果膠提取工藝對甜菜粕物化性質(zhì)的修飾作用研究

劉戰(zhàn)朋，郭曉明,2，皮芳，于淑娟,2,3

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）（2.華南理工大學廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全實驗室，廣東廣州 510640）（3.華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東廣州 510640）

甜菜粕含有果膠、半纖維素、纖維素等物質(zhì)[1]，是一種潛在價值巨大的加工原料。我國是世界第八大甜菜主產(chǎn)國，甜菜粕資源豐富(590萬噸/年，2012～2013)[1]。長期以來，甜菜粕的加工與開發(fā)受到了廣泛關注。針對甜菜粕中的有效成分，國內(nèi)外學者開發(fā)出甜菜果膠、半纖維素、納米纖維和甜菜堿等多種產(chǎn)品[2～4]。盡管上述多種技術方案利用了甜菜粕中的有效成分，但僅能消化部分甜菜粕，無法徹底解決二次廢粕的堆積問題。

甜菜粕的全資源化技術已成為甜菜粕加工的研究熱點。物料的組織結(jié)構(gòu)及物化性質(zhì)是影響甜菜廢粕再利用的關鍵因素。甜菜粕富含水溶性碳水化合物，具有很強的吸水性[5]。在有效成分萃取過程中，部分細胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)溶解于提取液中，從而形成粘稠的漿液，降低了傳質(zhì)的效率[6]。另一方面，甜菜粕吸水后體積膨脹，更增加了分離、干燥等單元操作的作業(yè)難度。

當前，甜菜果膠是甜菜粕深加工的熱點[7,8]，其副產(chǎn)物的綜合利用也因而備受關注。甜菜果膠以螯合劑、稀酸、稀堿為提取溶劑[9]，在不同溶劑的作用下，最終形成結(jié)構(gòu)各異的二次廢粕[10]。然而，關于果膠提取工藝如何修飾甜菜粕的物化性質(zhì)，卻鮮有報道。

基于此，本文以甜菜粕為研究對象，研究螯合劑、稀酸對甜菜粕的修飾作用，旨在揭示甜菜粕結(jié)構(gòu)、形貌在果膠提取過程中的變化規(guī)律，并為甜菜廢粕再利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

甜菜粕；95%乙醇、鹽酸、濃硫酸、草酸銨、三氟乙酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸為分析純；鼠李糖、半乳糖、木糖、果糖，均為分析純，上海伯奧生物科技有限公司；阿拉伯糖≥98%，美國Sigma-Aldrich Chemical公司；RapidaseC80果膠酶，荷蘭DSM公司產(chǎn)品；牛血清蛋白，上海伯奧生物科技有限公司；考馬斯亮藍G250，上海伯奧生物科技有限公司；三苯基苯酚顯色劑，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 實驗儀器與設備

多功能光電子能譜儀，Kratos Axis Ulra DLD，英國Kratos公司；X射線多晶衍射儀，德國Bruker公司；傅里葉變換紅外光譜儀，VERTEX70，德國Bruker公司；ICS-5000陰離子交換色譜系統(tǒng)，配備電化學檢測器（ED50），美國Dionex公司；高效液相色譜，美國沃特世公司；GR22高速冷凍離心機，株式會社日立制作所；數(shù)顯pH計，F(xiàn)E20，瑞士Mettler-toledo公司生產(chǎn)；BSA1245-CW分析天平，德國賽多利斯集團生產(chǎn)；冷凍干燥機，SeienTZ-18N，寧波斯芝生物科技股份有限公司；高速萬能粉碎機，F(xiàn)W100，天津市泰斯特儀器有限公司；紫外可見分光光度計，TU1901，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 連續(xù)提取方法

圖1 實驗流程圖Fig.1 The principal flow chart of experiment

參考Yapo等人[11]的方法，依次采用螯合劑、稀酸溶液處理甜菜粕（如圖1所示）。首先，將甜菜粕浸泡在0.5%的草酸銨溶液中，浸泡參數(shù)為：料液比1:25、溫度80 ℃、浸泡時間1 h、攪拌速度250 r/min；浸泡結(jié)束后，用400目微孔濾布將液渣分離，殘渣標記為粕-CSA1，而上清液則依次經(jīng)離心(10000 g×15 min)、醇析、干燥（45 ℃，12 h）處理，所得果膠標記為CSA-1；重復用草酸銨溶液浸提一遍，分別得果膠CSA-2和粕-CSA2。由于粕-CSA2殘留部分草酸銨，故用蒸餾水將粕-CSA2沖洗5遍；隨后，將粕-CSA2分散在蒸餾水中，用H2SO4調(diào)節(jié)pH到1.5，80 ℃處理1 h，得到果膠LS-1和粕-LS1；采用相同工藝參數(shù)，重復用稀硫酸溶液浸提3次，分別得到果膠LS-2和粕-LS2、果膠LS-3和粕-LS3、果膠LS-4和粕-LS4。

1.3.2 果膠成分測定及其甜菜粕形貌表征

1.3.2.1 半乳糖醛酸（GalA）的測定

采用紫外可見分光光度計法[12]測定半乳糖醛酸的含量。

半乳糖醛酸標準曲線：稱取半乳糖醛酸標品5 mg溶于去離子水，定容至100 mL，分別取40、120、240、360、400 μL標品到10 mL帶塞消化管中，冰水浴條件下加入2.5 mL濃硫酸，混合均勻后置于沸水浴中5 min使其多糖完全水解。隨后加入50 μL顯色劑，空白樣加入50 μL 0.5% NaOH溶液，混合均勻后，靜置一段時間，以兩個空白樣品校零，520 nm波長下測定吸光度。

繪制標準曲線：y=0.0289x+0.0231

式中：y為吸光度；x為D-半乳糖醛酸的含量（μg），R2=0.9995。

果膠樣品中GalA的測定：稱取5 mg果膠樣品，溶解并定容至100 mL。取400 μL樣品于10 mL具塞試管中，其余步驟同上，每個樣品做三次平行。

1.3.2.2 中性糖含量測定

參照Garna[13]等人的方法：用高效陰離子交換色譜分析。稱取10 mg果膠樣品于密封消化管中，加入2 mL果膠酶溶液（E.C.3.2.1.15.，日本Amano公司），置于45 ℃水浴中24 h。再加入2 mL、4 mol/L的三氟乙酸（TFA），120 ℃油浴酸解2 h，立即冷卻后加7 mol/L氨水調(diào)節(jié)pH至9.0左右，用去離子水定容至100 mL。水水解液過0.22 μm濾膜后，注射入高效陰離子交換色譜（HPAEC）系統(tǒng)（ICS-5000，Dionex Corp，USA）。色譜條件：色譜柱：CarboPac PA1（4×250 mm）和CarboPac PA1保護柱（4×50 mm）；檢測器：電化學檢測器（ED50）；流動相：100 mmol/L NaOH；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：25 μL；淋洗條件：0～25 min，16 mmol/L NaOH，25～35 min，500 mmol/L NaOH。數(shù)據(jù)經(jīng)Chromeleon 7.2軟件采集、分析后，繪制色譜曲線。

1.3.2.3 FT-IR圖譜分析

凍干后的甜菜粕粉碎后過100目篩，取適量粉末樣品(4 mg)與溴化鉀(200 mg)壓片，采用Vector33測定其紅外吸收圖譜，掃描波數(shù)為4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.2.4 X射線衍射圖譜分析

取凍干后的甜菜粕樣品，以未處理甜菜粕為對照，粉碎后過100目篩，用X射線多晶衍射儀掃描0 °～70 °角度范圍的X射線吸收強度。測定甜菜粕內(nèi)部結(jié)晶度的變化。

相對結(jié)晶度分析參考Nishiyama[14]等的方法，計算公式如下：

上式中，I22°為2θ角為22 °處的衍射強度；I18°為2θ角為18 °處的衍射強度。

1.3.2.5 掃面電鏡（EDS-SEM）分析

取六種處理方式的甜菜粕，以未處理甜菜粕為對照，將樣品用導電雙面膠固定在載物臺上。樣品鍍金后，在20 kV加速電壓下觀察其表面形貌。

1.3.2.6 密度指數(shù)測定

甜菜粕樣品粉碎、過100目篩后，取適量樣品裝入1 mL的離心管，填充至刻度，稱重。每個樣測5次平行，取平均值。

上式中，m1為樣品與離心管的質(zhì)量，g；m0表示離心管的重量，g；V代表樣品填充的體積，mL。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

除非另行注明，提取或樣品測試平行操作3次，所有數(shù)據(jù)表示為“平均值±平均偏差”；數(shù)據(jù)采用origin 9.1作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同處理方式對甜菜粕FT-IR圖譜的影響

圖2 不同處理紅外吸收光譜的影響Fig.2 Influence of different treatments on the FTIR spectra

如圖2所示，甜菜粕能吸收3800～2500 cm-1、1800～400 cm-1內(nèi)的紅外光，這些光譜信號屬于植物多糖的典型紅外光譜特征。甜菜粕在3422、2930、1746、1637 cm-1處的吸收峰分別對應于OH-、C-H、C-O及COO-的伸縮振動[15,16]。盡管甜菜果膠與甜菜粕具的紅外光譜極為相似，但甜菜果膠在2930 cm-1的吸收強度相對較弱。甜菜粕在溶劑的處理下，結(jié)構(gòu)發(fā)生不同的變化。依次經(jīng)2次草酸銨處理、1次硫酸處理后，C-H伸縮振動強度未發(fā)生顯著的變化（圖2a）。然而，當硫酸提取2次后，甜菜粕在2930 cm-1處的吸收峰強度顯著增強（圖2a）。由于甜菜果膠在2930 cm-1的吸收強度很低，故甜菜粕中果膠的含量的減少反而有助于增強C-H在2930 cm-1處的振動強度。FT-IR分析結(jié)果表明，甜菜果膠的減少可能是引起甜菜粕2930 cm-1處吸收峰增強的原因。

2.2 甜菜粕的XRD衍射圖譜及相對結(jié)晶度

圖3 不同處理方式甜菜粕XRD衍射圖譜及相對結(jié)晶度Fig.3 Effects of different treatments on the X-ray diffraction spectra of sugar beet pulp and their relative crystallinity

纖維素是一類具有晶體結(jié)構(gòu)的多糖，而半纖維素、果膠則為不定形結(jié)構(gòu)。甜菜粕由纖維素、半纖維素、果膠組成，纖維素的相對含量將決定甜菜粕X射線圖譜的特性。如圖3a所示，在衍射角7.5～27.5 °內(nèi)，甜菜粕（對照）在16 °、22 °處具有2個衍射峰；22 °處的衍射峰較強，該衍射峰也是纖維素I的衍射特征[13]。圖3a～b中的X衍射圖譜與Li等人[3]報道的結(jié)果一致。依次經(jīng)草酸銨提取2遍、硫酸提取1遍后，不僅X衍射圖譜未發(fā)生顯著變化，甜菜粕的結(jié)晶度也基本保持不變(圖3c)。然而，隨著硫酸提取次數(shù)的增加，甜菜粕在衍射角為12.5～25 °內(nèi)的吸收強度逐漸升高（圖3b），進而導致相對結(jié)晶度也逐漸增大(圖3c)。對照樣品的相對結(jié)晶度為22.5%，而粕-LS4的相對結(jié)晶度升至44.5%，相對于對照樣增加了將近1倍。

XRD衍射圖譜的變化間接表明，隨著酸提取次數(shù)的增加，甜菜粕中纖維素的相對含量逐漸升高。甜菜粕中纖維素得到富集的原因主要有兩方面：(1)甜菜粕果膠分次溶解于稀酸溶液中；(2)在熱酸作用下，部分半纖維素也可能溶解于提取溶劑中。

2.3 不同處理方式對甜菜粕形貌的影響

圖4 不同處理方式甜菜粕掃面電鏡圖Fig.4 Morphologies of sugar beet pulp with different treatments

如圖4所示，提取溶劑對甜菜粕的結(jié)構(gòu)、形貌具有顯著的影響。初始甜菜粕（圖4a）具有致密的結(jié)構(gòu)，表面為不規(guī)則的粗糙褶皺。甜菜粕具有一定的持水性[5]，其吸水后體積發(fā)生溶脹。為了防止熱風干燥對甜菜粕形貌及結(jié)構(gòu)的影響，本文將吸水后的甜菜粕進行冷凍干燥，再觀察甜菜粕吸水后的質(zhì)地及形貌特征。如所示圖4b，凍干甜菜粕導致密度下降，表面轉(zhuǎn)變?yōu)楦叩筒黄?、疏松、不?guī)則的形貌。經(jīng)草酸銨溶液浸泡1遍后，甜菜粕質(zhì)地更加疏松，其表面具有類似于“中空”的結(jié)構(gòu)(圖4c)。這些孔洞可能是水分升華后形成的“通道”，其為提取溶劑滲透到甜菜粕內(nèi)部創(chuàng)造了有利條件。從圖4b與4c可以看出，草酸銨對甜菜粕質(zhì)地產(chǎn)生實質(zhì)的影響。草酸銨第2次提取后，甜菜粕表明的孔洞變大(圖4d)。再經(jīng)硫酸浸泡1次數(shù)后，與原先的甜菜粕相比(圖4d)，甜菜粕表面的孔洞變淺，同時也更趨向于橢圓形(圖4e)；這種形貌變化可能與甜菜粕表面的果膠被溶解有關。隨著硫酸浸泡的次數(shù)的增加，甜菜粕形貌未發(fā)生更顯著的變化。

2.4 不同處理方式甜菜粕能譜分析

圖5 不同提取溶劑對甜菜粕能譜圖的影響Fig.5 Effects of different extractants on the energy dispersive Spectra of sugar beet pulp

不同甜菜粕的能譜圖如圖5所示。本小節(jié)重點分析提取溶劑對甜菜粕Ca2+含量的影響。初始甜菜粕的Ca2+含量為1.28%。如圖5中的Ca2+分布圖所示，Ca2+在甜菜粕中具有隨機分布的特點，沒有表現(xiàn)出特定的規(guī)律。經(jīng)草酸銨提取2遍后，Ca2+含量下降為0.81%，表明草酸銨能螯合甜菜粕中的部分Ca2+。Ca2+是細胞壁的結(jié)構(gòu)物質(zhì)之一，其含量下降也表明甜菜粕細胞壁遭受到一定程度的破壞。再經(jīng)硫酸提取1遍后，甜菜粕中未能檢出Ca2+，表明稀酸溶液對Ca2+具有很強的溶解能力。雖然Ca2+已經(jīng)去除，但甜菜粕中仍殘留部分果膠(表1)，這表明部分甜菜果膠與Ca2+不存在相互作用。

2.5 密度指數(shù)

圖6 不同甜菜粕的密度指數(shù)Fig.6 Density indexes of different sugar beet pulps

不同提取溶劑、提取次數(shù)對甜菜粕的密度指數(shù)具有顯著的影響(圖6)。在本文中，密度指數(shù)與甜菜粕的持水力成正比；甜菜粕的吸水性越強，質(zhì)地越疏松，密度也相應越小。初始甜菜粕的密度指數(shù)最大，這與SEM分析結(jié)果一致(圖4a)。經(jīng)草酸銨處理后，甜菜粕密度指數(shù)開始下降，下降的幅度與草酸銨浸泡次數(shù)成正比。隨后，再經(jīng)硫酸提取1遍后，甜菜粕的密度指數(shù)降至最低（0.173 g/mL）。該結(jié)果表明，經(jīng)硫酸1次浸泡后，甜菜粕的體積充分溶脹。然而，經(jīng)硫酸提取次數(shù)2遍后，甜菜粕密度指數(shù)開始升高至0.286 g/mL。進一步增加硫酸提取次數(shù)至4時，甜菜粕的密度指數(shù)略微上升(0.299 g/mL)。纖維素不僅能形成致密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，其分子量也較果膠、半纖維素大。因此，在硫酸分步提取過程中，甜菜粕密度指數(shù)的升高主要是纖維素比重的升高所致。

2.6 六種果膠成分分析

如表1所示，因提取條件而異，甜菜果膠的得率介于0.6～4.7%之間。CSA-1、CSA-2的提取率分別為2.0、0.6%，兩者占總果膠得率的16.6%。張海燕等[1]研究甜菜果膠的螯合劑法提取工藝，發(fā)現(xiàn)甜菜果膠的提取率為9.5～20.9%。但在本文中，CSA-1、CSA-2的得率之和僅為2.6%，這種差異可能與螯合劑的種類有關。酸溶性甜菜果膠占總果膠得率的83.4%，隨著硫酸提取次數(shù)的增加，果膠得率從4.7%逐漸下降為2.4%。

盡管提取溶劑、提取次數(shù)不同，但所有甜菜果膠均富含半乳糖醛酸、中性單糖(表1)。以草酸銨為提取試劑時，甜菜果膠半乳糖醛酸、中性糖分別為75.2～78.5%、21.5～24.5%。CSA-1與CSA-2的中性糖組成相似，兩者的阿拉伯糖（10.8～10.9%）、鼠李糖（1.8～2.0%）、木糖（0.8～1.1%）含量接近，但CSA-1的半乳糖（8.0%）及葡萄糖（3.2%）含量較高。與溶解于草酸銨的甜菜果膠相比，酸溶性甜菜果膠的半乳糖醛酸含量較低，而中性糖含量性對較高。以硫酸為提取溶劑時，不同成分隨提取次數(shù)表現(xiàn)出不同變化趨勢。隨著提取次數(shù)的增加，鼠李糖（4.4～7.8%）、半乳糖（11～14.4%）、木糖（0.9～1.6%）總體呈上升趨勢，而阿拉伯糖（13.1～5.4%）卻逐漸下降。由于阿拉伯糖單元間的糖苷鍵在酸性條件下容易水解[17]，故阿拉伯糖的下降可能與長時間熱酸處理有關。另一方面，半乳糖醛酸、葡萄糖含量與提取次數(shù)間沒有顯著的相關性，其含量分別為69.7～71%、0.3～1.0%。

研究證實，草酸銨、稀酸溶液對甜菜果膠的品質(zhì)具有顯著的影響[18]。為了解釋草酸銨與稀酸處理對甜菜果膠的影響，本文還分析了不同甜菜果膠中半乳糖醛酸與鼠李糖的摩爾比(表1)。半乳糖醛酸與鼠李糖的摩爾比越低，表明甜菜果膠側(cè)鏈相對含量越高；反之亦然[19]。如表1所示，對于草酸銨提取的果膠而言，其半乳糖醛酸/鼠李糖摩爾比為38.4～43.3，顯著高于稀酸提取的果膠(9.0～15.9)?？梢?，稀酸更有利于溶解富含側(cè)鏈的甜菜果膠。

另一方面，隨著稀酸提取次數(shù)的增加，半乳糖醛酸/鼠李糖摩爾比逐漸下降；從而間接表明“甜菜果膠側(cè)鏈越豐富，其對稀酸的耐受能力越高”。這可能是由于部分甜菜果膠(富含側(cè)鏈)與纖維素等細胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)間存在強作用關系，需要稀酸反復浸泡才足以將這部分甜菜果膠從甜菜粕中釋放出來。

表1 不同甜菜果膠的得率及化學組成Table 1 Extraction yields and chemical compositions of different sugar beet pectins

3 結(jié)論

本文研究草酸銨、稀硫酸對甜菜粕結(jié)構(gòu)的修飾作用。草酸銨能螯合甜菜粕中的部分Ca2+，并釋放部分甜菜果膠，導致甜菜粕形成疏松多孔狀的表面，但并未改變甜菜粕的相對結(jié)晶度。硫酸對Ca2+及甜菜果膠具有更強的溶解能力，隨著硫酸浸泡次數(shù)的增加，甜菜粕的密度指數(shù)先下降后升高，而相對結(jié)晶度則逐漸升高。以上研究結(jié)果表明，草酸銨對甜菜粕的修飾作用有限，而稀酸處理能使甜菜粕發(fā)生實質(zhì)性的結(jié)構(gòu)變化。甜菜果膠產(chǎn)生的二次廢粕富含纖維素，其可作為一種潛在的纖維素基材料。

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