葡萄籽原花青素提取物對砷誘導(dǎo)人肝細胞HL-7702損傷的保護作用及其機制

徐孟川，李述剛*，丁玉松，牛 強，馮剛玲，申 卉，郭方明

無機砷是一種自然界廣泛存在的環(huán)境污染物。全球約有1.4億 人的健康受到砷暴露的威脅[1]。研究發(fā)現(xiàn)，砷可以導(dǎo)致肝臟纖維化、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及多系統(tǒng)腫瘤等[2]。研究顯示，肝臟是砷毒性作用的重要靶器官之一，砷進入機體后在肝臟蓄積，可引起肝纖維化、肝硬化甚至是肝癌[3]。目前認為，砷導(dǎo)致機體發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）并破壞機體抗氧化防御系統(tǒng)[4]。核因子E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）是細胞對抗氧化應(yīng)激的重要調(diào)控因子之一[5]。研究表明，砷可以抑制Nrf2的表達，減弱抗氧化反應(yīng)[6-7]。原花青素是一種具有極強的自由基清除能力及抗氧化功效的多酚類物質(zhì)[8-9]，能有效降低人體血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性和機體的總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）[10-11]。原花青素能有效清除多種ROS，具有抗氧化[12]、抗炎[13]、保護心血管[14]、抗腫瘤[15]和降血糖[16]等多方面的生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄尤其是葡萄籽中含有較為豐富的原花青素[17]。

但是關(guān)于葡萄籽原花青素提取物（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）能否拮抗砷導(dǎo)致的肝細胞HL-7702的氧化損傷及其分子機制鮮見報道。本研究以肝細胞HL-7702為對象，給予As2O3染毒，并施加GSPE進行干預(yù)，分析As2O3對HL-7702細胞毒性作用，評價GSPE對As2O3致HL-7702肝細胞毒性的拮抗效果，探討其可能作用機制，為砷中毒防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

As2O3（分析純） 北京化工廠；GSPE（純度＞95.0%） 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；人肝細胞HL-7702（培養(yǎng)箱中培養(yǎng)） 上海和元生物技術(shù)股份有限公司。

天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，A S T）試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（a l a n i n e aminotransferase，ALT）試劑盒、蛋白標準測定試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、SOD試劑盒、T-AOC試劑盒和MDA試劑盒 南京建成生物工程研究所；Nrf2檢測抗體、血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）檢測抗體、醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）檢測抗體、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）檢測抗體 英國Abcam公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶 美國Gibco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Galaxy 170S二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 德國Eppendorf公司；SW-CJ-2FD超凈臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；倒置相差顯微鏡、Varioskan Flash酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；EDC-810聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；JY300水平電泳儀、JY02S紫外-可見光分析儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

人肝細胞HL-7702常規(guī)培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清（體積分數(shù)，下同）、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素），在飽和濕度、5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后用0.25 g/100 mL胰蛋白酶消化傳代。取處于對數(shù)生長期的細胞，隨機分為7 組：對照組（正常培養(yǎng)）、砷染毒組（25 μmol/L砷溶液）、GSPE干預(yù)組（As＋G1組：5 mg/L的GSPE溶液、25 μmol/L砷溶液；As＋G2組：10 mg/L的GSPE溶液、25 μmol/L砷溶液；As＋G3組：25 mg/L的GSPE溶液、25 μmol/L砷溶液；As＋G4組：50 mg/L的GSPE溶液、25 μmol/L砷溶液）、GSPE單獨干預(yù)組（50 mg/L的GSPE溶液）。配制1 000 μmol/L的As2O3母液以及1 000 mg/L的GSPE母液備用，染毒時用完全培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度，加入細胞培養(yǎng)皿中，分別處理24 h和48 h后，檢測各項指標，每組重復(fù)測3 次。

1.3.2 指標檢測

1.3.2.1 細胞活性檢測

人肝細胞HL-7702培養(yǎng)于96 孔板中，待細胞密度增至80%，用不同濃度的砷（0.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μmol/L）對細胞進行干預(yù)。24、48 h后，用噻唑藍（3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT）試劑盒進行細胞活性的檢測。

1.3.2.2 氧化應(yīng)激及肝功能指標檢測

按照上述分組對細胞干預(yù)2 4 h和4 8 h后，0.25 g/100 mL胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集細胞沉淀，在液氮反復(fù)凍融3～5 次以破碎細胞。分別按照相應(yīng)試劑盒說明書的操作方法進行檢測：硫代巴比妥酸法測定MDA含量、微量酶標法測定GSH含量、WST-1法測定SOD活力、比色法測定T-AOC水平、考馬斯亮藍法測定蛋白含量、賴氏法測定ALT以及AST活力。

1.3.2.3 mRNA及蛋白表達檢測

表1 RT-PCR引物設(shè)計Table 1 Primer sequences for RT-PCR

利用逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）-PCR和Western Blot法分別檢測細胞內(nèi)Nrf2、GST、HO-1、NQO1的mRNA和蛋白表達情況，具體檢測方法參照文獻[18]。細胞中待測蛋白的表達水平用其條帶的總灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶的總灰度值的相對比值大小表示。RT-PCR引物設(shè)計見表1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，檢驗水平α＝0.05。各組實驗數(shù)據(jù)均以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞活性變化

圖1 不同濃度砷對細胞存活率的影響Fig. 1 Effect of arsenic on the survival rate of cells

MTT實驗發(fā)現(xiàn)（圖1），當As2O3單獨作用于細胞24 h后，與對照組相比，2.5 μmol/L時細胞活性顯著增加，大于25.0 μmol/L時細胞活性明顯降低（P＜0.05）。As2O3單獨作用于細胞48 h后，10.0 μmol/L時細胞活性開始顯著下降，趨勢與24 h基本一致。

2.2 細胞氧化應(yīng)激水平及肝功能變化

由表2可知，砷染毒24 h和48 h后，與對照組比較，砷染毒組細胞內(nèi)SOD活力、GSH含量、T-AOC水平明顯降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）；與砷染毒組相比，GSPE干預(yù)組隨著GSPE質(zhì)量濃度升高，細胞內(nèi)SOD活力、GSH含量、T-AOC水平逐漸升高，而MDA含量逐漸下降；與對照組相比，GSPE單獨作用24 h和48 h后，MDA含量升高，而GSPE單獨作用48 h后，T-AOC水平增強，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。GSPE干預(yù)組與砷染毒組相比，隨著GSPE質(zhì)量濃度上升，ALT及AST活力逐漸降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；GSPE單獨干預(yù)組與對照組比較，總體上無明顯差異。

表2 As2O3與GSPE作用24、48 h對HL 7702肝細胞氧化應(yīng)激水平以及肝功能的影響（n＝ 3）Table 2 Changes in oxidative stress and liver function induced by arsenic and GSPE in HL 7702 cells after 24 and 48 h (n= 3)

2.3 細胞內(nèi)Nrf2及其下游基因mRNA表達變化

表3 干預(yù)24 h和48 h后Nrf2及其下游mRNA表達情況（n＝ 3）Table 3 mRNA expression of Nrf2 and its downstream genes after 24 and 48 h treatment (n= 3)

由表3可知，與對照組相比，砷染毒組Nrf2、HO-1、NQO1、GST的mRNA表達明顯降低，并且染毒48 h要低于染毒24 h；施加GSPE進行干預(yù)后，與砷染毒組比較，Nrf2、HO-1、NQO1、GST的mRNA表達量隨著GSPE質(zhì)量濃度的升高而逐漸上升，其中As＋G3組和As＋G4組均差異顯著（P＜0.05）。單獨施加高劑量GSPE后，與對照組比較，Nrf2、HO-1、NQO1、GST的mRNA表達量無明顯變化。

2.4 細胞內(nèi)Nrf2及其下游基因蛋白表達變化

圖2 Nrf2及其下游基因蛋白電泳圖Fig. 2 Protein electrophoresis of Nrf2 and its downstream genes

由圖2、3可知，與對照組相比，砷染毒組Nrf2、HO-1、NQO1、GST蛋白表達明顯降低，并且染毒48 h要低于染毒24 h；施加GSPE進行干預(yù)后，與砷染毒組比較，Nrf2、HO-1、NQO1、GST蛋白表達量隨著GSPE質(zhì)量濃度的升高而逐漸上升；單獨施加高劑量GSPE后，與對照組比較，Nrf2、HO-1、NQO1、GST蛋白表達量無明顯變化。

圖3 Nrf2及其下游基因蛋白表達量變化Fig. 3 Protein expression of Nrf2 and its downstream genes

3 討 論

砷是一種已確定的人類致癌物。研究發(fā)現(xiàn)，砷中毒可以引起肝臟纖維化、肝硬化，嚴重者甚至會發(fā)生肝癌。因此，探討拮抗砷的肝臟毒性作用對于砷中毒防控具有重要意義。

通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)，低劑量（0.0～2.5 μmol/L）砷在短時間（24 h）內(nèi)可刺激肝細胞的生長。另外有研究表明，低劑量砷可以活化肝星狀細胞[19]，進而導(dǎo)致肝臟纖維化。而高濃度的砷則具有明顯的細胞毒性，導(dǎo)致肝細胞活性顯著降低（P＜0.05）。通過檢測肝細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平發(fā)現(xiàn)，砷使細胞內(nèi)SOD活力、GSH含量下降，MDA含量上升，進一步導(dǎo)致細胞T-AOC水平下降，與Singh[20]和Kumar[21]等研究一致。這可能是因為砷引起肝細胞氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過多的ROS，消耗細胞內(nèi)的SOD以及GSH，ROS導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA；另一方面，GSH含有巰基，能與三價砷結(jié)合形成復(fù)合物，也會對其產(chǎn)生消耗；此外，砷需要被甲基化才能被排出體外，而砷的甲基化過程也需要GSH的參與。ALT、AST是常被用于評價肝功能的指標，砷染毒組細胞內(nèi)ALT、AST水平明顯高于對照組，說明砷可以引起肝功能損傷。

大量研究表明原花青素具有較強的抗氧化活性[22-23]。本次研究也發(fā)現(xiàn)，施加GSPE干預(yù)后，與砷染毒組比較，細胞內(nèi)SOD活力、GSH含量明顯升高，而MDA含量顯著降低（P＜0.05）。說明GSPE具有良好的抗氧化效果，且具有一定的劑量關(guān)系。當GSPE質(zhì)量濃度為50 mg/L時，能明顯改善砷對肝細胞造成的氧化損傷。GSPE單獨干預(yù)組與砷染毒組相比，ALT、AST水平顯著降低，提示GSPE對砷引起的肝功能損傷具有一定的保護作用；但是，與對照組相比，GSPE單獨干預(yù)組細胞氧化應(yīng)激水平以及肝功能總體上并無明顯差異，這可能是由于當機體處于正常狀態(tài)時，并不需要GSPE的抗氧化能力，但是當機體受到氧化刺激的時候，GSPE則發(fā)揮其生物學(xué)活性，提高機體的抗氧化能力；這也表明高劑量（50 mg/L）的GSPE并不會對肝細胞造成損傷，是一種比較安全的抗氧化劑。

Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）信號通路是機體抵抗外界氧化和化學(xué)刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[24]。Nrf2可以調(diào)控多種抗氧化酶（如GST、HO-1、NQO1）的表達[25]，從而提高機體的抗氧化能力。本次研究發(fā)現(xiàn)，砷染毒組細胞中Nrf2、HO-1、NQO1以及GST的mRNA和蛋白的表達量均明顯降低，與Shafik[26]、Rodriguez-Ramiro[27]等研究一致，說明砷可能是通過Nrf2信號通路抑制下游各抗氧化酶的表達來降低機體的抗氧化能力，進一步對肝細胞造成氧化損傷。與砷染毒組相比，GSPE干預(yù)組細胞中Nrf2、HO-1、NQO1以及GST的mRNA和蛋白的表達量均有所上升，與Gao Shuang等[28]研究一致。這可能是因為當機體受到刺激時，GSPE促使Nrf2與Keap1解離并進入細胞核[29]，與DNA上的ARE元件結(jié)合[30]，進而誘導(dǎo)其下游的HO-1、NQO1、GST等抗氧化酶的表達，發(fā)揮其抗氧化作用。

綜上所述，GSPE對砷引起的細胞氧化損傷具有明顯的抑制作用，能夠改善砷導(dǎo)致的肝功能損傷，且具有一定的劑量關(guān)系，其最佳作用質(zhì)量濃度在25～50 mg/L之間。原花青素的作用機制可能是通過活化Nrf2信號通路，進而抑制砷所致的肝臟氧化損傷。但是，GSPE調(diào)節(jié)Nrf2的確切機制尚需大量研究證實，進而為砷中毒的防治提供科學(xué)依據(jù)。

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