Waters公司，美國(guó)；Kromasil 100-5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm），Eka Chemicals AB 公司，瑞典。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1葛根素-海藻酸鈣凝膠的制備 稱(chēng)取一定量的SA，加入適量超純水,45℃電磁攪拌4～6 h至完全溶解，4℃條件下放置24 h，成穩(wěn)定的溶膠，備用。在SA溶液中加入一定質(zhì)量的Pu粉末，50℃條件下溶解或者分散均勻，得到兩者的混合液。純水配制CaCl2溶液，在西林瓶中快速拌條件下將等體積的SA與CaCl2溶液混合均勻，常溫放置2 h使凝膠充分溶脹，得到一系列處方凝膠。采用翻轉(zhuǎn)小瓶法初步判斷處方中SA、CaCl2與Pu三者濃度對(duì)凝膠強(qiáng)度影響的大小與三者所需的濃度范圍，以凝膠強(qiáng)度可以承受自重翻轉(zhuǎn)為佳。

2.2葛根素-海藻酸鈣凝膠黏度測(cè)定 按照3.1中方法制備以下處方：（1）0.5%SA、（2）1.0%SA、（3）1.5%SA、（4）1.0%SA+0.2%Pu、（5）1.0%SA+0.5%Pu、（6）1.0%SA+1.0%Pu、（7）0.5%SA+6 mmol/L CaCl2、（8）0.5%SA+6 mmol/L CaCl2+0.15%Pu、（9）0.5%SA+6 mmol/L CaCl2+0.25%Pu、（10）0.5%SA+6 mmol/L CaCl2+0.5%Pu，溫度為37℃條件下，采用DV-III黏度計(jì)64號(hào)探頭，液面下深度2.5 cm對(duì)進(jìn)行粘性測(cè)定。

2.3凝膠最佳處方篩選 按照3.1中制備方法，依據(jù)凝膠制備所需三者的濃度范圍，采用單一變量法調(diào)整SA、CaCl2和Pu的濃度制備凝膠，CaCl2設(shè)置4、6、8 mmol/L 3個(gè)濃度梯度，SA 設(shè)置 0.55%、0.60%、0.65%、0.70%4個(gè)濃度梯度，Pu設(shè)置0.03%、0.1%、0.2%3個(gè)濃度梯度。通過(guò)流變儀測(cè)定凝膠流變流參數(shù)，從流變學(xué)結(jié)果中篩選最佳處方，流變儀參數(shù)：振動(dòng)過(guò)程，角頻率 0.1～100 rad/s，20 mm 錐形盤(pán)，溫度37℃。

2.4掃描電鏡分析 按照3.1中制備方法，按照以下處方制備凝膠：1）1.0%SA+0.2%Pu；2）0.5%SA+4 mmol/L CaCl2+0.2%Pu；3）0.5%SA+4 mmol/L CaCl2；4）0.5%SA+8 mmol/L CaCl2，溶脹均勻后，在-80℃冰箱中預(yù)凍，然后在凍干機(jī)中凍干，用手術(shù)刀片將凍干樣品切片，噴金后掃描電鏡下觀察凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。

2.5凝膠溶脹、降解實(shí)驗(yàn)

2.5.1凝膠的溶脹實(shí)驗(yàn) 按照3.1中制備方法，制備兩種處方凝膠：0.6%SA+6 mmol/L CaCl2、0.6%SA+6 mmol/L CaCl2+0.2%Pu，每組平行4個(gè)樣本，在15 mL離心管中稱(chēng)量質(zhì)量約2 g，于真空干燥箱中65℃真空干燥超過(guò)24 h，得到干燥凝膠，稱(chēng)量干燥凝膠的質(zhì)量，加含有0.01%苯甲酸的無(wú)菌PBS溶液至15 mL，保存于37℃環(huán)境，于設(shè)定時(shí)間點(diǎn)棄去PBS溶液，濾紙吸取凝膠表面水分，稱(chēng)量凝膠濕質(zhì)量，根據(jù)溶脹率計(jì)算公式得到溶脹率：

Wo為凝膠干重，Wt為凝膠溶脹后質(zhì)量。

2.5.2凝膠的體外降解實(shí)驗(yàn) 按照3.5.1方法制備凝膠，每組平行4個(gè)，在15 mL離心管中稱(chēng)量質(zhì)量約2 g，于真空干燥箱中65℃真空干燥24 h以上，得到干燥凝膠，稱(chēng)量干燥凝膠的質(zhì)量，加PBS溶液后，置于37℃恒溫?fù)u床中，于固定時(shí)間點(diǎn)取樣，濾紙吸取凝膠表面水分，真空干燥并稱(chēng)質(zhì)量，得到降解后凝膠的干質(zhì)量，通過(guò)對(duì)比凝膠降解后損失質(zhì)量與降解前干重得到降解率。

2.6葛根素海藻酸鈣凝膠的體外藥物釋放 配制1.2%SA溶液和12 mmol/L CaCl2溶液，按照3.1中方法，用1.2%SA溶液溶解Pu，12 mmol/L CaCl2溶液溶解粉防己堿(Tet)。使用以上溶液制備兩種凝膠，處方為：0.6%SA+6 mmol/L CaCl2+0.2%Pu+0.05%Tet、0.6%SA+6 mmol/L CaCl2+0.05%Tet。釋放過(guò)程在恒溫?fù)u床中完成[8],釋放介質(zhì)為含有0.01%苯甲酸PBS溶液，通過(guò)0.22 μm孔徑濾膜除菌，稱(chēng)量質(zhì)量為2 g凝膠密封于截留量為7 000 Da的半透膜中，釋放條件為：PBS溶液100 mL，溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為55 r/min，采樣時(shí)間點(diǎn)為：0.5、1、3、7、12、24、48、72 h，取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)充PBS溶液。采用HPLC方法探索流動(dòng)相比例，對(duì)Pu、Tet標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為250 nm、278 nm，繪制積分面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，同樣方法測(cè)定樣品中Pu、Tet濃度，計(jì)算藥物的累積釋放速率。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1葛根素-海藻酸鈣凝膠的制備 當(dāng)CaCl2濃度達(dá)到3.0 mmol/L時(shí)即發(fā)生弱的膠凝現(xiàn)象，隨著鈣離子濃度增加膠凝強(qiáng)度增加，凝膠強(qiáng)度越弱則流動(dòng)性越明顯，凝膠強(qiáng)度過(guò)大則會(huì)出現(xiàn)局部膠凝，凝膠體積縮小并有水析出，通過(guò)翻轉(zhuǎn)小瓶法初步判斷處方中SA、CaCl2和Pu對(duì)凝膠強(qiáng)度影響由大到小依次為CaCl2＞SA＞Pu，膠凝化良好時(shí)3種材料的濃度范圍依次為 CaCl2：5～7 mmol/L、SA：0.5%～1.0%、Pu 濃度＜0.3%。

3.2葛根素-海藻酸鈣凝膠黏度測(cè)定結(jié)果 由表1數(shù)據(jù)可知，對(duì)于SA溶液，隨著SA濃度增加，黏度不斷增加，每增加0.5%濃度，黏度增加3～8倍，形成凝膠后黏度快速增加，Pu微溶于水并具有水化特性，當(dāng)Pu過(guò)飽和時(shí)，能夠使SA溶液和凝膠黏度明顯增加，未飽和時(shí)（≤0.25%）對(duì)SA溶液和凝膠黏度無(wú)明顯影響，處方中3種原料對(duì)凝膠黏度影響大小順序?yàn)?CaCl2＞SA＞Pu。

表1 葛根素-海藻酸鈣凝膠黏度測(cè)定結(jié)果cP

3.3凝膠最佳處方篩選 通過(guò)流變學(xué)方法表征凝膠流變學(xué)參數(shù)時(shí)，當(dāng)黏性模量G”＞彈性模量G’時(shí)，溶液處于黏性液體狀態(tài)，當(dāng)G’＞G”時(shí)表現(xiàn)為凝膠狀態(tài)[9]，凝膠的強(qiáng)度大小由G’決定。篩選最佳凝膠處方參考李凱[10]等研究結(jié)果，用于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的透明質(zhì)酸凝膠最佳強(qiáng)度為G’略大于100 Pa。當(dāng)CaCl2濃度≤6 mmol/L 時(shí)，G’與 G”大小相近，凝膠強(qiáng)度偏弱，達(dá)到8 mmol/L時(shí)，凝膠強(qiáng)度過(guò)大；SA濃度在0.55%～0.65%之間對(duì)凝膠強(qiáng)度影響不大，達(dá)到0.7%流變學(xué)參數(shù)變得不規(guī)律；Pu濃度≤0.1%時(shí)，對(duì)凝膠強(qiáng)度影響不明顯，葛根素濃度達(dá)到0.2%時(shí)對(duì)凝膠強(qiáng)度有明顯的促進(jìn)作用，也證明了葛根素可能參與海藻酸鈣凝膠構(gòu)建。在確保所得凝膠均一透明和可注射性前提下，篩選最佳凝膠處方為0.6%SA+6 mmol/L CaCl2+0.2%Pu。

3.4凝膠的顯微結(jié)構(gòu) 根據(jù)圖4凝膠掃描電鏡結(jié)果可知，SA與Pu的混合物不具有明顯的網(wǎng)孔支架結(jié)構(gòu)，而是呈現(xiàn)不規(guī)則的層狀碎片結(jié)構(gòu)，含有0.2%Pu處方的凝膠中有Pu析出，存在與凝膠網(wǎng)孔壁上。處方中CaCl2濃度達(dá)到4 mmol/L即形成三維網(wǎng)孔支架結(jié)構(gòu)，網(wǎng)孔單元直徑約為100 μm，分布規(guī)律，大小均一；當(dāng)CaCl2濃度達(dá)到8 mmol/L時(shí)，凝膠網(wǎng)孔單元直徑減小至60 μm左右，孔隙率有所下降，由于凝膠強(qiáng)度較大，凍干凝膠平面切片時(shí)形成較多碎片。相比傳統(tǒng)2D培養(yǎng)，3D培養(yǎng)更貼近體生理?xiàng)l件，使細(xì)胞更好的表達(dá)出生理功能[11]，掃描電鏡結(jié)果說(shuō)明，Pu-海藻酸鈣凝膠結(jié)構(gòu)具有較大孔隙率，符合細(xì)胞3D培養(yǎng)的要求，能夠?yàn)榧?xì)胞提供充足的生長(zhǎng)空間，保證細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體交換。

3.5凝膠體外溶脹、降解性質(zhì)

圖1 不同濃度CaCl2條件下凝膠流變學(xué)參數(shù)

圖2 不同濃度SA條件下凝膠流變學(xué)參數(shù)

圖3 不同濃度Pu條件下凝膠流變學(xué)參數(shù)

圖4 凝膠的掃描電鏡圖

3.5.1凝膠體外溶脹結(jié)果 由圖5凝膠溶脹結(jié)果可知，無(wú)論是海藻酸鈣凝膠還是Pu-海藻酸鈣凝膠，在12 h溶脹平衡，海藻酸鈣凝膠溶脹率為75倍，Pu-海藻酸鈣凝膠的溶脹率為45倍。對(duì)于海藻酸鈣凝膠，強(qiáng)度弱則溶脹率大，Pu具有增加海藻酸鈣凝膠強(qiáng)度的作用，導(dǎo)致凝膠的溶脹率下降。凝膠溶脹率反映了凝膠的保水性和孔隙率，對(duì)于細(xì)胞的支架材料來(lái)說(shuō)，要為細(xì)胞提供穩(wěn)定載體和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換條件，凝膠強(qiáng)度太大不利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換，強(qiáng)度小則降解速度快。

3.5.2凝膠體外降解結(jié)果 在體外降解實(shí)驗(yàn)中，Pu-海藻酸鈣凝膠均勻、透明，溶脹體積較小，而海藻酸鈣凝膠有白色片狀絮凝現(xiàn)象，溶脹體積較大。說(shuō)明Pu-海藻酸鈣凝膠強(qiáng)度較大，凝膠狀態(tài)更穩(wěn)定。海藻酸鈣凝膠在12 d開(kāi)始出現(xiàn)明顯降解，到第24天降解83.78%，Pu-海藻酸鈣凝在第24天開(kāi)始降解，降解率僅為18.86%。對(duì)于負(fù)載細(xì)胞和藥物的關(guān)節(jié)原位注射凝膠，要求凝膠強(qiáng)度和降解周期與治療周期相符，體內(nèi)關(guān)節(jié)腔環(huán)境比較復(fù)雜，一方面是生理環(huán)境，透明質(zhì)酸能夠阻礙SA與Ca2+形成凝膠[12]，二是關(guān)節(jié)腔存在的機(jī)械力，對(duì)凝膠的降解也有促進(jìn)作用。Pu-海藻酸鈣凝膠相比海藻酸鈣凝膠在溶脹、降解性質(zhì)方面都具有明顯優(yōu)勢(shì),Pu-海藻酸鈣凝膠更符合骨關(guān)節(jié)炎的治療要求。

圖5 凝膠的平均溶脹率曲線圖

表3 凝膠的體外平均降解率%

圖6 藥物釋放曲線（左：Pu，右：Tet）

3.6葛根素海藻酸鈣凝膠的體外藥物釋放 樣品通過(guò)HPLC進(jìn)樣測(cè)定濃度，經(jīng)過(guò)條件篩選，Pu流動(dòng)相比例為0.1%磷酸水溶液：甲醇=1∶1，Tet流動(dòng)相比例為0.1%磷酸水溶液：甲醇∶0.1%三乙胺乙腈溶液=0.1∶0.55∶0.35。采用標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到濃度-積分面積標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為 Pu：y=1.477×10-5-0.160，R2=0.99 9 8；Tet：y=5.458×10-5-0.065,R2=0.9999。

從藥物釋放結(jié)果看，Tet在24 h基本達(dá)到釋放平衡點(diǎn)，僅僅釋放藥物總量的53%，中性Tet在弱堿性水溶液中會(huì)以微晶體或亞微晶體析出，釋放完成后凝膠中可見(jiàn)析出的Tet藥物，所以Tet釋放藥物總量的53%。Pu的存在對(duì)Tet釋放基本無(wú)影響，對(duì)于海藻酸鈣凝膠，改變膠凝強(qiáng)度對(duì)于Mw≤20 000 Da藥物釋放基本無(wú)影響[13]。凝膠中Pu釋放速率較快，于12 h基本達(dá)到釋放平衡點(diǎn)，累積釋放率達(dá)到藥物總量的85.5%，首先葛根素有少量的降解[14]，由釋放曲線12 h到72 h結(jié)果可知，Pu在釋放條件下有少量降解。其次因?yàn)镻u的吸光度極易受pH值的影響，隨著pH值變大，Pu黃酮母核羥基容易電離，λmax發(fā)生明顯紅移[15]，紅移后在原λmax吸光度減小，此時(shí)測(cè)得Pu含量偏小。

4 討論

海藻酸鈣凝膠一般通過(guò)SA與不溶性鈣鹽緩慢釋放Ca2+交聯(lián)所得，SA與Ca2+能夠迅速發(fā)生物理交聯(lián)而膠凝化[16-17]，直接滴加法也只適用于制備凝膠粒子，粒子表面交聯(lián)強(qiáng)度大于內(nèi)部[18]，實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)Ca2+濃度小于7 mmol/L時(shí)，采用物理攪拌可以得到均一凝膠。以SA為主要材料構(gòu)建Pu-海藻酸鈣凝膠具有以下優(yōu)勢(shì)，SA生物相容性良好；SA均為酸性多糖，關(guān)節(jié)滑液主要成分為透明質(zhì)酸[19-20]，兩者性質(zhì)相似[21]；骨關(guān)節(jié)炎患者滑液中透明質(zhì)酸有明顯降低趨勢(shì)[20]，采用SA材料能夠改善此病理?xiàng)l件；有文獻(xiàn)報(bào)道SA能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[22]；人體缺少SA相關(guān)降解酶，經(jīng)關(guān)節(jié)注射后，SA在體內(nèi)降解緩慢，比較適用骨關(guān)節(jié)炎這類(lèi)慢性疾病。Pu-海藻酸鈣凝膠具有較高孔隙率，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供充足的空間，與海藻酸鈣凝膠相比，彈性模量G’較大、溶脹率下降、體外降解時(shí)間長(zhǎng)，一致說(shuō)明Pu對(duì)海藻酸鈣凝膠強(qiáng)度有促進(jìn)作用，凝膠性質(zhì)有所改善。負(fù)載粉防己堿凝膠表現(xiàn)出良好的藥物緩釋行為，24 h內(nèi)釋放藥物總量的53%，未釋放藥物會(huì)隨著凝膠的緩慢降解逐漸釋放。綜上所述，Pu-海藻酸鈣凝膠有望成為骨關(guān)節(jié)炎治療的良好載體。

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