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    脈沖電場協(xié)同酶法制備淀粉鋅絡(luò)合物及其顯微結(jié)構(gòu)的研究

    2018-03-01 02:36:56韓忠王金花成軍虎曾新安
    現(xiàn)代食品科技 2018年1期
    關(guān)鍵詞:表面積電場水解

    韓忠,王金花,成軍虎,曾新安

    (1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣州廣東 510640)(2.廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點實驗室,廣州廣東 510640)

    多孔淀粉(porous starch)是一種新型、環(huán)境友好型的天然多孔性材料,具有原料來源廣泛、成本低、綠色環(huán)保、較大的比表面積、較低的堆積密度與良好的吸附性能等諸多優(yōu)點,被廣泛地應(yīng)用到化工工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)與農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域,引起了國內(nèi)外研究者的高度關(guān)注[1,2]。目前,用來制作多孔淀粉的原料主要是谷類淀粉和根莖類淀粉,而作為全世界尤其是亞洲地區(qū)主食之一的大米,其相關(guān)研究較少。亞洲人飲食相對而言多菜少肉,造成普遍的鋅攝入量不足、吸收不良或者遺傳缺陷;而鋅元素是人體生理功能所需量僅次于鐵排名第二的微量元素,它是機體酶的重要組成成分,間接地調(diào)控著基因的表達、免疫、細胞分化和機體生長等生命過程[3~5]。因此,從日常飲食中適當?shù)匮a充鋅元素及在食品工業(yè)中添加鋅強化劑都是必不可少的。

    高壓脈沖電場技術(shù)(Pulsed Electric Fields,PEF)是一種對兩電極間的流態(tài)食品反復(fù)施加高場強的短脈沖進行處理的技術(shù),屬于非熱物理技術(shù),能在有效保存食品天然理化性質(zhì)的同時達到滅菌的效果[6],近來又被用于大分子物質(zhì)的修飾改性、天然活性成分的提取和化學(xué)反應(yīng)強化等方面[7~10]。從化學(xué)反應(yīng)的角度來看,脈沖電場能夠有效地降低各種反應(yīng)所需的活化能,促進金屬離子的螯合效率、淀粉酯化反應(yīng)效率和美拉德反應(yīng)初級階段等[11~14]。因此,本文擬采用傳統(tǒng)環(huán)保的雙酶協(xié)同法制備具有強吸附性能的大米多孔淀粉[15],并借助高壓脈沖電場促進鋅元素與多孔的吸附絡(luò)合反應(yīng),以達到高效富集鋅元素的研究目的。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    金龍魚南方優(yōu)質(zhì)絲苗米,益海嘉里糧油食品有限公司;大米淀粉參考Lumdubwong[16]方法改進優(yōu)化制得;豬胰酶(Cat.No.P7545,活力8×USP/mg),美國Sigma-Aldrich公司;淀粉葡萄糖苷酶(Cat.No.A7095,活力300 Unit/mL),美國Sigma-Aldrich公司;乙酸鋅,廣州化學(xué)試劑廠,分析純。

    1.2 主要儀器

    SY-2-500型脈沖電場處理裝置,華南理工大學(xué)脈沖電場課題組自制;VECTOR33型紅外光譜儀,德國Bruker公司;S3700型掃描電子顯微鏡日本日立公司;日立Z-2000塞曼原子吸收分光光度儀,日本日立公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 雙酶法協(xié)同制備大米多孔淀粉

    稱取一定量大米淀粉,置于100 mL離心管中,加入一定量pH值為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(固液比1:4),置于溫度為50 ℃的振蕩水浴鍋中預(yù)熱20 min。精確移取一定配比的兩種酶加入淀粉懸濁液中,振蕩,開始計時,經(jīng)過一定時間,加入一定量4%氫氧化鈉溶液滅酶。淀粉乳離心(5000 r/min,離心10 min)后,吸取1 mL上清液于25 mL的比色管測定吸光度。下層淀粉固體用蒸餾水洗滌、離心三次(5000 r/min,離心10 min),在45 ℃的條件下干燥24 h,之后用粉碎機對淀粉進行粉碎,過100目篩,得到多孔淀粉樣品,置于封口袋中保存。

    1.3.2 淀粉水解率的測定

    吸取1 mL樣品于25 mL的比色管中,然后加入2.00 mL DNS溶液?;靹蚝?,置于沸水浴中顯色2 min,然后迅速冷卻至室溫,并用蒸餾水定容到25 mL,搖勻。用準備好的空白液(1 mL緩沖液,2 mL DNS,同上述處理)調(diào)零,在540 nm波長下用1 cm比色皿測定吸光度,計算水解率。

    式中,C-離心后上清液還原糖濃度,(mg/mL);N-樣品稀釋倍數(shù);V-反應(yīng)體系中液相體積,(mL);0.9-從葡萄糖到淀粉的轉(zhuǎn)化系數(shù);W-反應(yīng)前底物重量,(mg)。

    1.3.3 吸油率的測定

    精確稱量離心管質(zhì)量m1(g),稱取1 g左右淀粉置于離心管中,精確稱取其質(zhì)量m2(g),恒溫下與5 mL色拉油攪拌混合20 min,在5000 r/min下離心20 min,棄去上清液,精確稱量淀粉質(zhì)量為m3(g)。按以下公式計算吸油率(%):

    1.3.4 脈沖電場協(xié)同大米淀粉鋅絡(luò)合物的制備

    稱取10 g原淀粉(或多孔淀粉)與500 mL的乙酸鋅溶液(0.1 mol/L)混合于燒杯中,并置于磁力攪拌水浴鍋進行攪拌,在室溫下將懸濁液泵入到脈沖電場處理室進行處理(電壓20 V、脈寬40 μs、頻率1 kHz、流速24 mL/min,有效處理時間分別為2.88×103μs、8.64×103μs、14.4×103μs)后,將懸濁液離心(5000 r/min),棄去上清液,下層淀粉固體用蒸餾水反復(fù)洗滌并離心三次后,置于45 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h,粉碎即得大米多孔淀粉鋅絡(luò)合物樣品。

    1.3.5 淀粉鋅絡(luò)合物的鋅含量的測定

    稱取淀粉鋅絡(luò)合物約1~5 g于馬福爐中灰化,0.5 mol/L的硝酸溶液定容后進行火焰原子吸收光譜法測定。

    1.3.6 淀粉鋅絡(luò)合物結(jié)構(gòu)測定

    掃描電鏡法(SEM)、紅外光譜法(FT-IR)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 水解率與比表面積及吸油率之間的關(guān)系

    比表面積的大小決定著物質(zhì)的吸附性能,比表面積越大吸附性能就越強,秦瑩采用灰色關(guān)聯(lián)度分析,得出了可以通過水解率的測定推測比表面積的變化情況的結(jié)論[17],但是比表面積與多孔淀粉的吸附性不具有絕對的正相關(guān)性。因此,我們采用水解率和吸油率雙重指標來衡量多孔淀粉吸附性的優(yōu)劣。聶麗紅等通過測定不同水解率多孔淀粉的比表面積,探究多孔淀粉水解率與比表面積的關(guān)系以及水解率與吸油率的關(guān)系[18],其結(jié)果如圖1所示。

    圖1 水解率與吸油率及比表面積之間的關(guān)系Fig.1 Relationship between the hydrolysis rate (oil-absorption rate) and the specific surface area

    由圖1可知,隨著水解率的上升,比表面積增大,在水解率達到30%以后,比表面積呈現(xiàn)較大增長,這是由于酶解導(dǎo)致淀粉顆粒粒度減小與小孔徑增大的雙重結(jié)果,但這只能體現(xiàn)淀粉水解產(chǎn)生還原糖的量,卻不能完全體現(xiàn)成孔吸附性能的好壞。因此,我們再結(jié)合吸油率來表征多孔淀粉的吸附性能。隨著水解率的上升,形成的空腔的體積越大,多孔淀粉的吸油率上升,當水解率為50%~55%時,多孔的空腔體積達到了淀粉顆粒的一半,此時吸油率最高;在水解率接近60%的時候,多孔淀粉的吸油率呈急劇下降趨勢,意味著多孔淀粉的孔結(jié)構(gòu)出現(xiàn)崩塌,失去多孔淀粉本身穩(wěn)固的機械性質(zhì),吸附性能減弱。

    2.2 復(fù)合酶法制備大米微多孔淀粉工藝條件的優(yōu)化

    2.2.1 酶含量對水解率和吸油率的影響

    圖2 酶含量對水解率和吸油率的影響Fig.2 Effects of enzyme content on the hydrolysis rate and oil-absorption rate

    在底物濃度為20%(m/m),反應(yīng)溫度50 ℃,反應(yīng)時間12 h,pH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,酶配比(α-淀粉酶:葡萄糖苷酶)為1:12的實驗條件下,研究酶含量(0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)對水解率和吸油率的影響,結(jié)果如圖2所示。

    由圖2可知,隨著酶含量的增加,水解率不斷上升,吸油率先上升后下降,在酶含量為1.0%時,多孔淀粉水解率達到50%,孔空腔體積接近淀粉顆粒體積的一半,此時,吸油率達到最大。此后,隨著水解率的增大,吸油率呈現(xiàn)下降趨勢,與圖1結(jié)果一致,由于淀粉水解過度導(dǎo)致的多孔結(jié)構(gòu)崩塌所致,因此,制備多孔淀粉的最佳酶含量為1.0%。

    2.2.2 酶配比對水解率和吸油率的影響

    圖3 酶配比對水解率和吸油率的影響Fig.3 Effects of the enzyme ratio on the hydrolysis rate and oil-absorption rate

    在底物濃度為20%(m/m),反應(yīng)溫度50 ℃,反應(yīng)時間12 h,pH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,酶含量為1.0%的條件下,研究酶配比(α-淀粉酶:葡萄糖苷酶)對水解率和吸油率的影響,結(jié)果見圖3。

    由圖3可知,在酶配比為1:8時,水解率超出50%,淀粉結(jié)構(gòu)被破壞,吸油率較低,當酶配比為1:12時,水解率達到50%左右,多孔淀粉吸油率達到峰值。酶配比的變化導(dǎo)致水解率和吸油率的變化主要是由于兩種酶之間存在著協(xié)同作用,α-淀粉酶是采用隨機切斷糖鏈內(nèi)部的α-1,4-鏈的水解方式,當其比例較高時就容易出現(xiàn)水解過度、成孔不均的現(xiàn)象,從而導(dǎo)致多孔淀粉的吸油率降低;所以,選擇適宜的酶配比對多孔淀粉的成孔均勻性起著至關(guān)重要的作用,因此,制備多孔淀粉的最佳酶配比(α-淀粉酶:葡萄糖苷酶)為1:12。

    2.2.3 酶解時間對水解率和吸油率的影響

    圖4 酶解時間對水解率和吸油率的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time on the hydrolysis rate and oil-absorption rate

    在底物濃度為20%(m/m),反應(yīng)溫度50 ℃,酶配比(α-淀粉酶:葡萄糖苷酶)為1:12,pH 4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,酶含量為1.0%的條件下,研究處理時間(8 h、10 h、12 h和14 h)對水解率和吸油率的影響。由圖4可知,隨著酶解時間的增加,水解率逐漸增大,而吸油率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當酶解時間為12 h時,水解率為50%左右,吸油率達到峰值.當酶解時間增加到14 h時,水解率繼續(xù)增加,但吸油率已出現(xiàn)快速下降,這說明長時間的酶解導(dǎo)致多孔淀粉結(jié)構(gòu)崩塌。因此,制備多孔淀粉的最佳酶解時間為12 h。

    2.2.4 正交優(yōu)化多孔大米淀粉的制備

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用L9(33)正交試驗來考察酶含量、酶配比和酶解時間對多孔淀粉吸油率的影響,正交實驗水平因素表如表1所示。

    由表2可知,三個因素對淀粉水解率的影響主次順序依次為:酶含量>酶配比>酶解時間,最佳條件為A2B2C2,三個因素對淀粉吸油率的影響主次順序依次為:酶解時間>酶配比>酶添加量,最佳條件為A2B2C2,綜上所述,雙酶協(xié)同制備大米多孔淀粉工藝的最佳條件為A2B2C2,即酶含量1.0%,酶配比(α-淀粉酶:葡萄糖苷酶)1:12,酶解時間12 h。經(jīng)驗證實驗得:最佳條件下可制得水解率50%、吸油率96.3%的大米多孔淀粉。

    表1 正交實驗水平因素表Table 1 Orthogonal experiment level factors

    表2 正交實驗設(shè)計及實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment design and results

    2.3 脈沖電場協(xié)同制備大米多孔淀粉鋅絡(luò)合物

    圖5 不同脈沖電場處理時間對淀粉鋅絡(luò)合量的影響Fig.5 Effects of PEF treatment time on the znic content of starch-Zn complex

    由圖5可知,原淀粉本身的鋅含量非常少,且隨著電場處理時長的增加,淀粉的鋅絡(luò)合量呈現(xiàn)逐步增加的趨勢,很明顯地體現(xiàn)了脈沖電場處理對鋅絡(luò)合反應(yīng)的促進作用。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因有二,其一為電場本身的電擊穿作用導(dǎo)致的淀粉表面破損,使得參與金屬離子絡(luò)合反應(yīng)的比表面積增大;其二,脈沖電場具有產(chǎn)生瞬時高能的作用,可以促使淀粉顆粒無定型通道的張開,從而牽引鋅離子進入淀粉顆粒內(nèi)部進行絡(luò)合配位反應(yīng)。

    其中,從脈沖電場強化不同水解率的多孔大米淀粉的鋅絡(luò)合反應(yīng)來看:40%水解率、電場處理2.88 ms的多孔淀粉鋅絡(luò)合物中鋅含量最高,其次是30%水解率、電場處理8.64 ms的多孔淀粉鋅絡(luò)合物,50%水解率、電場處理2.88 ms的多孔淀粉鋅絡(luò)合物中鋅含量最低;40%水解率的多孔淀粉鋅絡(luò)合物中鋅含量都高于50%水解率淀粉的,且隨著電場處理時間的增加而減少;這是由于低水解率的多孔淀粉具有多孔吸附和高無定形區(qū)金屬離子配位點的雙重特點所致,此外高水解率的多孔淀粉孔隙結(jié)構(gòu)機械強度相對較低,在強電場作用下容易出現(xiàn)崩塌,從而導(dǎo)致其鋅離子絡(luò)合能力降低[20,21]。

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    2.4 脈沖電場協(xié)同制備大米多孔淀粉鋅絡(luò)合物的形態(tài)觀察

    圖6 掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy photographs

    時間的增加,淀粉顆粒表面變得粗糙甚至出現(xiàn)一些坑洞。圖6e~f分別為40%水解率的多孔淀粉在脈沖電場(2.88 ms和8.64 ms)協(xié)同下進行鋅絡(luò)合反應(yīng)之后的掃描電鏡圖由圖可知,酶解淀粉具有更多的空隙,這是雙酶協(xié)同水解淀粉顆粒的無定形區(qū)的結(jié)果[19],同時,比表面積的增大有助于其對鋅元素的吸附及脈沖電場的強化絡(luò)合作用。但隨著脈沖電場處理時間的增加,相同水解率的淀粉空隙出現(xiàn)部分崩塌,與結(jié)果2.3中40%水解率的多孔淀粉在脈沖電場處理下,時間越長、鋅絡(luò)合量越低相符合。

    2.5 大米多孔淀粉鋅絡(luò)合物的紅外光譜分析(FT-IR)

    圖7 大米淀粉及不同處理條件下淀粉鋅絡(luò)合物的紅外衍射圖Fig.7 Infrated diffraction patterns of rice starch and starch-Zncomplex with different treatments

    紅外光譜分析能夠有效的鑒別有機物中的官能團,圖7分別為原淀粉、原淀粉鋅絡(luò)合物、40%水解率-PEF多孔淀粉鋅絡(luò)合物,50%水解率-PEF多孔淀粉鋅絡(luò)合物的紅外光譜圖。

    淀粉的結(jié)構(gòu)特征在紅外光譜圖中的紅外吸收峰位置及結(jié)構(gòu)歸屬分別為:3377 cm-1為氫鍵締合的O-H伸縮振動,該峰寬而強;2931 cm-1為CH2的C-H不對稱伸縮振動吸收峰;1643 cm-1為H20的彎曲振動吸收峰;1340 cm-1~1500 cm-1為CH2的彎曲振動吸收峰;1150 cm-1~978 cm-1主要歸屬于淀粉各羥基的C-O伸縮振動和環(huán)醚C-O-C吸收峰;1018 cm-1、1081 cm-1和1157 cm-1分別是伯醇、仲醇和叔醇的C-O伸縮振動吸收特征峰;578 cm-1、761 cm-1和854 cm-1等處是-CH2的搖擺振動吸收特征峰。

    原淀粉、原淀粉鋅絡(luò)合物、40%水解率-PEF多孔淀粉鋅絡(luò)合物和50%水解率-PEF多孔淀粉鋅絡(luò)合物的紅外圖譜吸收峰大部分是相同的,說明基本骨架相同。與原淀粉相比,原淀粉鋅絡(luò)合物淀粉、經(jīng)脈沖電場作用的多孔淀粉鋅絡(luò)合物與乙酸鹽作用主要影響羥基伸縮振動,伯醇的C-O伸縮振動吸收特征峰移動明顯,而仲醇C-O伸縮振動吸收特征峰和叔醇C-O伸縮振動吸收特征峰變化不明顯,說明Zn與淀粉羥基相互作用,伯醇OH參與反應(yīng),仲、叔醇-OH可能參與反應(yīng)。與原淀粉相比,淀粉鋅絡(luò)合物的羥基伸縮振動變化明顯,說明鋅離子與淀粉羥基基發(fā)生反應(yīng)。

    3 結(jié)論

    3.1 以水解率和吸油率為指標,通過單因素與正交試驗得到了多孔大米淀粉最優(yōu)工藝條件:酶含量1.0%、酶配比1:12、酶解12 h,此時,多孔大米淀粉的水解率為50%,吸油率為96.3%。同時,利用脈沖電場處理強化多孔淀粉鋅絡(luò)合反應(yīng),結(jié)果顯示:水解率40%的多孔大米淀粉經(jīng)脈沖電場(2.88×103μs)處理后的鋅絡(luò)合含量最高,為352.85 mg/100 g。

    3.2 借助掃描電鏡可觀察到:酶解使淀粉呈現(xiàn)隨機性的多孔,脈沖電場進一步加強了原淀粉與30%和40%水解率淀粉多孔的形成與吸附能力,而水解率達到50%的多孔淀粉在脈沖電場的處理下會出現(xiàn)空隙崩塌,導(dǎo)致其鋅絡(luò)合量下降。紅外光譜顯示:淀粉鋅絡(luò)合物相對于原淀粉而言,羥基伸縮振動變化明顯,說明鋅離子與淀粉羥基發(fā)生了配位反應(yīng)。

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