補(bǔ)腎健脾法影響PCOS-IR先兆流產(chǎn)者血清pAkt、mTOR的研究*

蔣 莎 ，姜俊竹 ，陳 璐，馮曉玲

（1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040）

多囊卵巢綜合征（PCOS）以高雄激素血癥和（或）高胰島素血癥，慢性低或無排卵和多囊卵巢為診斷標(biāo)準(zhǔn)，是臨床常見婦科生殖內(nèi)分泌疾病之一。據(jù)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示約15%的育齡期婦女受此疾病困擾[1]。中國PCOS發(fā)病率高達(dá)16.9%[2]，其中有研究稱PCOS-IR流產(chǎn)者占PCOS流產(chǎn)者的16%[3]。IR、慢性低度炎癥與高胰島素血癥、高雄四者形成PCOS病理生理的惡性循環(huán)，其中IR和高胰島素血癥與PCOS患者流產(chǎn)密切相關(guān)。pAkt和mTOR通過PI3K/AKT通路參與蛋白、葡萄糖等能量攝取、合成及代謝，調(diào)控胚胎細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[4]，并可影響子宮內(nèi)膜容受性，參與PCOS-IR先兆流產(chǎn)發(fā)生。本研究旨在通過觀察補(bǔ)腎健脾法對(duì)血清pAkt、mTOR表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討pAkt、mTOR致PCOS-IR患者先兆流產(chǎn)的可能機(jī)制，為 pAkt、mTOR做為PCOS-IR先兆流產(chǎn)患者潛在靶點(diǎn)治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年12月—2015年2月于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科門診及病房就診的正常妊娠者和PCOS伴先兆流產(chǎn)癥狀者。其中實(shí)驗(yàn)組A組：PCOS-IR先兆流產(chǎn)者23例，B組：PCOS-NIR先兆流產(chǎn)者22例，空白組C組：正常妊娠患者24例。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)、入組標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)及脫落標(biāo)準(zhǔn) 多囊卵巢綜合征胰島素抵抗西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照謝幸主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》[5]（2013年版）和李秀鈞主編的《代謝綜合征胰島素抵抗綜合征》（2007版）[6]制定。妊娠先兆流產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[7]、第八版《婦產(chǎn)科學(xué)》相關(guān)內(nèi)容擬定。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)采用鄭筱萸主編的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8]及馬寶璋主編的《中醫(yī)婦科學(xué)》（2006年版）[9]制定。入組標(biāo)準(zhǔn)：符合上述中醫(yī)、西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)者。中醫(yī)證型為脾腎兩虛型。主癥腰骶酸痛，陰道少量流血，色淡紅質(zhì)稀，小腹墜痛，次癥兩膝酸軟，頭暈耳鳴，神疲乏力，心悸氣短。主癥和次癥具備一項(xiàng)或以上，結(jié)合舌脈，舌質(zhì)淡舌苔白，脈沉細(xì)或細(xì)緩略滑者，可診斷。年齡要求20～45歲；妊娠周數(shù)為4～8周；簽署同意書并服從治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：擁有其它病因致高雄激素血癥者或自身擁有其它全身疾病致胰島素抵抗者；無法配合治療者，或不愿配合治療者。脫落標(biāo)準(zhǔn)：不符合入組標(biāo)準(zhǔn)者；依從性差，不能規(guī)范服藥患者；治療過程中失訪、要求退出治療及拒絕治療后采血者。

1.3治療方法 實(shí)驗(yàn)組給予補(bǔ)腎健脾代表方助孕寧Ⅱ號(hào)煎藥湯劑治療。方藥組成：黃芪50 g，白芍30 g，黨參 20 g，山藥 20 g，白術(shù) 20 g，菟絲子 20 g，續(xù)斷 20 g，桑寄生 20 g，熟地黃 20 g，鹽杜仲 20 g，阿膠15 g，炙甘草10 g。制成水煎劑（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局煎制）。每日1劑水煎劑500 mL，早晚2次分服，療程30 d?？瞻捉M未予治療僅觀察。

1.4觀察指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1P、β-HCG 檢測(cè)、FPG、FINS 水平和 HOMAIR指數(shù)計(jì)算 留取晨起空腹血樣全血，使用孕酮、雌二醇、胰島素和血糖試劑盒檢測(cè)。HOMA-IR指數(shù)計(jì)算公式：空腹血糖（FPG）×空腹胰島素（FINS）/22.5。試劑盒均來自北京城林生物技術(shù)有限公司。

1.4.2pAkt和mTOR檢測(cè) 留取晨起空腹血樣，離心后取上清，凍存于-80℃，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法進(jìn)行統(tǒng)一檢測(cè)。ELISA試劑盒來自北京城林生物技術(shù)有限公司。

1.4.3安全性檢測(cè) 所有入組者在實(shí)驗(yàn)期間定期復(fù)查B超檢測(cè)胚胎及胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育狀況；定期行血、尿常規(guī)、肝腎功等安全性檢測(cè)。采集晨起空腹血樣進(jìn)行全血檢測(cè)。國產(chǎn)微量高速離離心機(jī)（TG16W），試劑盒均來自北京城林生物技術(shù)有限公司。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 19.0版本進(jìn)行分析計(jì)量資料數(shù)據(jù)處理運(yùn)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），多組間方差齊時(shí)應(yīng)用單因素方差分析，不齊時(shí)應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料處理采用卡方檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01時(shí)有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1病例脫落情況 治療開始后，A組3例、B組2例患者發(fā)生自然流產(chǎn)，C組4例由于家庭個(gè)人因素退出研究。記錄剩下60例入組人員的一般基本資料、相關(guān)檢查結(jié)果、臨床治療情況、隨訪情況。

2.2一般資料分析 如表1所示：三組年齡、妊娠天數(shù)、BMI均屬正態(tài)分布。年齡、妊娠天數(shù)資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。BMI指數(shù)，A組與B、C組相比，有顯著差異 P＜0.01），B、C 組無顯著差異（P＞0.05）。以上因素經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均具有可比性。見表1。

2.3血清檢測(cè)結(jié)果

2.3.1孕酮、特異性人絨毛促性腺激素表達(dá)水平分析 血β-HCG化驗(yàn)結(jié)果區(qū)間較大、不呈正態(tài)分布，對(duì)其進(jìn)行以10為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后符合正態(tài)分布，再行參數(shù)檢驗(yàn)。見表2。

表1 各組一般資料分析（±s）

表1 各組一般資料分析（±s）

注：實(shí)驗(yàn)組：A組為PCOS-IR先兆流產(chǎn)者；B組為PCOS-NIR先兆流產(chǎn)者?？瞻捉M：C組為健康妊娠婦女。同A組治療前比較#P＜0.01。

組別 例數(shù) 年齡（歲） 妊娠天數(shù)（d） BMI A 組 20 30.80±3.488 41.80±7.648 26.49±3.153 B 組 20 30.30±4.497 41.15±6.302 23.58±2.545#C 組 20 28.80±4.396 41.70±6.814 22.22±2.216#

表2 各組孕酮、血β-HCG結(jié)果（±s）

表2 各組孕酮、血β-HCG結(jié)果（±s）

注：實(shí)驗(yàn)組：A組為PCOS-IR先兆流產(chǎn)者；B組為PCOS-NIR先兆流產(chǎn)者?？瞻捉M：C組為健康妊娠婦女。

組別 時(shí)間 例數(shù) 孕酮（±s，ng/mL）經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的血 β-HCG（±s）A組 治療前 20 17.22±3.813 3.96±0.835治療后 20 38.04±4.967 4.93±0.317 B組 治療前 20 19.02±2.660 3.91±0.813治療后 20 38.28±6.324 4.95±0.288 C組 30 d前 20 34.38±3.992 4.47±0.670 30 d 后 20 41.37±4.580 5.10±0.215

如表2所示：1）治療前孕酮、血β-HCG水平：A、B組孕酮、血β-HCG比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但A、B組分別與C組比較，差異具有顯著性（P＜0.01）。2）治療后孕酮、血 β-HCG 水平：A、B 組治療后與C組（30 d后）兩兩比較無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.2FPG、FINS和HOMA-IR指數(shù)表達(dá)水平比較 見表3。

表 3 各組 FPG、FINS、HOMA-IR 結(jié)果（±s）

表 3 各組 FPG、FINS、HOMA-IR 結(jié)果（±s）

注：實(shí)驗(yàn)組：A組為PCOS-IR先兆流產(chǎn)者；B組為PCOS-NIR先兆流產(chǎn)者?？瞻捉M：C組為健康妊娠婦女。同A組治療前比較，*P＜0.05；#P＜0.01；同 A 組治療后比較，#P＜0.01；同 C 組治療前比較，△P＜0.05。

組別 時(shí)間 例數(shù) FPG（mmol/L）FINS（mIU/L） HOMA-IR A組 治療前 20 6.17±0.880 18.18±5.867 5.09±2.080治療后 20 5.48±0.523# 14.26±3.195* 3.50±0.902*B組 治療前 20 5.62±0.713* 8.81±1.720#△ 2.21±0.575#治療后 20 5.54±0.543 9.38±1.518# 2.32±0.488#C 組 30 d前 20 5.58±0.855* 8.27±1.985# 2.04±0.514#30 d 后 20 5.53±0.632 10.17±1.731#△ 2.49±0.447#△

如表3所示：1）治療前FPG、FINS和HOMAIR指數(shù)水平：A組大于B、C組，F(xiàn)PG差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HOMA-IR指數(shù)差異具有顯著性（P＜0.01）；FINS水平：A組大于B組，B組大于 C組，差異均具有顯著性（P＜0.01），其中FPG、FINS和HOMA-IR指數(shù)水平B組與C組無顯著差異（P＞0.05）。2）治療后FPG、FINS和HOMA-IR指數(shù)水平：其中FPG水平：A、B組與C組（30 d后）兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；FINS和HOMA-IR指數(shù)水平：A 組仍高于 B組、C組，有顯著差異（P＜0.01）；B組與C組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），

2.3.3pAkt、mTOR表達(dá)水平分析 見表4。

表 4 各組 pAkt、mTOR 結(jié)果（±s）

表 4 各組 pAkt、mTOR 結(jié)果（±s）

注：實(shí)驗(yàn)組：A組為PCOS-IR先兆流產(chǎn)者；B組為PCOS-NIR先兆流產(chǎn)者?？瞻捉M：C組為健康妊娠婦女。

組別時(shí)間例數(shù)pAkt（ng/L）mTOR（ng/L）A組 治療前 20 78.32±10.929 254.08±26.472治療后 20 112.66±12.307 367.02±30.721 B組 治療前 20 85.85±12.706 287.85±29.684治療后 20 121.96±13.980 386.98±32.797 C組 30 d前 20 93.36±11.526 307.51±28.351 30 d 后 20 119.88±12.896 384.78±32.838

如表4所示，血清pAkt、mTOR經(jīng)方差分析得：1）治療前血清pAkt、mTOR水平：A組低于B組，B組低于 C 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2）治療后血清pAkt、mTOR水平：治療后A、B、C組兩兩相比無顯著差異（P＞0.05）。A、B兩組治療后均明顯高于治療前。

2.3.4隨訪 截止2015年11月，A組有4例于妊娠晚期出現(xiàn)妊娠糖尿病，除2例于妊娠24周和妊娠25周流產(chǎn)外，其余18例均妊娠足月分娩，且新生兒狀態(tài)良好。B組有1例妊娠16周出現(xiàn)流產(chǎn)。剩余患者維持妊娠至中晚期，且無并發(fā)癥出現(xiàn)。

3 討論

現(xiàn)代生殖內(nèi)分泌學(xué)認(rèn)為多囊卵巢綜合征是一種影響患者生殖、代謝和心血管健康的內(nèi)分泌疾病，其影響伴隨患者整個(gè)生命周期[10]。PCOS-IR者妊娠早期易出現(xiàn)肥胖，先兆流產(chǎn)，妊娠期糖尿病等并發(fā)癥，隨著病情進(jìn)展患者心血管風(fēng)險(xiǎn)、子癇前期和分娩危險(xiǎn)增加。王蘊(yùn)慧等[11]研究發(fā)現(xiàn)PCOS孕婦自然流產(chǎn)、妊娠期糖尿病、早產(chǎn)及巨大胎兒的發(fā)病率都顯著升高。其中高胰島素血癥、高雄激素血癥和黃體功能低下密切參與PCOS-IR患者先兆流產(chǎn)的發(fā)生過程[12]。PCOS患者IR的發(fā)生與胰島素生理作用途徑即PI3K/Akt/mTOR通路失常有關(guān)。其中pAkt、mTOR是 PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)因子,mTOR為pAkt下游信號(hào)因子。pAkt可直接激活PI3K/Akt通路，還可通過磷酸化TSC2激活mTOR通路。在PCOS-IR患者中PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控胰島素和細(xì)胞代謝，參與PCOS-IR發(fā)病過程[13]，并參與調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化與滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡，在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[14-15]。動(dòng)物研究表明，已孕小鼠子宮內(nèi)膜pAkt、mTOR表達(dá)量明顯高于未孕小鼠。其中pAkt在內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)隨妊娠天數(shù)增加而增加，并與蛻膜化程度呈正相關(guān)[16-17]，mTOR表達(dá)量從著床前期至著床窗口期逐漸增高[18]。而使用mTOR抑制劑雷帕霉素（RAPA）后，胚胎發(fā)育受到抑制[19]。這些研究提示pAkt、mTOR可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)子宮內(nèi)膜容受性促進(jìn)胚胎著床。

雖然pAkt、mTOR引起PCOS-IR患者先兆流產(chǎn)的機(jī)制還不明確，但目前認(rèn)為PCOS-IR患者血清pAkt、mTOR通過PI3K/Akt/mTOR途徑參與先兆流產(chǎn)的發(fā)生機(jī)制與以下幾種因素有關(guān)：1）影響子宮內(nèi)膜胚胎細(xì)胞的增殖、分化和凋亡：pAkt不僅可激活PI3K/Akt通路，還可通過TSC1/2啟動(dòng)mTOR通路，參與物質(zhì)能量代謝，調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡[20]。正常妊娠中pAkt、mTOR水平升高，為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，并參與胚胎的器官形成和性別分化。本研究證實(shí)PCOS-IR先兆流產(chǎn)組pAkt、mTOR水平明顯低于PCOS非IR先兆流產(chǎn)組及正常妊娠組，并認(rèn)為PCOS-IR患者先兆流產(chǎn)的發(fā)生與pAkt、mTOR下降導(dǎo)致PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的傳導(dǎo)作用下降有關(guān)。同時(shí)，pAkt還可激活forkhead轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí)抑制Bad、caspase-9因子抑制細(xì)胞凋亡。2）干預(yù)子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化及激素受體，影響子宮內(nèi)膜容受性：pAkt、mTOR受雌孕激素水平調(diào)節(jié)。孕激素過低，pAkt減少。pAkt減少進(jìn)而影響顆粒細(xì)胞形成黃體，黃體生成不足。PCOS患者子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)高雄激素、高胰島素、無孕激素和低雌激素狀態(tài)，激素受體表達(dá)異常，孕激素受體過多。pAkt、mTOR表達(dá)減少，影響子宮內(nèi)膜蛻膜化和子宮內(nèi)膜容受性，胚胎著床和植入受阻，流產(chǎn)發(fā)生[17]。整合素（αvβ3）[21]及其配體骨橋蛋白（OPN）是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物。子宮內(nèi)膜激素狀態(tài)異常，整合素αvβ3表達(dá)過低或延遲，并影響到骨橋蛋白表達(dá)。內(nèi)膜轉(zhuǎn)化異常，子宮內(nèi)膜容受性降低，胚胎的定位與黏附失常，流產(chǎn)發(fā)生[22]。此外，高雄激素血癥致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降[23]，高胰島素血癥可下調(diào)pAkt和mTOR活性，抑制母胎界面免疫應(yīng)，影響胚胎的著床、生長(zhǎng)及發(fā)育。以上因素共同參與PCOS-IR患者先兆流產(chǎn)的發(fā)生。

PCOS-IR先兆流產(chǎn)者的治療目前有藥物、針刺和心理疏導(dǎo)。中醫(yī)認(rèn)為，PCOS的發(fā)生主要責(zé)之于腎、肝、脾，且臨床所見中醫(yī)證型總體以腎虛為多。而PCOS-IR先兆流產(chǎn)則與腎、脾關(guān)系密切。腎虛、脾虛是其主要病機(jī)。腎為先天之本，脾胃后天之本，脾、腎的虧虛致胎無所系、胎失所養(yǎng)。脾腎功能異常，最終導(dǎo)致胎動(dòng)不安及相關(guān)癥狀出現(xiàn)，流產(chǎn)發(fā)生。所以本研究給予補(bǔ)腎健脾法代表方助孕寧Ⅱ號(hào)治療脾腎兩虛型胎動(dòng)不安。其中桑寄生、續(xù)斷、杜仲補(bǔ)益肝腎，止血安胎；熟地黃、菟絲子滋腎陰，補(bǔ)腎陽，補(bǔ)先天之本；白芍、山藥、黃芪、黨參健脾益氣，益后天之本，疏肝調(diào)肝，止腹痛之癥；阿膠、白術(shù)止血補(bǔ)血安胎。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)腎健脾法治療后pAkt、mTOR水平較治療前明顯升高,HOME-IR指數(shù)明顯下降，P、β-HCG水平顯著升高且與正常妊娠者無顯著差異。可見，補(bǔ)腎健脾法改善了PCOS-IR的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，對(duì)PCOS-IR先兆流產(chǎn)者能夠達(dá)到保胎效果。本研究pAkt、mTOR因子可作為PCOS-IR流產(chǎn)患者治療的新靶點(diǎn)。研究其通路確切機(jī)制，可促進(jìn)研發(fā)靶向作用更強(qiáng)，臨床療效更好的中西藥。

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