雞真核生物翻譯起始因子2α的原核表達(dá)與多克隆抗體的制備

袁曉琴，陳仕怡，劉夢茜，李春燕，許麗惠，周五朵，吳異健，王全溪

(福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

真核翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factors，eIFs)普遍存在于真核細(xì)胞中，是蛋白質(zhì)翻譯所必需的蛋白，并且其可以保證mRNA在核糖體上經(jīng)過正確編碼而形成復(fù)合物的一類蛋白質(zhì)。eIF2、eIF3、eIF4、eIF5 4種是我們目前研究較多的真核翻譯起始因子。eIF2復(fù)合物主要由σ、B、Y三個(gè)亞基構(gòu)成，是GTP中比較具有代表性的結(jié)合蛋白，eIF2可以和GTP、Met.tRNAi二者結(jié)合，形成Met.tRNAi-elF2α-GTP三元復(fù)合物，mRNA的5’端就是與該復(fù)合物和核糖體的40 S小亞基相結(jié)合的復(fù)合物結(jié)合[1]，從而進(jìn)行真核生物蛋白質(zhì)的合成。eIF2α在蛋白質(zhì)翻譯的過程中有重要作用，如peIF2α能抑制蛋白質(zhì)翻譯，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期蛋白質(zhì)的合成減少，從而減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)折疊蛋白的來源，使未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的堆積減少，進(jìn)而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)[2]。當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)激活一些伴侶蛋白進(jìn)行細(xì)胞的自我保護(hù)，例如PERK可以通過發(fā)生自身磷酸化從而使真核翻譯起始因子eIF2α上第51位的絲氨酸也發(fā)生磷酸化，eIF2α磷酸化后會(huì)抑制翻譯起始復(fù)合物中GDP與GTP的交換，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的翻譯和合成，導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯[3-4]。

目前已知，禽類病毒感染可以引起宿主細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了更加深入的研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在禽類病毒性傳染病致病機(jī)理中的作用，急需制備禽類eIF2α的抗體，為之后的研究工作提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試料與試劑

DH5α和E.coliBL 21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；健康新西蘭黃兔(福建農(nóng)林大學(xué)派尼爾兔園)；pET-32a(+)原核質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)；T4連接酶(美國Promega公司)；EcoRIQuickCut 和SalIQuickCut限制酶(大連寶生生物技術(shù)公司)等。

1.2 eIF2α基因的擴(kuò)增

根據(jù)NCBI中的雞eIF2α蛋白(登錄號：NM_001006477.1)基因的CDs區(qū)，設(shè)計(jì)一對特異性引物eIF2α-F:AGAATTCATGCCAGCACTAAGCTGTAGG eIF2α-R:GGTCGACCTACCTTGCAAGCTCAGTCTC(劃線處為EcoRI和SalI酶的酶切位點(diǎn))。以上、下游引物F和R作為擴(kuò)增引物，提取的雞總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后合成的cDNA為模板，對eIF2α基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經(jīng)鑒定正確后切膠回收純化[5]。

1.3 pET-32a(+)-eIF2α重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將準(zhǔn)備好的pET-32a(+)原核表達(dá)載體與純化后的目的片段分別用EcoRI和SalI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，雙酶切反應(yīng)結(jié)束后，以目的片段與載體摩爾比例為7∶1于4 ℃過夜進(jìn)行連接反應(yīng)。

1.4 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-eIF2α 的鑒定及其表達(dá)鑒定

將連接后的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至BL21，挑取單克隆菌落接種于液體培養(yǎng)基，加入終濃度為1 mmoL/LIPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，同時(shí)設(shè)pET-32a(+)空質(zhì)粒組。培養(yǎng)8 h后取部分菌液，n收集菌群，用PBS緩沖液重懸，變性后于水中煮沸，對其進(jìn)行蛋白SDS-PAGE電泳分析。

1.5 eIF2α蛋白誘導(dǎo)表達(dá)體系優(yōu)化及純化

將保存的陽性克隆菌復(fù)蘇，加入IPTG使其終濃度一致，分別在0，4，6，8，10 h取樣，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。在最佳誘導(dǎo)時(shí)間并且IPTG終濃度相同的條件下，分別在4，25，37，45 ℃溫度下培養(yǎng)，確定最佳的誘導(dǎo)溫度。在最佳誘導(dǎo)溫度和培養(yǎng)時(shí)間基礎(chǔ)上，分別加入IPTG誘導(dǎo)劑0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.5 mmoL/L進(jìn)行誘導(dǎo)，最終確定最佳的誘導(dǎo)濃度。將蛋白分別置于40,80,120,160,200，240,280 mmoL/L咪唑洗脫液下洗脫，確定咪唑的最佳純化濃度。

1.6 兔抗eIF2α蛋白多克隆抗體的制備鑒定和其血清效價(jià)

在免疫前，分離部分血清作為陰性對照。以eIF2α蛋白為抗原，第一次注射每只以1 mg抗原溶液與等體積的不完全弗氏佐劑充分乳化后注射于一只新西蘭黃兔的皮下組織，14 d后二次免疫，方法同上，二次免疫后采集血液分離血清，將純化后的eIF2α蛋白作為抗原，以兔血清為一抗，HRP-羊抗兔為二抗進(jìn)行Western blot鑒定，鑒定正確后加強(qiáng)免疫，7 d后心臟采血并分離血清。同時(shí)將純化后的重組蛋白(濃度20 mg/mL)作為抗原包被于96孔酶標(biāo)板,將采取到的兔血清按比例稀釋7次后分別作為一抗，HRP-羊抗兔為二抗，應(yīng)用間接ELISA法測定血清的抗體效價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增和pET-32a(+)-eIF2α重組質(zhì)粒的構(gòu)建

對eIF2α基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得約為834 bp的特異性條帶(圖1A)。對陽性菌群進(jìn)行PCR鑒定發(fā)現(xiàn)以上游引物F和下游引物R進(jìn)行PCR鑒定，可擴(kuò)增出一條約為834 bp的特異性條帶，用載體通用引物T7可擴(kuò)增一條約為1 574 bp的條帶(圖1B)將引物互換之后分別可擴(kuò)增1 000 bp和1 419 bp的條帶。將質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，單酶切可見一條約6 734 bp的條帶，雙酶切可見兩條分別為834 bp和5 900 bp的條帶(圖1C)。經(jīng)測序鑒定(圖1D)表明，該序列與雞源系列具有較高的同源性。

A:eIF2α基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；M:Trans2KTMPlus DNA Maker；1:eIF2α 。B：重組質(zhì)粒PCR鑒定；M:Trans2KTMPlus DNA Maker；1:eIF2α；2:T7；3:eIF2α上游+T7下游；4:eIF2α下游+T7上游。C:重組質(zhì)粒酶切鑒定；M：Trans2KTMplus DNA Maker；1：重組質(zhì)粒；2：EcoRI和SalI限制酶雙酶切；3：SalI限制酶單酶切；4：EcoRI限制酶單酶切。D:eIF2α基因核苷酸序列同源性比對分析

A:Results of eIF2α gene by PCR;M:Trans2KTMPlus DNA Maker；1:eIF2α gene。B:recombinant plasmid PCR identification results；M:Trans2KTMPlus DNA Maker； 1:eIF2α gene；2:T7 Primer；3:eIF2α F+T7R；4:eIF2α R+T7F。C:Double and single enzyme identification of recombinant plasmid；M:Trans2KTMPlus DNA Maker；1:recombinant plasmid was not cut；2:double enzyme；3:SalIsingle enzyme；4:EcoRIsingle enzyme。D:eIF2α gen nucleotide sequence homolopy analysis

圖1 目的基因的擴(kuò)增和pET-32a(+)-eIF2α重組質(zhì)粒的構(gòu)建

Fig.1 Target gene amplification and pET-32a(+)-eIF2α constrution

A:重組蛋白的表達(dá)；B:重組蛋白的Western-blot鑒定A:Expression of recombinant proteins；M:Protein marker;1:Blank control;2:pET-32a(+)-eIF2α；B:Results of recombinant protein expression圖2 pET-32a(+)-eIF2α蛋白的SDS-PAGE和Western-blotFig.2 SDS-PAGE and Western-blot of recombinant protein

2.2 eIF2α蛋白的SDS-PAGE鑒定結(jié)果

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)BL21后，收集菌液取上清溶液進(jìn)行蛋白SDS-PAGE電泳分析(圖2.A)和Western-blot鑒定(圖2B)，發(fā)現(xiàn)約51 ku大小條帶，其為目的條帶。

2.3 eIF2α蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果及純化結(jié)果

在IPTG終濃度一致的培養(yǎng)條件下，在不同誘導(dǎo)時(shí)間蛋白的表達(dá)量不同，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)時(shí)間為10 h時(shí)重組蛋白的表達(dá)量最佳(圖3A)。在誘導(dǎo)時(shí)間與IPTG終濃度均一致的培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)不同溫度蛋白表達(dá)量不同，確定最佳的誘導(dǎo)溫度為45 ℃(圖3B)。在誘導(dǎo)溫度和培養(yǎng)時(shí)間相同的條件下，分別加入不同終濃度的IPTG誘導(dǎo)劑，發(fā)現(xiàn)1.5 mmoL/L時(shí)，其蛋白表達(dá)量多于其他誘導(dǎo)濃度(圖3C)。用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫重組蛋白發(fā)現(xiàn)200 mmol/L時(shí)，洗脫的蛋白較多并且雜帶較少(圖3D)。

A：重組蛋白誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化；M：marker；1：空質(zhì)粒；2：0 h；3：4 h；4：6 h；5:8 h；6：10 h。B：重組蛋白誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化；M：marker；1：空質(zhì)粒；2：4 ℃；3：25 ℃；4：37 ℃；5:45 ℃；C：重組蛋白誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化；M：marker；1：空質(zhì)粒；2～9分別為1.5,1.2，1.0，0.8，0.6，0.4，0.2 和0 mmoL/L IPTG誘導(dǎo)的pET-32a(+)-eIF2α重組質(zhì)粒。D：pET-32a(+)-eIF2α蛋白純化；M:marker；1：純化前蛋白溶液；2：流出液 3～9分別為40,80,120,160,200,240,280 mmol/L等不同濃度的咪唑洗脫液A:Optimization of recombinant proteins induction by differ hours；M:Protein marker;1:pET-32a;2-6:pET32a-eIF2α in BL21(DE3) was respectively induced by IPTG at 0,4,6,8,10 h。B:Optimization of recombinant proteins induction by temperature；M:Protein marker;1:pET-32a;2-5:pET32a-eIF2α in BL21(DE3) was respectively induced by IPTG at 4,25，37，45 ℃。C:Optimization of recombinant proteins induction by IPTG；M:Protein marker;1:pET-32a;2-9:pET32a-eIF2α in BL21(DE3) was respectively induced by IPTG at 1.5,1.2,1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0 mmol/L。D:Analysis of protein pET32a-eIF2α by Purification;M:Protein marker;1:Unpurified Protein sample;2:outflow 3-9:Liquid was washed by respectively urea in 40,80,120,160,200,240,280 mmol/L圖3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化和純化結(jié)果Fig.3 Results of optimization and Purification of recombinant protein expression

2.4 兔抗pET-32a(+)-eIF2α多克隆抗體的Western-blot鑒定結(jié)果及血清效價(jià)

對獲得的eIF2α多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析結(jié)果顯示(圖4.A)，證明該抗體為預(yù)期的目的蛋白。間接ELISA結(jié)果表明(圖4.B)，通過該免疫程序制備的兔多克隆抗體的效價(jià)可達(dá)到1∶8 000。

A:eIF2α陽性血清；B:兔多克隆血清的抗體A:EIF2 alpha positive serum；B:Rabbit polyclonal serum antibody圖4 重組蛋白的Western blot鑒定結(jié)果及血清效價(jià)Fig.4 Results of recombinant protein identification by Western blot and Serum tilter

3 討 論

eIF2α可以激活細(xì)胞凋亡的過程，也可以增加一些如肝臟和脂肪組織中JNK、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP94)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78/Bip等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中的標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平，尤其是其可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的蛋白表達(dá)水平，在目前對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的研究中尤其重要。磷酸化的PERK可以使elF2α也發(fā)生磷酸化，eIF2α通過磷酸化變?yōu)閜-eIF2α發(fā)揮作用，一方面使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子蛋白如GRP78、GRP94表達(dá)水平提高，另一方面p-eIF2α可以活化死亡蛋白caspase-12，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[6]。

有研究發(fā)現(xiàn)甘草酸就可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中PERK-eIF2α在不引起凋亡的情況下誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期[7-8]。在研究心力衰竭的試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了PERK的磷酸化并且上調(diào)eIF2α及其磷酸化[9]。當(dāng)腎組織缺10 min就可以引起腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，此時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶PERK分子被激活，磷酸化的eIF2 alpha可以增加20多倍[10]。除此之外，當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激、缺血缺氧、營養(yǎng)不良、病毒感染和鈣平衡失調(diào)等病理生理因素影響時(shí)，最終均會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，近年來隨著對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激無論在腫瘤、肝臟等疾病還是在細(xì)胞凋亡方面都有重要的作用，臨床實(shí)踐上用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來解釋疾病也越來越多，而PERK/eIF2α是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激先發(fā)生變化的蛋白，為了更好的研究禽類疾病獲得其多克隆抗體十分必要[11-13]。

大腸桿菌具有生長快、培養(yǎng)經(jīng)濟(jì)方便、表達(dá)水平高、可選載體和宿主多及遺傳性狀清晰等優(yōu)點(diǎn)，因此在本試驗(yàn)通過將eIF2α 構(gòu)建到常用的 pET32a(+ )載體中，在大腸桿菌中得到高效表達(dá)。本試驗(yàn)中重組融合蛋白中His標(biāo)簽的存在有利于該蛋白的純化，但仍有輕微雜帶，其原因可能是超聲上清中存在帶有His標(biāo)簽的其他蛋白或?qū)i2+更具親和力的雜質(zhì)。

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