蘿卜籽粕蛋白質(zhì)的組成及功能性質(zhì)

趙功玲，梁新紅，郭延成，孔 瑾*，李柯柯，康超娣，時翠萍

蘿卜為十字花科植物，在中國已有2 700多年的栽培歷史，是我國城鄉(xiāng)居民的大眾化蔬菜，其成熟的種子——蘿卜籽又名萊菔子、蘿白子、菜頭子等。中醫(yī)認(rèn)為干燥成熟的蘿卜籽，具有多種藥理功效，可調(diào)節(jié)老化的皮膚，防止皺紋的產(chǎn)生，并且還具有祛斑和改善膚色等美容功效[1-3]。現(xiàn)代研究表明，蘿卜籽中含有豐富的異硫氰酸鹽，在異硫氰酸鹽的種類中，萊菔素的含量最高，約占總異硫氰酸鹽的60%以上，有很強(qiáng)的抗氧化活性[4-6]；蘿卜籽中含油量可達(dá)45%，且油脂質(zhì)量優(yōu)良，是生產(chǎn)食用油的優(yōu)良原料[7-9]。和許多油料種子如大豆、油菜籽等相同，蘿卜籽中蛋白質(zhì)的含量也很高[10]，且蛋白品質(zhì)優(yōu)良，有很好的應(yīng)用價值及前景[11]。在我國優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)資源匱乏的情況下，把生產(chǎn)蘿卜籽油的副產(chǎn)品——蘿卜籽粕作為肥料使用，甚是可惜。

本研究擬采用堿溶酸沉法提取脫脂蘿卜籽餅粕中的蛋白質(zhì)，研究提取出的粗蛋白的組成、功能性質(zhì)、抗氧化性能，以期揭示蘿卜籽粕蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成和功能特性之間的關(guān)系，為蘿卜籽餅粕蛋白質(zhì)的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘿卜籽粕：亞臨界萃取油脂后的殘渣，經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎，避光低溫保存?zhèn)溆茫淮蠖沟鞍追蹫槭惺邸?/p>

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；對氨基苯磺酸鈉、鹽酸萘乙二胺、NaNO2、鄰二氮菲、FeSO4、H2O2、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 北京化工廠；無水乙醇、濃硫酸、硼酸、硫酸鉀、硫酸銅、氫氧化鈉、鹽酸 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速粉碎機(jī) 浙江武義縣屹立工具有限公司；恒溫磁力攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī) 北京松原華興科技發(fā)展有限公司；320P-063-Star型pH計 美國奧立龍公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任；TDL-5-A低速大容量離心機(jī) 北京安亭科學(xué)儀器廠；L8800氨基酸分析儀日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 蘿卜籽粕蛋白質(zhì)的制備方法

按料液比1∶50（m/V）的比例將蘿卜籽粕粉與水混合，調(diào)pH值至10，60 ℃下攪拌90 min后，11 000 r/min離心6 min，取上清液調(diào)pH值至4.5，靜置30 min后，11 000 r/min離心6 min，去上清液，冷凍干燥沉淀，獲得干燥蛋白質(zhì)粉。在此提取條件下，蘿卜籽粕中蛋白質(zhì)提取率可達(dá)80.2%，蛋白質(zhì)純度為89.5%。

1.3.2 蘿卜籽粕蛋白組分分離方法

采用Osborne法[12-13]分離蛋白質(zhì)組分。取10 g蘿卜籽粕蛋白質(zhì)，依次用蒸餾水、3% NaCl溶液、70%乙醇溶液和0.2% NaOH溶液分別提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。

1.3.2.1 清蛋白的提取

準(zhǔn)確快速稱取一定量的蘿卜籽粕蛋白質(zhì)于預(yù)冷的研缽中，加少量蒸餾水和石英砂研磨成勻漿，用10 倍體積的蒸餾水分幾次將勻漿液轉(zhuǎn)移至三角瓶中，置于磁力攪拌器上低溫攪拌提取1 h，4 ℃、11 000 r/min離心10 min，殘渣用相同的方法重復(fù)提取2 次。合并上清液，調(diào)pH值至4.5，以下按1.3.1節(jié)中方法制備干燥清蛋白粉，并稱質(zhì)量。

1.3.2.2 球蛋白的提取

用3% NaCl溶液作溶劑，按照1.3.1節(jié)中方法，制取提取清蛋白后殘渣中的球蛋白，稱質(zhì)量。

1.3.2.3 醇溶蛋白的提取

用70%乙醇溶液作溶劑，按照1.3.1節(jié)中方法，制取提取球蛋白后的殘渣中的醇溶蛋白，稱質(zhì)量。

1.3.2.4 谷蛋白的提取

用0.2% NaOH溶液作溶劑，按照1.3.1節(jié)中方法，制取提取醇溶蛋白后的殘渣中的谷蛋白，稱質(zhì)量。以提取出的4 種蛋白為總蛋白質(zhì)量，分別計算谷蛋白、清蛋白、醇溶蛋白及球蛋白占蘿卜籽粕蛋白質(zhì)的百分比。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測定方法

參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》的方法，采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的含量，蛋白質(zhì)換算系數(shù)取6.25。

1.3.4 蛋白質(zhì)氨基酸組成測定方法及蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值評價

用氨基酸自動分析儀，按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》方法測定氨基酸含量。色氨酸按照NY/T 57—1987《谷物籽粒色氨酸測定法》方法測定。

蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值評價：采用FAO/WHO氨基酸評分法（1973）評價[14]。

按照公式（1）計算出8 種必需氨基酸的評分（amino acid score，AAS），以最低分記為該蛋白質(zhì)的AAS。

1.3.5 蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)分析

[15-16]，測定蛋白質(zhì)的溶解性、水合能力、吸油能力、乳化性（emulsifying activity index，EAI）、乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability index，ESI）、起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

1.3.5.1 溶解性的測定

準(zhǔn)確稱取1.0 g蘿卜籽粕蛋白質(zhì)，加入50 mL蒸餾水，室溫下攪拌40 min，使蛋白質(zhì)充分溶解，然后11 000 r/min離心15 min，取上清液。凱氏定氮法測定上清液中蛋白質(zhì)量。按式（2）計算蛋白質(zhì)樣品的溶解性。

以大豆蛋白替代蘿卜籽粕蛋白質(zhì)，做相同實驗，加以比較。

1.3.5.2 水合能力的測定

準(zhǔn)確稱取3.0 g蘿卜籽粕蛋白于100 mL的燒杯中，加入30 mL水?dāng)嚢? h，使之充分吸水后移至50 mL的離心管中，11 000 r/min離心20 min，去上清液，稱質(zhì)量。按公式（3）計算水合能力。

式中：m為蘿卜籽粕蛋白質(zhì)量/g；m1為吸水前蘿卜籽粕蛋白和離心管總質(zhì)量/g；m2為吸水后蘿卜籽粕蛋白和離心管總質(zhì)量/g。

以大豆蛋白替代蘿卜籽粕蛋白質(zhì)，做相同實驗。

1.3.5.3 吸油能力的測定

準(zhǔn)確稱取5.0 g蘿卜籽粕蛋白于已經(jīng)稱質(zhì)量的離心管中，加入30 mL的一級大豆油，振蕩2 min，置于60 ℃的水浴鍋中保溫30 min，使之充分吸油，11 000 r/min離心20 min后，將離心管上層的油全部除去，稱質(zhì)量。按式（4）計算蛋白質(zhì)樣品的吸油能力。

式中：m為蘿卜籽粕蛋白質(zhì)量/g；m1為吸油前蘿卜籽粕蛋白質(zhì)和離心管總質(zhì)量/g；m2為吸油后蘿卜籽粕蛋白質(zhì)和離心管質(zhì)量/g。

以大豆蛋白替代蘿卜籽粕蛋白，做相同實驗。

1.3.5.4 EAI與ESI的測定

取2 g的蘿卜籽粕蛋白溶于40 mL 0.05 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，然后與40 mL一級大豆油混合，在10 000 r/min攪拌機(jī)中攪拌3 min，形成均一的乳化液后，立即用移液管從底部取1.0 mL該乳化液，加入20 mL 0.1%的SDS溶液，快速搖勻后在500 nm波長處測定吸光度，記為A0（以SDS溶液為空白），將乳化液靜置30 min后，從底部取1.0 mL，同樣稀釋、比色，記錄吸光度A30。按式（5）、（6）計算蛋白樣品的EAI及ESI。

式中：m為蘿卜籽粕蛋白質(zhì)量/mg；φ為油相所占的體積分?jǐn)?shù)（5.66%）。

以大豆蛋白替代蘿卜籽粕蛋白質(zhì)，做相同實驗。

1.3.5.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定

準(zhǔn)確稱取1.0 g蘿卜籽粕蛋白，溶于100 mL蒸餾水中，調(diào)pH值至7.0，然后在8 000 r/min攪拌機(jī)中均質(zhì)2 min，快速倒入500 mL量筒中，在室溫下記錄泡沫總體積V0/mL，靜置30 min后記錄泡沫總體積V30/mL。然后按式（7）、（8）計算蘿卜籽粕蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

以大豆蛋白替代蘿卜籽粕蛋白，做相同實驗。

1.3.6 蘿卜籽粕蛋白體外抗氧化活性測定

1.3.6.1 蘿卜籽粕蛋白質(zhì)清除DPPH自由基活性測定

取不同含量的蘿卜籽粕蛋白質(zhì)溶液3.0 mL于試管中，分別加入0.6 mL的0.4 mmol/L DPPH溶液，再加6.0 mL蒸餾水?；靹蚍磻?yīng)體系，置于黑暗中反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度A1；將不同含量的蘿卜籽粕蛋白質(zhì)溶液與無水乙醇等體積混合于試管中，搖勻，于黑暗處反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度A2；再將DPPH與蒸餾水等體積混合，測517 nm波長處的吸光度A0；以蒸餾水和無水乙醇的等體積混合溶液作空白用于儀器調(diào)零，每個實驗做3 次平行實驗，按式（9）計算蘿卜籽粕蛋白質(zhì)對DPPH自由基的清除率。

在反應(yīng)體系中依次加入1 mL 0.2%亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，加入蛋白質(zhì)液1 mL，置于37 ℃水浴鍋中10 min后取出，分別加入2 mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液，充分混勻后，反應(yīng)3 min，再加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，反應(yīng)15 min后，在538 nm波長處測定溶液的吸光度A1；同時做空白實驗，測定吸光度A0；每個實驗做3 次平行實驗，按式（10）計算蘿卜籽粕蛋白質(zhì)對NO2-的清除率。

1.3.6.3 蘿卜籽粕蛋白質(zhì)清除H2O2活性測定

取不同濃度蛋白溶液2.0 mL于試管中，分別加入4.8 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）和1.2 mL 40 mmol/L H2O2溶液，混勻，于室溫下放置10 min，230 nm波長處吸光度A1。以蒸餾水替代樣品做相同實驗，吸光度A0。以蒸餾水替代H2O2和樣品做相同實驗，吸光度A2。每個實驗做3 次平行實驗。按式（11）計算蘿卜籽粕蛋白質(zhì)對H2O2的清除率。

1.3.6.4 蘿卜籽粕蛋白質(zhì)清除·OH活性測定

在反應(yīng)體系中依次加入1 mL 0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液，1.5 mL 150 mmol/L（pH 7.5）的磷酸鹽緩沖液，充分混勻后，再加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，立即搖勻，再向反應(yīng)體系中加入不同濃度的蛋白質(zhì)溶液1 mL，均勻后，加入1 mL 0.01%的H2O2溶液，混勻后37℃反應(yīng)30 min，于536 nm波長處測吸光度A2。以等體積蒸餾水代替蛋白質(zhì)樣品做相同實驗，測定吸光度A1。以等體積蒸餾水代替蛋白質(zhì)和H2O2溶液做相同實驗，測定吸光度A0。重復(fù)上述實驗3 次，按公式（12）計算蘿卜籽粕蛋白質(zhì)對·OH的清除率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜籽粕蛋白組分組成

蘿卜籽粕蛋白主要以球蛋白、谷蛋白和清蛋白為主，分別占總蛋白質(zhì)量的44%、33%、21%，醇溶蛋白含量很少，只占總蛋白質(zhì)的2%。Ikeda等[20]研究認(rèn)為，球蛋白、谷蛋白對胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感，屬易消化蛋白，蘿卜籽粕蛋白中的球蛋白和谷蛋白占總蛋白質(zhì)量的77%，預(yù)示蘿卜籽粕蛋白易被人體消化吸收。醇溶蛋白和谷蛋白是構(gòu)成面筋蛋白的主要成分，它們在蘿卜籽粕蛋白中的比例只有35%，在一定程度上會制約蘿卜籽粕蛋白的食品加工特性。

2.2 蘿卜籽粕蛋白氨基酸組成及營養(yǎng)價值評價

表1 蘿卜籽粕蛋白的氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition of radish seed meal protein isolate

從表1可以看出，蘿卜籽粕蛋白含18 種氨基酸。功能性氨基酸中的谷氨酸含量最高，為157 mg/g，其次是精氨酸、天冬氨酸和亮氨酸，分別為70、62、61 mg/g，再次是賴氨酸、甘氨酸、脯氨酸，分別為49、49、47 mg/g。必需氨基酸含量（342 mg/g）占氨基酸總量（798 mg/g）的43%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值為0.75，接近或超過FAO/ WHO建議的40%和0.6[14]。親水性氨基酸總量為518 mg/g，遠(yuǎn)大于疏水基氨基酸總量（280 mg/g），有利于在食品工業(yè)中應(yīng)用。根據(jù)文獻(xiàn)[21-22]，天冬氨酸和谷氨酸都有較強(qiáng)的抗氧化能力，另一些氨基酸，如脯氨酸、精氨酸等也具有一定的抗氧化能力，而在蘿卜籽粕蛋白中，這些氨基酸的含量很高，預(yù)示蘿卜籽粕蛋白可能具有很好的抗氧化能力。

以FAO/WHO模式為參考，根據(jù)公式（1）及表1計算出的蘿卜籽粕蛋白的AAS值見表2。與大豆蛋白相似，蘿卜籽粕蛋白中的第一限制氨基酸為蛋氨酸，其AAS值為57，而大豆蛋白為51。對于一種蛋白質(zhì)來說，若僅從化學(xué)的角度評價其營養(yǎng)價值，一般AAS值越高，說明其營養(yǎng)價值越高，可以認(rèn)為蘿卜籽粕蛋白的營養(yǎng)價值稍高于大豆蛋白。還可以看出，除蛋氨酸外，蘿卜籽粕蛋白中的其他AAS值都在80～90之間，說明了氨基酸之間的配比較平衡，有利于人體利用。而大豆蛋白的其他AAS值在75～120之間，較蘿卜籽粕蛋白稍顯不平衡。也再一次說明，蘿卜籽粕蛋白的營養(yǎng)價值稍高于大豆蛋白。當(dāng)然，綜合評價兩種蛋白的營養(yǎng)價值需要多種指標(biāo)，有望在今后的研究中完善。

表2 蘿卜籽粕蛋白質(zhì)AASTable 2 AAS of radish seed meal protein isolate

2.3 蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)

表3 蘿卜籽粕蛋白的功能性質(zhì)Table 3 Functional properties in radish seed meal protein isolate

由表3可知，蘿卜籽粕蛋白的溶解性和水合能力分別為（38.55±0.38）%和（3.78±0.36）g/g，高于大豆蛋白，可能與蘿卜籽粕蛋白的親水性基團(tuán)的數(shù)量較多有關(guān)。蛋白質(zhì)的起泡能力和穩(wěn)定性取決于其溶解性，蘿卜籽粕蛋白的高溶解性，已經(jīng)決定了其良好的起泡性和泡沫穩(wěn)定[25-26]；蘿卜籽粕蛋白的起泡性為（115.00±1.97）%，泡沫穩(wěn)定性為（56.00±0.46）%，均高于大豆蛋白，也驗證了這一理論。

蘿卜籽粕蛋白的EAI為（29.12±0.29）cm2/mg，ESI為（4.83±0.74）min，與大豆蛋白相比，蘿卜籽粕蛋白的EAI及ESI都較大豆蛋白好，在食品工業(yè)的應(yīng)用中，蘿卜籽粕蛋白應(yīng)具有更高的價值[27]。蘿卜籽粕蛋白的吸油能力為（1.84±0.11）g/g，稍低于大豆蛋白。

2.4 蘿卜籽粕蛋白質(zhì)的抗氧化能力

由圖1可知，蘿卜籽粕粗蛋白及其4 種蛋白組分對DPPH自由基、?OH、NO2-、H2O2都有一定的清除能力，且隨蛋白質(zhì)含量的升高，清除率也隨之上升。其中，對DPPH自由基的清除能力按強(qiáng)弱排序依次為清蛋白＞粗蛋白、醇溶蛋白＞球蛋白＞谷蛋白；對·OH、NO2-、H2O2的清除率按強(qiáng)弱排序依次為谷蛋白＞粗蛋白＞球蛋白＞清蛋白＞醇溶蛋白。

圖1 蘿卜籽粕蛋白對DPPH自由基（A）、?OH（B）、（C）、H2O2（D）的清除率Fig. 1 Scavenging effects of radish seed protein isolate on DPPH free radicals (A), ·OH (B), (C), H2O2 (D)

由圖1A可知，在蛋白質(zhì)含量為0.14 mg/g時，清蛋白對DPPH自由基的清除率可達(dá)（77.2±1.7）%，粗蛋白、醇溶蛋白、球蛋白分別僅為（31.8±1.7）%、（27.4±2.0）%和（22.4±1.8）%，谷蛋白只有（6.1±1.4）%。粗蛋白清除DPPH自由基的能力差于清蛋白，與其中的谷蛋白和球蛋白占比例較大，而清除DPPH自由基的能力較差有關(guān)。由圖1B可知，醇溶蛋白對?OH的清除能力遠(yuǎn)低于其他4 種蛋白，在最大蛋白質(zhì)含量0.14 mg/g處，醇溶蛋白對?OH的清除率只有（46.4±2.1）%，而清蛋白為（88.5±1.8）%，球蛋白為（92.4±2.2）%，谷蛋白與粗蛋白為100%。圖1C顯示，清蛋白和醇溶蛋白對NO2-的清除能力相近，但遠(yuǎn)低于其他3 種蛋白，在最大蛋白質(zhì)含量0.14 mg/g，清蛋白和醇溶蛋白對的清除率分別只有（35.4±1.4）%和（32.5±1.9）%，而球蛋白、粗蛋白、谷蛋白分別為（72.3±1.5）%、（80.5±1.6）%和（85.3±2.0）%。由圖1D可知，在最大蛋白質(zhì)含量0.14 mg/g，醇溶蛋白對H2O2的清除率遠(yuǎn)低于其他4 種蛋白，醇溶蛋白對H2O2的清除率只有（44.4±2.0）%，而清蛋白、球蛋白、粗蛋白、谷蛋白分別為（76.9±2.1）%、（83.2±1.7）%、（86.1±2.2）%和（96.4±1.6）%。

相同蛋白含量下，粗蛋白、谷蛋白、球蛋白對?OH、H2O2、、DPPH自由基的清除有相同的規(guī)律，清除率由大到小分別為?OH、H2O2、DPPH自由基；粗蛋白、谷蛋白、球蛋白對DPPH自由基的清除率遠(yuǎn)低于對?OH、H2O2、NO2-的清除率。清蛋白清除?OH、H2O2、、DPPH自由基的能力中，對?OH的清除能力最強(qiáng)，清除的能力最差，清除H2O2、DPPH自由基的能力相近。醇溶蛋白清除?OH、H2O2、、DPPH自由基的能力由大到小分別為H2O2、?OH、、DPPH自由基，由于在最大含量0.14 mg/g處，對H2O2的清除率只有（44.4±2.0）%，可以認(rèn)為，蘿卜籽粕蛋白的4 種組分中，醇溶蛋白的抗氧化能力最差。蘿卜籽粕蛋白蛋比菜籽粕蛋白[28]、蕎麥蛋白[29]、鐵棍山藥蛋白質(zhì)[30]具有更好的清除DPPH自由基、?OH的能力。

3 結(jié) 論

蘿卜籽粕蛋白的組成中球蛋白、谷蛋白、清蛋白和醇溶蛋白分別占總蛋白質(zhì)的44%、33%、21%和2%。蘿卜籽粕蛋白中含18 種氨基酸，其中谷氨酸含量最高，其次是精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、賴氨酸等，第一限制氨基酸為蛋氨酸，AAS評分值為57；必需氨基酸的構(gòu)成比及AAS評分都優(yōu)于大豆蛋白。與大豆蛋白相比，蘿卜籽粕蛋白具有很好的溶解性、水合能力、起泡性、泡沫穩(wěn)、EAI和ESI，吸油能力稍差于大豆蛋白。蘿卜籽粕蛋白質(zhì)及其四組分對DPPH自由基、?OH、及H2O2都具有清除能力。粗蛋白、谷蛋白、球蛋白對?OH、及H2O2有很好的清除能力。清蛋白對?OH、H2O2、DPPH自由基有較好的清除能力。4 種蛋白質(zhì)中，醇溶蛋白的抗氧化能力最差。如今，人們應(yīng)用較多的優(yōu)質(zhì)植物蛋白源只有大豆蛋白，顯得很單一。由于蘿卜籽粕蛋白營養(yǎng)價值高，并且有很好的功能性質(zhì)及一定的抗氧化能力，因此蘿卜籽粕蛋白具有很高的開發(fā)價值。

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