冷藏金槍魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐敗能力

劉愛(ài)芳，謝 晶*，錢韻芳

金槍魚（Thunnus obesus），又稱鮪魚、吞拿魚，屬鱸形目鯖科，多分布在太平洋、大西洋等熱帶亞熱帶海洋區(qū)域。近年來(lái)因其含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白及二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸等多種多不飽和脂肪酸，且肉質(zhì)鮮嫩柔美，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，是遠(yuǎn)洋性重要商品食用魚[1-2]。然而金槍魚在貯運(yùn)及銷售等過(guò)程中易受微生物生長(zhǎng)代謝的影響而腐敗變質(zhì)，致使其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值下降[3]。金槍魚肉中微生物構(gòu)成復(fù)雜多樣，但僅少數(shù)適應(yīng)生長(zhǎng)繁殖較快、代謝產(chǎn)生異味腐敗物質(zhì)的特定優(yōu)勢(shì)菌群即特定腐敗菌（specific spoilage organisms，SSOs）參與其腐敗變質(zhì)[4-6]。水產(chǎn)品貯藏期間，SSOs生長(zhǎng)代謝速率快，致腐敗能力強(qiáng)，是其品質(zhì)控制的關(guān)鍵點(diǎn)。

對(duì)于水產(chǎn)品中SSOs的確定，一般從優(yōu)勢(shì)腐敗菌的篩選及致腐敗能力的評(píng)價(jià)兩個(gè)方面進(jìn)行分析。已在前期4 ℃冷藏金槍魚微生物多樣性分析中分離、純化、鑒定得到金槍魚肉在腐敗終點(diǎn)時(shí)的主要優(yōu)勢(shì)菌假單胞菌（Pseudomonas spp.）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter spp.）以及熱死環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta），其中假單胞菌和不動(dòng)桿菌是魚類低溫冷藏過(guò)程中常見(jiàn)的革蘭氏陰性腐敗菌，可利用氨基酸作為生長(zhǎng)基質(zhì)，產(chǎn)生酯、酸等物質(zhì)[7-10]；熱死環(huán)絲菌則是肉制品中常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧腐敗菌[11-12]。水產(chǎn)品中SSOs的生長(zhǎng)代謝可加速蛋白質(zhì)、脂肪以及核苷酸等物質(zhì)降解，產(chǎn)生醇、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）、生物胺、有機(jī)酸等小分子物質(zhì)，釋放不良?xì)馕?，最終導(dǎo)致魚肉腐敗變質(zhì)。因此，TVB-N、生物胺、三甲胺等腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子可作為水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐敗能力定量分析的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。錢韻芳等[13]將TVB-N及三甲胺產(chǎn)量因子作為4 ℃氣調(diào)包裝的凡納濱對(duì)蝦SSOs腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）致腐敗能力的定量分析指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其TVB-N產(chǎn)量因子（YTVB-N/CFU）及三甲胺產(chǎn)量因子（YTMA-N/CFU）分別為1.03×10-7mg/CFU和3.95×10-9mg/CFU。Macé等[14-15]通過(guò)將不同菌株回接至無(wú)菌魚片并測(cè)定其微生物、感官、TVB-N及揮發(fā)性氣味物質(zhì)產(chǎn)量變化，明確了8 ℃氣調(diào)包裝的三文魚及煮熟熱帶蝦的SSOs致腐敗特點(diǎn)。

食品微生物的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型通常有Baranyi-Roberts模型、Gompertz模型、修正的Gompertz模型、Logistic模型、Richards模型、Stannard模型以及Huang模型等[16]，其中生鮮水產(chǎn)品中腐敗菌生長(zhǎng)S型曲線的擬合多采用Baranyi-Roberts模型、修正的Gompertz模型以及Logistic模型[17-18]，以此，本實(shí)驗(yàn)基于前期冷藏金槍魚細(xì)菌菌相變化規(guī)律的研究，將分離得到的3 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌假單胞菌、不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌分別接種到無(wú)菌魚肉后4 ℃低溫貯藏，分析3 種微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型可靠性，研究冷藏金槍魚3 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并分別以感官評(píng)價(jià)和生物胺、TVB-N含量為定性、定量指標(biāo)，分析明確冷藏金槍魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌的致腐敗能力及其腐敗特點(diǎn)，為高效率的金槍魚冷藏保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚取自浙江豐匯遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司上海供應(yīng)站，經(jīng)宰殺分割并真空密封包裝，于-60 ℃凍藏。

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、STAA瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；鹽酸、硼酸、溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑、高氯酸、氫氧化鈉、氨水、醋酸銨等（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丹酰氯 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Kjeltec 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥FOSS分析儀器公司；LC-2010C HT 高效液相色譜儀 日本島津公司；H-2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；VS-1300L-U潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；Ymnl-9D拍打式均質(zhì)器南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金槍魚無(wú)菌魚塊的制備

參照錢韻芳等[13]的方法并作適當(dāng)調(diào)整，金槍魚4 ℃冷藏解凍后，75%乙醇中浸泡30 s，無(wú)菌水多次清洗后超凈工作臺(tái)內(nèi)晾干，備用。

1.3.2 腐敗菌菌種活化及菌懸液的制備

于前期冷藏金槍魚細(xì)菌菌相演替變化規(guī)律的研究中，分離、純化、鑒定獲得4 ℃冷藏金槍魚貨架期終點(diǎn)（貯存第168小時(shí)）時(shí)的3 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌，分別為不動(dòng)桿菌、假單胞菌、熱死環(huán)絲菌，所得菌株使用甘油保存于-40 ℃中備用。上述實(shí)驗(yàn)室所保存的3 株菌株經(jīng)活化后，接種到胰蛋白胨培養(yǎng)基上劃線25 ℃培養(yǎng)24～48 h后，取典型單菌落接種于300 mL胰蛋白胨肉湯中，30 ℃搖床培養(yǎng)12～18 h至菌液濃度達(dá)到108CFU/mL。離心20～30 min，棄上清液，無(wú)菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL，備用。

1.3.3 接種與貯藏

取上述無(wú)菌金槍魚肉，無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)分別于106CFU/mL的不動(dòng)桿菌、假單胞菌、熱死環(huán)絲菌菌懸液中浸泡30 s后，撈出瀝干，分裝于保鮮袋中，4 ℃低溫貯藏。每12 h定期取樣進(jìn)行感官評(píng)定，菌落計(jì)數(shù)，每隔24 h測(cè)定其TVB-N含量和生物胺含量等相關(guān)指標(biāo)。

1.3.4 金槍魚感官品質(zhì)分析

綜合參考雷志方等[19]的方法及SC/T 3117—2006《生食金槍魚》安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[20]，由5 名專業(yè)人士組成感官評(píng)定小組，對(duì)金槍魚的色澤、氣味、組織形態(tài)和彈性結(jié)構(gòu)4 個(gè)方面綜合評(píng)分，取4 項(xiàng)平均分為感官得分。

1.3.5 冷藏金槍魚理化品質(zhì)分析

TVB-N含量的測(cè)定：取5 g碎魚肉，依據(jù)SC/T 3032-2007《水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[21]方法，使用自動(dòng)凱氏定氮儀對(duì)TVB-N含量進(jìn)行測(cè)定。

生物胺含量的測(cè)定：參照GB/T 20768—2006《魚和蝦中有毒生物胺的測(cè)定 液相色譜-紫外檢測(cè)法》[22]方法對(duì)樣品進(jìn)行生物胺的提取、衍生處理后，采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)法進(jìn)行定量檢測(cè)，具體色譜條件如下：色譜柱為C18色譜柱，柱溫、流速、進(jìn)樣量及檢測(cè)波長(zhǎng)分別為40 ℃、1 mL/min、10 μL及254 nm，流動(dòng)相為0.1 mol/mL醋酸銨（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～22 min，50% A～10% A；22～34 min，10% A～50% A；34～39 min，50% A）。生物胺指數(shù)在數(shù)值上為組胺、酪胺、腐胺、尸胺含量的總和[11]。

1.3.6 腐敗菌生長(zhǎng)情況的測(cè)定

以GB 47892—2010《食品微生物學(xué) 檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[24]為參考，取金槍魚肉25 g于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入225 mL生理鹽水后使用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，制備樣品勻液，并依次做10 倍梯度稀釋。取1 mL適宜稀釋度的樣品勻液，分別接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度3 個(gè)平行。相關(guān)培養(yǎng)條件見(jiàn)表1。

表1 金槍魚腐敗細(xì)菌培養(yǎng)方法Table 1 Culture methods for spoilage organisms in tuna

1.3.7 腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立及可靠性評(píng)價(jià)

1.3.7.1 腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立

本研究采用Baranyi-Roberts模型[25]、修正的Gompertz模型以及Logistic模型[26]對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立腐敗菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)模型，其方程表達(dá)式如式（1）～（2）所示。

Baranyi-Roberts模型如式（1）所示。

式中：ymax為微生物達(dá)到穩(wěn)定時(shí)的最大數(shù)量（lg（CFU/g））；y0為初始微生物數(shù)量（lg（CFU/g））；μ0為初始比生長(zhǎng)速率/h-1；μmax為最大比生長(zhǎng)速率/h-1；h為適應(yīng)因素；Lag為延滯時(shí)間/h；t為貯藏時(shí)間/h。

修正的Gompertz方程如式（3）所示。

式中：N（t）為貯藏時(shí)間為t時(shí)的腐敗菌數(shù)/（CFU/g）；N0、Nmax分別為初始菌落數(shù)和生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)最大菌落數(shù)/（CFU/g）。

Logistic模型（式（4））。

應(yīng)用型人才的培養(yǎng)離不開(kāi)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)場(chǎng)所，一方面加強(qiáng)校內(nèi)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)，按照工作環(huán)境和工作要求建立校內(nèi)仿真實(shí)驗(yàn)室，模擬工作環(huán)境對(duì)學(xué)生進(jìn)行專業(yè)實(shí)踐方面的訓(xùn)練。另一方面，積極拓展校外實(shí)踐基地，與企業(yè)、工廠等單位合作建立大學(xué)生實(shí)踐基地，將部分實(shí)踐性課程搬入實(shí)踐基地組織教學(xué)［4］。

1.3.7.2 腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的可靠性評(píng)價(jià)

分析比較模型擬合所得預(yù)測(cè)值及實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值，依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)修正決定系數(shù)R2Adj、均方誤差（mean square error，MSE）、準(zhǔn)確因子（accuracy factor，Af）以及偏差因子（bias factor，Bf）對(duì)所得微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的可靠性進(jìn)行評(píng)價(jià)[27-28]。

MSE根據(jù)式（6）計(jì)算。

式中：Nobs為觀測(cè)值；Npred為預(yù)測(cè)值；n為觀測(cè)值個(gè)數(shù)；Nmean為觀測(cè)值平均值；k為模型中變量參數(shù)的個(gè)數(shù)。

1.3.8 優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐敗能力定量分析

以腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU，即冷藏金槍魚貨架期終點(diǎn)時(shí)單位腐敗菌產(chǎn)生的腐敗代謝產(chǎn)物的量為細(xì)菌腐敗能力的定量指標(biāo)[29]，其計(jì)算公式如式（9）所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0和Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，采用Duncan法，P＜0.05為顯著，并用Origin 9.0軟件進(jìn)行非線性回歸分析、多項(xiàng)式曲線擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏金槍魚腐敗微生物菌落數(shù)變化及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

圖1 接種不同菌株的金槍魚冷藏期間腐敗菌菌落數(shù)變化情況Fig. 1 Microbial counts of tuna inoculated with different spoilage bacteria during chilled storage

采用Baranyi-Roberts模型、修正的Gompertz模型以及Logistic模型對(duì)接種的優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析描述，未接菌空白對(duì)照組金槍魚的微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)以非線性方程擬合，接菌金槍魚4 ℃冷藏期間腐敗菌菌落數(shù)擬合及生長(zhǎng)變化情況如圖1所示。接種高濃度假單胞菌、不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌實(shí)驗(yàn)組的初始菌落數(shù)分別為5.04、5.07 lg（CFU/g）和5.14 lg（CFU/g），接種效果無(wú)顯著差異，相比于空白對(duì)照組初始菌落數(shù)高出近2 個(gè)數(shù)量級(jí)，直至實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诳瞻讓?duì)照組的菌落總數(shù)達(dá)5.15 lg（CFU/g），才與接菌實(shí)驗(yàn)組初期菌落數(shù)相近，且貯藏期間接菌實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組微生物數(shù)量差距較大，因此可近似忽略冷藏期間無(wú)菌金槍魚魚肉中殘留雜菌對(duì)其優(yōu)勢(shì)腐敗微生物致腐敗能力的影響。冷藏實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，接種假單胞菌組菌落數(shù)始終高于接種不動(dòng)桿菌與熱死環(huán)絲菌實(shí)驗(yàn)組，與前期冷藏金槍魚菌相演替變化規(guī)律研究中貨架期末期菌群組成略有不同，推測(cè)與金槍魚初始菌相結(jié)構(gòu)及各腐敗菌代謝特點(diǎn)有關(guān)[27-29]。接種假單胞菌組菌落數(shù)冷藏12 h后迅速增長(zhǎng)，而菌落數(shù)演變情況相似的不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌組在前86 h生長(zhǎng)較緩，菌落數(shù)均未超過(guò)6.0 lg（CFU/g）；冷藏96 h后不動(dòng)桿菌組與熱死環(huán)絲菌組微生物快速增加，隨后魚肉中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝產(chǎn)物累積，實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)的增長(zhǎng)曲線均趨于平緩，至貯藏168 h時(shí)接種假單胞菌、不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌組的微生物數(shù)量分別增至9.26、9.09 lg（CFU/g）和8.79 lg（CFU/g）。

分析圖1可知，經(jīng)各模型擬合所得生長(zhǎng)曲線與實(shí)測(cè)值吻合程度較高，呈典型S型，可初步判定3 種模型均能分別較好擬合冷藏金槍魚中3 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。結(jié)合表2各方程對(duì)冷藏金槍魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌菌落數(shù)擬合所得統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)、MSE、Af和Bf分析評(píng)價(jià)擬合可靠性，越大則微生物生長(zhǎng)曲線與微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程擬合程度越高，MSE越小則模型描述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精確度越高；Af和Bf分別描述模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值的接近程度和偏差程度，Af越接近1則模型擬合準(zhǔn)確度越高，一般認(rèn)為1.10＜Af＜1.90為可接受范圍，0.90＜Bf＜1.05時(shí)模型評(píng)估效果較好[28]。各模型方程對(duì)冷藏金槍魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌生長(zhǎng)曲線擬合均較高（j＞0.97），MSE近似為0，Af及Bf都接近于1，說(shuō)明各模型方程能夠很好地描述金槍魚3 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌4 ℃下的生長(zhǎng)曲線；假單胞菌的修正Gompertz方程0.99，高于方程Baranyi-Roberts和方程Logistic對(duì)假單胞菌生長(zhǎng)曲線的擬合；由方程Baranyi-Roberts和方程Logistic擬合不動(dòng)桿菌生長(zhǎng)曲線所得j均高于0.99，且MSE、Af和Bf呈現(xiàn)的擬合效果較好，故可采用Baranyi-Roberts方程或方程Logistic描述冷藏金槍魚中不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)；對(duì)于熱死環(huán)絲菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的微生物動(dòng)力學(xué)方程的擬合，分析比較統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，Baranyi-Roberts方程未能對(duì)熱死環(huán)絲菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)作出擬合，Logistic方程擬合＞0.98高于修正Gompertz方程＞0.96，故采用Logistic方程描述冷藏金槍魚中熱死環(huán)絲菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)更為貼切。通過(guò)Baranyi-Roberts方程、修正的Gompertz方程以及Logistic方程擬合所得腐敗微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。冷藏金槍魚中假單胞菌Lag為10.85 h，不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌的延滯時(shí)間分別為83.93 h和79.11 h，假單胞菌延滯期顯著少于不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌，而不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌的最大比生長(zhǎng)速率（μmax）明顯大于假單胞菌，分別為0.182 9、0.111 1 h-1和0.045 7 h-1，說(shuō)明假單胞菌相比于不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌可更加快速適應(yīng)冷藏金槍魚中生存環(huán)境，利用氨基酸作為生長(zhǎng)基質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)代謝繁殖等生理活動(dòng)，但其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)繁殖能力弱于不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌；4 ℃冷藏金槍魚假單胞菌最大腐敗菌數(shù)（lg Nmax）高于不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌，分別為9.11、9.09 lg（CFU/g）和8.78 lg（CFU/g），表明生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)假單胞菌菌落數(shù)量?jī)?yōu)于不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌。

表2 接種不同菌株金槍魚冷藏期間微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)及模型評(píng)價(jià)Table 2 Microbial growth kinetic parameters and model evaluation for tuna inoculated with different spoilage bacteria during chilled storage

2.2 冷藏金槍魚感官品質(zhì)變化及含氮腐敗物質(zhì)產(chǎn)量變化分析

2.2.1 冷藏金槍魚感官品質(zhì)變化分析

圖2 接種不同菌株的金槍魚冷藏期間感官品質(zhì)變化Fig. 2 Sensory quality changes of tuna inoculated with different spoilage bacteria during chilled storage

接種不同菌株的金槍魚在4 ℃冷藏條件下的感官評(píng)定結(jié)果如圖2所示。整體而言，因微生物代謝加速蛋白質(zhì)、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解，致使金槍魚逐漸出現(xiàn)肉質(zhì)松軟、色澤暗淡、散發(fā)腥臭味等腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，感官品質(zhì)均呈下降趨勢(shì)，且接菌實(shí)驗(yàn)組感官品質(zhì)較空白對(duì)照組低。接種假單胞菌、不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌的冷藏金槍魚的感官得分在貯藏前48 h并無(wú)顯著性差異（P＞0.05），分別于貯藏第48、72小時(shí)和第60小時(shí)到達(dá)高品質(zhì)期終點(diǎn)，至貯藏第96、108小時(shí)和第105小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)腥臭味，此時(shí)感官得分分別為3.95、4.10和4.00，到達(dá)感官拒絕的腐敗點(diǎn)；空白對(duì)照組于冷藏第96小時(shí)時(shí)低于可生食感官分值6 分，直至貯藏末期其感官評(píng)分未低于金槍魚腐敗點(diǎn)感觀分值4 分。

2.2.2 冷藏金槍魚TVB-N含量變化分析

圖3 接種不同菌株的金槍魚冷藏期間TVB-N含量的變化Fig. 3 Changes in TVB-N contents of tuna inoculated with different spoilage bacteria during chilled storage

金槍魚冷藏期間TVB-N的累積多由蛋白質(zhì)腐敗降解產(chǎn)生胺及氨類等鹽基氮類物質(zhì)所致，其值越高，則氨基酸降解越嚴(yán)重，是評(píng)價(jià)魚肉品質(zhì)的重要鮮度指標(biāo)[20]。由圖3可知，空白組和接種假單胞菌、不動(dòng)桿菌以及熱死環(huán)絲菌組的TVB-N含量在0～48 h貯藏初期無(wú)顯著差異，初始TVB-N含量分別為11.27、10.91、11.60 mg/100 g和11.94 mg/100 g，相比于新鮮淡水魚，初始TVB-N含量較高[33-34]；冷藏48 h后TVB-N含量迅速增加，接種假單胞菌、不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌組的金槍魚到達(dá)感官拒絕點(diǎn)時(shí)TVB-N含量分別為27.32、22.80 mg/100 g和24.85 mg/100 g，接種假單胞菌組TVB-N含量高于其他3 組。

2.2.3 冷藏金槍魚生物胺含量及生物胺指數(shù)變化分析

圖4 接種不同菌株的金槍魚冷藏期間生物胺含量的變化Fig. 4 Changes in biogenic amine contents of tuna inoculated with different spoilage bacteria during chilled storage

水產(chǎn)品特別是游離氨基酸含量較高的金槍魚在貯藏過(guò)程中，易受腐敗微生物代謝產(chǎn)物脫羧酶的影響，使其游離氨基酸發(fā)生脫羧作用，產(chǎn)生大量具有生物活性的生物胺。已有研究表明組胺、酪胺、腐胺和尸胺是金槍魚貯藏過(guò)程中產(chǎn)生的主要胺類，與其食用安全性及鮮度變化相關(guān)性顯著[35-36]。由圖4接種不同菌株的金槍魚4 ℃冷藏過(guò)程中生物胺的變化情況可知，各處理組生物胺含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升；空白對(duì)照組的生物胺含量增長(zhǎng)緩慢，相比于新鮮金槍魚，冷藏至第168小時(shí)其組胺、酪胺、腐胺和尸胺分別增長(zhǎng)27.14、5.37、3.27 mg/kg和7.56 mg/kg，組胺含量增長(zhǎng)較高；貯藏過(guò)程中，接種假單胞菌的金槍魚各生物胺含量，整體高于其他處理組。如圖4A所示，接種不動(dòng)桿菌組與接種熱死環(huán)絲菌組的組胺產(chǎn)生量與未接菌組無(wú)顯著差異（P＞0.05），接種假單胞菌組中組胺產(chǎn)生量顯著高于其他處理組（P＜0.05），至貯藏96 h假單胞菌組中組胺含量升至97.89 mg/kg，超過(guò)SC/T 3117—2006中對(duì)于生食金槍魚中組胺含量的限制（90 mg/kg），貯藏第168小時(shí)，假單胞菌處理的金槍魚肉中組胺含量相比于空白對(duì)照組高出2.43 倍。圖4B中顯示酪胺含量在金槍魚冷藏過(guò)程中隨貯藏時(shí)間依次持續(xù)增加，至第168小時(shí)貨架期終點(diǎn)，接種假單胞菌、不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌的金槍魚處理組中酪胺含量分別增至12.97、11.09 mg/kg和11.38 mg/kg。腐胺和尸胺是魚肉腐敗變質(zhì)過(guò)程中散發(fā)腐臭氣味的主要原因，由圖4C、D可知，不動(dòng)桿菌組和熱死環(huán)絲菌組的腐胺含量在貯藏前72 h變化趨勢(shì)相似，接種假單胞菌組的腐胺含量在金槍魚冷藏第72小時(shí)后開(kāi)始顯著上升，表明此時(shí)魚肉品質(zhì)開(kāi)始下降，至貯藏第96小時(shí)，假單胞菌組腐胺含量增長(zhǎng)速度進(jìn)一步加快，增至19.78 mg/kg，魚肉品質(zhì)到達(dá)腐敗點(diǎn)[35]；尸胺變化趨勢(shì)同腐胺較為相似，貯藏末期，假單胞菌組、不動(dòng)桿菌組和熱死環(huán)絲菌組尸胺含量分別升至44.72、38.07 mg/kg和35.69 mg/kg。

圖5 接種不同菌株的金槍魚冷藏期間生物胺指數(shù)的變化Fig. 5 Changes in biogenic amine index of inoculated tuna with different spoilage bacteria during chilled storage

生物胺指數(shù)數(shù)值上與組胺、酪胺、腐胺和尸胺含量的總和相等，可反映金槍魚冷藏期間生物胺整體變化情況，多以生物胺指數(shù)值100作為金槍魚質(zhì)量閾值[36]，接種不同菌株的金槍魚冷藏期間生物胺指數(shù)變化情況如圖5所示。假單胞菌組于貯藏12 h其生物胺開(kāi)始迅速增長(zhǎng)，貯藏96 h時(shí)其生物胺指數(shù)155.84已超過(guò)規(guī)定閾值100；貯藏末期，接種不動(dòng)桿菌組和熱死環(huán)絲菌組的生物胺指數(shù)分別達(dá)到121.11和117.43。

2.3 冷藏金槍魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐敗能力的定量分析

以腐敗微生物代謝產(chǎn)生TVB-N的產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU作為冷藏金槍魚中優(yōu)勢(shì)腐敗菌假單胞菌、不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌致腐敗能力評(píng)價(jià)指標(biāo)，所得結(jié)果如表3所示。冷藏金槍魚中3 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌中假單胞菌的產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU最高，為7.36×10-8mg TVB-N/CFU，比熱死環(huán)絲菌的產(chǎn)量因子高出45%，是不動(dòng)桿菌產(chǎn)量因子的3.97 倍，這可能與假單胞菌在有氧冷藏的環(huán)境中可分泌活性較高的蛋白酶和脫羧酶有關(guān)[37]。因此4 ℃冷藏金槍魚中假單胞菌和熱死環(huán)絲菌的致腐能力強(qiáng)于不動(dòng)桿菌。

表3 接種不同菌株的金槍魚冷藏期間致腐因子比較Table 3 Comparison of yield factors of TVB-N in tuna inoculated with different spoilage bacteria during chilled storage

3 結(jié) 論

將從冷藏金槍魚貨架期終點(diǎn)分離、純化、鑒定所得優(yōu)勢(shì)腐敗菌假單胞菌、不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌回接于無(wú)菌金槍魚肉中，分析貯藏期間各優(yōu)勢(shì)腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)及金槍魚品質(zhì)變化發(fā)現(xiàn)，4 ℃冷藏金槍魚中假單胞菌和熱死環(huán)絲菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)描述最佳的方程分別為修正Gompertz方程和Logistic方程，不動(dòng)桿菌生長(zhǎng)曲線的擬合可采用Baranyi-Roberts方程或Logistic方程；接種不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌的冷藏金槍魚貨架期為108 h，比接種假單胞菌組的貨架期較長(zhǎng)；好氧嗜冷菌假單胞菌在冷藏金槍魚中生長(zhǎng)快速，比不動(dòng)桿菌和熱死環(huán)絲菌具有更強(qiáng)的產(chǎn)生TVB-N和生物胺的能力。冷藏金槍魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐能力的分析研究可為冷藏金槍魚靶向保鮮技術(shù)的發(fā)展及食品柵欄技術(shù)在金槍魚保鮮中應(yīng)用提供理論依據(jù)，但研究未涉及各腐敗菌間的交互作用以及致腐敗機(jī)制，這將是今后研究工作的重點(diǎn)。

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