綿羊凝血酶敏感因子1(TSP-1)基因的克隆及在不同生長時期卵泡中的表達

李曉林，陳 瑩，吳陽升，林嘉鵬，汪立芹，黃俊成，賈 斌

(1．新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院 生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部草食家畜遺傳育種與繁殖重點開放實驗室，新疆 烏魯木齊 830000；2.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

卵泡從原始卵泡發(fā)育成為排卵前卵泡的過程中，卵泡的表面積和直徑隨之增加。卵母細胞從這些卵泡庫中小批量、周期性的生長，并經(jīng)歷一系列的分裂和成熟過程，最終排卵。經(jīng)卵泡刺激素(FSH)處理一月齡羔羊后，可導(dǎo)致比成年羊多10倍以上的卵泡發(fā)育[1]。故以羔羊為供體可以為胚胎體外生產(chǎn)提供大量的卵母細胞資源，從而縮短世代間隔。對卵泡發(fā)育相關(guān)基因的篩選與功能研究對于綿羊的育種具有重要科學(xué)意義和應(yīng)用前景。課題組在比較激素誘導(dǎo)羔羊和成年羊激素誘導(dǎo)后發(fā)育卵泡顆粒細胞轉(zhuǎn)錄組差異時，鑒定300多個基因的轉(zhuǎn)錄水平有顯著差異。其中FSH誘導(dǎo)后羔羊TSP-1的表達顯著下調(diào)，而成年羊在激素誘導(dǎo)前后則無顯著變化[2]。故推測羔羊卵泡顆粒細胞中存在與成年羊不同的TSP-1信號通路，該通路可能與羔羊卵泡的超數(shù)發(fā)育數(shù)量有關(guān)，即與卵泡的募集有關(guān)。

凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin1，TSP-1)是一種最早分離于血小板膜中的基質(zhì)細胞蛋白[3]。從結(jié)構(gòu)上來看，TSP-1包括一個肝素結(jié)合球形的N末端，3個類型的重復(fù)序列，一個RGDA序列及一個C末端[4]。其中N末端可以與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白以及肝素硫酸蛋白多糖及一些整合素結(jié)合進而調(diào)節(jié)蛋白酶活性和對血管生成產(chǎn)生重要作用[5]。TSP-1具有多種生物學(xué)功能，可以與多種配體結(jié)合在血管生成、脂代謝、動脈粥樣硬化、腫瘤抑制和卵泡發(fā)育等方面發(fā)揮作用[6-8]。研究表明TSP-1廣泛分布于人的心、肺、腦[9]，牛的卵巢和羊的肺泡等組織中[10-11]，但關(guān)于該基因在綿羊除肺泡外各個組織中的分布和表達還沒有報道。

本文以新疆阿勒泰羊為研究對象，利用PCR擴增TSP-1 CDS區(qū)全長，對克隆的TSP-1的理化性質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)，功能域等進行生物信息學(xué)分析，同時構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹。在mRNA水平上分析TSP-1在不同組織和不同發(fā)育時期卵泡中表達差異，以期為后續(xù)深入研究TSP-1基因的功能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

阿勒泰羊選自新疆畜牧科學(xué)院綿羊繁育基地，在1周歲時選取5頭健康綿羊進行屠宰，取7個組織樣(心、肝、脾、肺、腎、肌肉、卵巢)，現(xiàn)場放于RNA保護劑中，4 ℃過夜保存，提取RNA。母羊屠宰后立即剪取卵巢并置于37 ℃生理鹽水中(含青、鏈霉素雙抗)，1～2 h內(nèi)運至實驗室。根據(jù)有腔卵泡直徑大小用剪刀和鑷子分離卵泡(<3 mm，小卵泡；3～5 mm,中卵泡；>5 mm，大卵泡)，用2 mL注射器抽取不同直徑卵泡中卵泡液[2]。每組有3個重復(fù)，每個重復(fù)包含來自3～5頭綿羊的卵泡混合成一個池(小有腔卵泡一般用10～15個卵泡做一個池；大有腔卵泡一般用3～5個卵泡做一個池)。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中綿羊TSP-1基因(XM_015096929.1)采用Primer 5.0軟件設(shè)計了3對引物(2對用于擴增TSP-1基因的CDS序列，1對為實時熒光定量引物)。以GAPDH基因作為內(nèi)參基因(登錄號：AF017079.1)，序列見表1。所有引物自行設(shè)計后由上海生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 TSP-1基因的PCR擴增及實時熒光定量PCR引物

1.3 總RNA提取及cDNA合成

利用Trizol酚-氯仿法抽提綿羊各個組織和不同直徑卵泡總RNA。2%凝膠電泳后于凝膠自動成像儀(Gene)中成像。利用核酸測定儀檢測總RNA的純度和濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以各個組織和不同直徑卵泡RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進行cDNA合成。反應(yīng)體系20 μL:5xTransScriptAll-in-One SuperMix for qPCR 4 μL，gDNA Remover 1 μL,總RNA 1 ng,加ddH2O至20 μL。

1.4 克隆測序

以綿羊第1條cDNA鏈為模板進行PCR擴增，體系為25 μL:cDNA 2 μL，2x Master SupermixTaq酶(北京全式金有限公司)12.5 μL，上下游引物各1 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min,10 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用DNA柱式膠回收試劑盒(北京全式金)純化后與pMD19-T載體連接。挑取單克隆菌落，接種于含AMP的0.5 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min振蕩3～4 h。根據(jù)菌液PCR結(jié)果，挑選陽性克隆送測序(上海生工)。

1.5 實時熒光定量PCR

以2 μL不同組織cDNA為模板，25 μL體系另外包括：Green qPCR SuperMix 12.5 μL,上下游引物各1 μL,RNase-free H2O 9 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性30 s;然后95 ℃ 5 s，引物特異Tm 15 min,55 ℃ 3 min，循環(huán)40次。熔解曲線分析:95 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min，然后以0.5 ℃/10 s的速率從55 ℃緩慢遞增到95 ℃。反應(yīng)在Rochol LightCycler 480 II熒光定量PCR儀上進行，每次每一板上設(shè)置標準品(重復(fù)3次)和1個陰性對照。

1.6 統(tǒng)計分析

基因的mRNA表達定量采用相對Ct(ΔCt)法：目標基因Ct-GAPDHCt.ΔCt值在進行樣品間比較(ΔΔCt)：樣品2ΔCt-樣品1ΔCt。實時熒光定量PCR的最終結(jié)果計算公式為2-ΔΔCt。

1.7 系統(tǒng)進化樹分析

根據(jù)克隆得到的TSP-1基因序列和從GenBank下載的基因序列核苷酸序列，使用Mega6.0中的鄰接法(NJ)構(gòu)建進化樹。不同物種GenBank登錄號見表2。

表2 不同物種GenBank登錄號

1.8 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件將TSP-1的核苷酸序列翻譯成氨基酸，通過DNAStar等生物信息學(xué)分析軟件和在線分析軟件預(yù)測蛋白的一級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、親/疏水性和信號肽、二級結(jié)構(gòu)等，預(yù)測所要使用的方法見表3。

表 3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測方法(軟件或網(wǎng)址)

2 結(jié) 果

2.1 TSP-1基因PCR擴增

M：BM2000DNA Marker；1,2：片段1,2 PCR擴增結(jié)果；3：陰性對照M：BM2000DNA Marker;1,2:Results of 1,2 PCR amplification;3:Negative control圖1 TSP-1基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification product of TSP-1 gene

利用引物TSP-1-1和TSP-1-2,擴增阿勒泰羊組織cDNA中的TSP-1基因CDS區(qū)序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測得到片段長度分別為1 714 bp和2 200 bp，條帶單一，片段長度與預(yù)期大小相符(圖1)。

2.2 TSP-1基因CDS區(qū)序列及蛋白功能位點分析

經(jīng)測序和拼接后，得到3 519 bp的CDS區(qū)全長，共編碼1 172個氨基酸(圖2)。與GenBank上Texel羊序列(登錄號：XM_015096929.1)相比，TSP-1的編碼區(qū)序列在737 bp和2 113 bp處分別有一個C→T和A→G的突變，氨基酸分析顯示均為無義突變。

2.3 蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析

利用在線軟件分析，TSP-1蛋白分子式為C5482H8612N1712O1557S54，原子總量為17 541，分子量約為129.48 ku,帶正電荷和負電荷的氨基酸殘基數(shù)分別為184和119個，其理論等電點pI為4.72；經(jīng)計算TSP-1蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為41.24(>40)，脂肪指數(shù)為58.87,最大疏水性位于第9位氨基酸(Score:2.433)，最大親水性位于744位氨基酸(Score:2.878)；整體來看親水性區(qū)域大于疏水性區(qū)域，總平均親水性為-0.713(<0)(圖3)；信號肽分析結(jié)果顯示TSP-1蛋白原裂解位點(C值)在和聯(lián)合裂解位點(Y值)在氨基酸19位評分最高(0.572和0.707)，信號肽存在于氨基酸的1～18位(圖4)；跨膜區(qū)分析TSP-1蛋白不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)；二級結(jié)構(gòu)分析TSP-1蛋白含13個α螺旋(alpha helix)，42個β折疊延伸鏈(extended strand)，103個轉(zhuǎn)角(turn)和86個無規(guī)則卷曲(random coil)(圖5)。

圖2 綿羊TSP-1基因的核苷酸序列及翻譯的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and translated amino acid sequence of TSP-1 gene in sheep

圖3 綿羊TSP-1蛋白的親/疏水性分析Fig.3 Hydrophilic/hydrophobic analysis of TSP-1protein in sheep

圖4 綿羊TSP-1蛋白信號肽分析Fig.4 Signal peptide analysis of TSP-1 protein in sheep

圖5 綿羊TSP-1蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig.5 The secondary structure analysis of TSP-1 protein in sheep

利用在線軟件分析TSP-1蛋白的功能位點發(fā)現(xiàn)，可能存在6個N-糖基化位點，其中位于249,361,1 053位氨基酸的位點潛在值大于0.5(0.672 8、0.706 3和0.558 8)；該蛋白還存在44個潛在的磷酸化位點，包括25個Ser,10個Thr和9個Tyr(圖 6)。

圖6 TSP-1蛋白存在的N-糖基化和磷酸化位點Fig.6 N-glycosylation and phosphorylation sites in TSP-1 protein

利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫分析TSP-1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSP-1蛋白與TSP-3蛋白含有2個長重復(fù)區(qū)、3個短重復(fù)區(qū)、6個C型Ga離子結(jié)合位點和一個N型Ga離子結(jié)合位點(圖7)。

圖7 TSP-1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域Fig.7 Functional domain of TSP-1 protein

2.4 系統(tǒng)進化樹分析

圖8 NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic tree constructed by NJ method

利用 Mega 6.0軟件構(gòu)建物種間分子系統(tǒng)進化樹,其中人與黑猩猩聚為一類，野馬和小鼠聚為一類，家雞與其他物種的遺傳距離較遠，綿羊與牛，野豬的遺傳距離較近(圖8)。

2.5 TSP-1基因在綿羊7個組織中的表達譜檢測

通過實時熒光定量PCR檢測了TSP-1基因在5頭阿勒泰羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、子宮中表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSP-1基因在這7個組織中都有表達，其中在肝臟、肺臟和腎臟中高表達，在脾臟和子宮中中等表達，在心臟和肌肉中低表達。其中肝臟和肺中表達量與心臟相比差異極顯著(P<0.01)，腎臟與心臟表達量相比差異顯著(P<0.05)(圖9)。

1:心臟;2:肌肉;3:卵巢;4:脾臟;5:腎臟;6:肝臟;7:肺臟 1:Heart;2:Muscle;3:Uterus;4:Spleen;5:Kidncy;6:Liver;7:Lung圖9 TSP-1基因在綿羊組織中表達情況Fig.9 The tissues expression profile of TSP-1 gene in sheep

圖10 TSP-1基因在綿羊不同生長期卵泡中表達情況Fig.10 Different growth stages expression of TSP-1 gene in sheep

2.6 TSP-1基因在綿羊不同生長時期卵泡中表達情況

通過實時熒光定量PCR檢測了TSP-1基因在不同生長時期卵泡中表達變化。結(jié)果顯示，隨著卵泡直徑的增大，TSP-1基因的表達也逐漸升高。其中，大、小卵泡表達量差異顯著(P<0.05)(圖10)。

3 討 論

卵母細胞的成熟離不開卵泡液和顆粒細胞，卵泡液是前者發(fā)育成熟的重要場所，而顆粒細胞分泌的蛋白和激素則調(diào)節(jié)卵母細胞的發(fā)育[12]。研究表明，TSP-1在多種動物卵巢組織中表達且對卵泡發(fā)育有一定作用，如小鼠TSP-1基因的敲除，可導(dǎo)致卵巢卵泡發(fā)育數(shù)量顯著增高，而排卵數(shù)則顯著受到抑制。James等[13]認為TSP-1在卵巢上直接抑制了VEGF的表達從而調(diào)控血管的發(fā)生與卵泡的發(fā)育。TSP-1在大鼠竇狀卵泡早期和黃體期的顆粒細胞中均有表達，但對FSH不敏感。同時TSP-1可促進大鼠體外培養(yǎng)的顆粒細胞凋亡，但不依賴于血管發(fā)生的信號通路[14-15]。與大鼠顆粒細胞對FSH敏感性不同的是，F(xiàn)SH的刺激牛顆粒細胞可誘導(dǎo)TSP-1的表達[16]。作為最早發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制因子[17]，近年來TSP-1在腫瘤中的表達與預(yù)后關(guān)系研究中研究較多，已經(jīng)明確的是TSP-1的生物學(xué)功能受多種因子的調(diào)控，如：生長因子、細胞因子、癌基因等[18-20]。通過超排后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析比較推測，TSP-1基因可能在綿羊卵泡發(fā)育中具有調(diào)控作用。

本研究通過兩次PCR擴增獲得TSP-1基因CDS區(qū)序列。與NCBI上的預(yù)測序列對比發(fā)現(xiàn)兩個突變位點，翻譯成氨基酸比對發(fā)現(xiàn)均為無義突變。系統(tǒng)進化樹分析表明綿羊與牛，野豬的遺傳距離較近。將克隆到的核苷酸序列及翻譯成的氨基酸進行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TSP-1蛋白整體帶正電荷，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，整體來看親水性區(qū)域大于疏水性區(qū)域。對其跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽進行分析后發(fā)現(xiàn)，TSP-1蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，在氨基酸的1～18位有一個信號肽。若蛋白質(zhì)序列含有跨膜區(qū)表明其可能是以膜受體的形式發(fā)揮作用，也可能是定位于膜上的錨定蛋白或離子通道蛋白，信號肽則是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分 泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈。故本研究的結(jié)果表明，TSP-1蛋白能與其他的配體相互作用進而發(fā)揮其生物學(xué)作用。糖基化和磷酸化都是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后重要的修飾方式，通過在線軟件分析后發(fā)現(xiàn)，TSP-1蛋白可能存在6個N-糖基化和50個潛在O-糖基化位點，以及44個潛在的磷酸化位點。結(jié)果表明TSP-1蛋白在翻譯后中有豐富的修飾。同時分析發(fā)現(xiàn)TSP-1蛋白與TSP-3蛋白含有2個長重復(fù)區(qū)、3個短重復(fù)區(qū)、6個C型Ga離子結(jié)合位點和一個N型Ga離子結(jié)合位點。

研究表明，TSP-1在小鼠，大鼠，牛等動物的各個組織中均有表達。但在綿羊各個組織中的表達和分布報道較少[21]。本試驗研究表明TSP-1基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、子宮這7個組織中都有表達，其中在肝臟、肺臟和腎臟中高表達，在脾臟和子宮中中等表達，在心臟和肌肉中低表達。隨著卵泡直徑的增大，TSP-1基因的表達也逐漸升高。這在一定程度上反映了TSP-1基因可能在綿羊卵泡發(fā)育中具有重要作用。

4 結(jié) 論

本研究利用PCR擴增和克隆測序獲得了TSP-1基因CDS全長為3 519 bp，共編碼1 172個氨基酸。TSP-1蛋白為脂溶性親水蛋白，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，沒有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，在氨基酸1～18位存在1個信號肽，存在6個N-糖基化和44個潛在的磷酸化位點，包括25個Ser,10個Thr和9個Tyr。系統(tǒng)進化樹分析顯示，綿羊與牛的親緣關(guān)系較近，與人、小鼠和雞等親緣關(guān)系較遠。檢測不同組織和不同直徑卵泡中TSP-1基因發(fā)現(xiàn)：TSP-1基因在這7個組織中都有表達。同時隨著卵泡直徑的增大，TSP-1基因的表達也逐漸升高。本研究初步探討了TSP-1基因的結(jié)構(gòu)和功能，但該基因在卵泡發(fā)育過程中的作用和機制需進一步研究。

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