辣椒根際鏈霉菌WKFF34的分離鑒定及拮抗作用

韋坤逢,王 麗,李燦燦,黃 劍

(綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程國家重點實驗室培育基地/教育部綠色農(nóng)藥與生物工程重點實驗室/貴州大學(xué)精細化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

根際是微生物生活的主要活動場所之一，德國科學(xué)家Lorenz Hiltner首次提出根際微生物的概念，認為植物是否發(fā)病以及作物品質(zhì)的好壞與其根際微生物的組成直接相關(guān)[1]。根際微生物被譽為植物的第二套基因組[2]，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，根際微生物中的一些成員有益于植物的生長，而有些則企圖通過與植物的保護機制相對抗從而導(dǎo)致植物染病，一部分甚至還威脅到人類的健康[3]。盡管目前對根際微生物的重要性已經(jīng)得到廣泛的認識，但是人類對數(shù)目巨大的根際微生物的了解仍然知之甚少。植物根際中放線菌分布廣泛，僅次于細菌[4]，放線菌作為最具吸引力的一類微生物資源是因為其能產(chǎn)生具有極高商業(yè)價值的抗生素和其它生物活性物質(zhì)，如維生素、生物堿、植物促生物質(zhì)、酶以及酶抑制劑等等[5-6]。抗生素能夠有效防治多種人類致病菌和農(nóng)作物的某些病害，具有無污染、無毒、無殘留等優(yōu)點，而大約2/3的天然抗生素是來自放線菌[7]，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

目前，放線菌作為一類綠色的生物源農(nóng)藥來源，世界各國對放線菌的研究與資源開發(fā)極為重視。盡管過去數(shù)十年對產(chǎn)抗生素放線菌進行了大量的研究[8]，近年放線菌中新的和有價值的生物活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)持續(xù)下降[9]，然而對地球上微生物的研究，人們現(xiàn)在已經(jīng)分離、鑒定和對其相關(guān)性質(zhì)進行研究的種類也不到總數(shù)的1%～10%[10]。仍然有新的放線菌和化合物被不斷挖掘[11]，而且通過改善根際微生物生態(tài)環(huán)境來促進植物生長、增加植物抗逆性等方面的研究也日益成為人們研究的熱點，因此，為了作物的健康生長，仍然有必要對植物根際微生物的組成及其作用進行進一步的研究，從根際放線菌中尋找農(nóng)抗活性物質(zhì)或利用生防菌防治植物病害仍然是國內(nèi)外研究的熱點，具有廣闊的前景。

本研究為豐富生防放線菌資源，尋找活性優(yōu)良的候選菌株，以貴州花溪辣椒傳統(tǒng)種植地根際土壤為研究對象進行微生物拮抗活性篩選，從中分離到一株具有較強拮抗作用的根際放線菌WKFF34，通過形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化特性、拮抗活性、16S rRNA序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究，對該菌株進行了鑒定，為今后該放線菌菌株的研究與利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤樣品采集與處理 采自貴州省貴陽市花溪區(qū)黨武鄉(xiāng)辣椒種植區(qū)露地辣椒根際土壤(海拔1 170 m)，樣品置無菌袋后混合，冰盒保存帶回實驗室4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試植物病原菌 靶標(biāo)細菌為：白菜軟腐病菌(Erwiniacarotorora)、柑橘潰瘍病菌(Xanthomonasaxonopodispv.citri)、煙草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)。靶標(biāo)真菌為：水稻紋枯病原菌(Thanatephoruscucumeris)、蘋果炭疽病原菌(Glomerellacingulata)、油菜菌核病原菌(Sclerotiniasclerotiorum)、蘋果腐爛病原菌(Cytosporamandshurica)、茄子黃萎病原菌(Verticilliumdahliae)、小麥赤霉病原菌(Gibberellazeae)、馬鈴薯晚疫病原菌(Phytophthorainfestans)、辣椒疫霉病原菌(Phytophthoracapsici)和番茄灰霉病原菌(Botrytiscinerea)。以上病原菌均保存于貴州大學(xué)精細化工研究開發(fā)中心生測室。

1.1.3 供試藻種 藻種銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa) 購自中國科學(xué)院水生生物研究所藻種保藏中心。

1.1.4 主要培養(yǎng)基 放線菌分離純化培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基。真菌檢測用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。細菌檢測用培養(yǎng)基為溶菌肉湯培養(yǎng)基(LB)。培養(yǎng)特征用培養(yǎng)基為：酵母抽提物培養(yǎng)基(ISP2)、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(ISP3)、無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基(ISP4)、甘油-天冬酰胺培養(yǎng)基(ISP5)、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基、蔡氏培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等。發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉5 g，葡萄糖3 g，大豆粉5 g，蛋白胨4 g，酵母膏4 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，CaCO30.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO40.5 g，蒸餾水1000 mL，pH值7.2～7.4。藻種培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 放線菌菌株的分離 采用平板連續(xù)稀釋法。將土樣自然風(fēng)干10 d，充分研缽磨細過60目篩，稱取研細的土壤樣品5 g，加入滅菌水45 mL，并加入5顆滅菌的玻璃珠，200 r/min 28 ℃充分振蕩20 min，制成10-1土壤濃度懸浮液備用。待土粒沉淀后，再用10倍稀釋法進行稀釋處理。吸取1 mL上清液，移入盛有9 mL滅菌水的10 mL離心管中，制成10-2土壤濃度懸浮液。依此類推，依次稀釋制成10-3、10-4、10-5和10-6土壤濃度懸浮液，吸取上述10-3、10-4、10-5和10-6土壤濃度懸浮液200 μL于高氏一號培養(yǎng)基平板上(加50 mg/L重鉻酸鉀和25 mg/L奈啶酮酸作為抑制劑)進行菌種分離，用滅菌涂布棒涂布均勻。每個梯度設(shè)3個重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)5～30 d，待菌落長出后，適時挑選不同形態(tài)的菌株，通過多次劃線法純化后轉(zhuǎn)接到高氏一號斜面保存。

1.2.2 菌株發(fā)酵液的制備 將放線菌WKFF34在高氏一號瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃活化5 d后，接種于裝有100 mL高氏一號液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，180 r/min 28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d，再按10%的接種量于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，180 r/min 28 ℃振蕩培養(yǎng)7 d。然后將發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心20 min，0.22 μm濾膜過濾得菌株發(fā)酵液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株生物活性測定 (1)抗細菌活性測定。挑取少量供試細菌病原菌于LB液體培養(yǎng)基，180 r/min 28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，取200 μL菌液于固體LB培養(yǎng)基平板上涂布均勻。再將待測的放線菌菌餅置于平板中央，使菌落一面緊貼于LB固體培養(yǎng)基表面，對照只接靶標(biāo)菌，每個處理重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用十字交叉法測量抑菌圈的直徑，測定其抑菌活性。(2)抗真菌活性測定。1)初篩采用平板對峙法進行菌株WKFF34的抑菌活性測定[12]。將培養(yǎng)好的供試植物病原菌菌餅(直徑6 mm)，倒貼接種于PDA平板的中央，距離病原菌左右各30 mm處接種生長5 d的菌株WKFF34菌餅，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4～7 d。對照只接靶標(biāo)菌，每處理設(shè)重復(fù)3次，待對照長滿3/4培養(yǎng)皿時，觀察是否有拮抗作用并測量抑菌條帶的寬度。以抑菌條帶的寬度作為抑菌活性強弱的標(biāo)志：“+”為抑菌條帶寬度0.5≤D≤5 mm，表示抑菌活性弱；“++”為抑菌條帶寬度6≤D≤15 mm,表示抑菌活性較強；“+++” 為抑菌條帶寬度16≤D≤35 mm，表示抑菌活性很強。2)復(fù)篩采用抑制菌絲生長速率法測定拮抗菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性及抗菌譜[13]。將菌株WKFF34發(fā)酵濾液按1∶9的比例與融化的PDA培養(yǎng)基(45～50 ℃)混勻，倒平板制成帶藥培養(yǎng)基。以加入等體積的無菌發(fā)酵培養(yǎng)液的PDA培養(yǎng)基作為對照。在平板中央接種直徑為6 mm的靶標(biāo)菌菌餅，使帶菌絲一面貼在培養(yǎng)基表面。每處理重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～7 d，待對照長滿3/4培養(yǎng)皿時，用十字交叉法測量對照組和處理組菌落直徑，計算抑制率。

抑制率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑] ×100%

(1)

(3)溶藻活性測定。采用改進的雙層藻平板法測定WKFF34菌株的溶藻活性[14]。將BG11固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中作為底層，待培養(yǎng)基凝固之后，將BG11半固體培養(yǎng)基與培養(yǎng)好的銅綠微囊藻按1∶1的比例混合作為上層，凝固之后，將雙層藻平板在溫度為28 ℃，光暗周期為L∶D=12 h∶12 h,光照強度約為2 000 lx的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 d。再將培養(yǎng)好的放線菌WKFF34的菌餅反貼雙層藻平板中央，同樣條件下培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量溶藻圈的直徑，觀察其溶藻活性。對照為不接種放線菌的雙層藻平板。(4)藥物敏感性試驗。采用抗生素藥敏紙片，在高氏一號固體培養(yǎng)基上通過平板擴散法進行。將菌株于高氏一號液體培養(yǎng)基28 ℃搖床培養(yǎng)72 h后，取200 μL均勻涂布于平板上，貼上藥敏紙片，設(shè)3個重復(fù)，28～30 ℃培養(yǎng)48 h后測量抑菌圈直徑，計算平均值，根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準化協(xié)會(CLSI)的標(biāo)準判斷其藥敏性。

1.2.4 菌株特征和分類鑒定 (1)菌株形態(tài)特征觀察。采用高氏一號培養(yǎng)基于28 ℃下進行平板插片法培養(yǎng)[15]，培養(yǎng)7 d后，用光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察氣生菌絲、基內(nèi)菌絲及孢子絲的形態(tài)特征。(2)菌株的培養(yǎng)特征觀察。參照國際鏈霉菌計劃中有關(guān)放線菌的培養(yǎng)特征描述所采用的標(biāo)準培養(yǎng)基進行培養(yǎng)特征的測定[16]。所用培養(yǎng)基為ISP2、ISP3、ISP4、ISP5等，于28 ℃培養(yǎng)14 d后，觀察和記錄菌株的培養(yǎng)特征，包括生長情況、氣生菌絲、基內(nèi)菌絲和可溶性色素狀況等。(3)菌株生理生化特性。參照Shirling方法[16]和中國科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組《鏈霉菌鑒定手冊》進行[17]。(4)菌株系統(tǒng)發(fā)育分析。分子生物學(xué)鑒定采用16S rRNA序列分析方法[18]。用Chelex-100改進法提取菌株基因組DNA[19]，用細菌16S rRNA通用擴增引物27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492R(5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT-3′)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為總體積50 μL(包含10×buffer 5.0 μL，dNTP 4.0 μL，引物27F 1.0 μL，引物1492R 1.0 μL，Taq酶0.3 μL，DNA模版1.0 μL，雙蒸水37.7 μL)。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢查合格后進行測序。

將測得的16S rRNA序列在NCBI中用Blast軟件與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中已知的相關(guān)種屬進行序列同源性分析，選取同源性比較高的相關(guān)模式菌株，采用Clustal X1.83軟件進行多序列比對，用MAGA 5.0軟件中Kimura 2-Parameter Distance模型進行多序列匹配排列，采用鄰接法(Neighbor-joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，其中Bootstrap檢驗的重復(fù)次數(shù)為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株WKFF34分離及其對植物致病菌的抑菌活性

通過連續(xù)稀釋平板法，從采集的健康辣椒根際土壤中，依據(jù)菌落形態(tài)、色澤、生長速度等表觀特征的差異，對辣椒根際放線菌進行分離和純化，共得到87株放線菌，通過參試細菌和真菌對分離的放線菌菌株進行了拮抗活性的初篩和復(fù)篩，得到一株拮抗活性強的放線菌菌株WKFF34。通過平板涂布法，發(fā)現(xiàn)菌株WKFF34對柑橘潰瘍病菌和煙草青枯病菌有一定抑制作用，抑菌圈直徑分別為16 mm和8 mm，對白菜軟腐病菌則沒有抑菌活性，結(jié)果見表1。

表1 菌株WKFF34對3種植物病原細菌的抑菌活性

“-”表示沒有抑菌圈。

“-”means no inhibition zone.

通過平板對峙法，進行了菌株WKFF34對6種植物病原菌的抑菌活性初篩，結(jié)果見表2。研究發(fā)現(xiàn)，菌株WKFF34對6種植物病原菌均有不同程度的抑制作用，其中對油菜菌核病菌和茄子黃萎病菌的抑制效果顯著，其抑菌條帶分別為30 mm和24 mm。

表2 放線菌WKFF34菌株對6種植物病原菌的抑菌作用初篩

2.2 菌株WKFF34發(fā)酵液對植物病原菌的拮抗活性復(fù)篩及抗菌譜

采用菌絲生長速率法進行了菌株發(fā)酵濾液對9種植物病原菌的拮抗活性復(fù)篩。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株WKFF34的發(fā)酵液具有廣譜的抑菌活性，對多種供試植物病原菌都表現(xiàn)出不同程度的抑制活性(表3)。菌株WKFF34的抑菌譜較廣，相比之下對真菌類的油菜菌核病原菌的抑制活性最高，抑制率為80.43%，對蘋果炭疽病原菌、水稻紋枯病原菌、茄子黃萎病原菌也具有較強的抑菌活性，抑制率均分別為79.48%、70.00%和63.63%。對小麥赤霉病原菌的抑制效果較差，為16.35%；對卵菌類的馬鈴薯晚疫病菌和辣椒疫霉病菌具有一定的抑制作用，其抑制率分別為46.15%和49.07%。說明該菌株對不同屬的多種植物病原菌表現(xiàn)出較好的抑菌效果。

表3 WKFF34菌株發(fā)酵液對9種植物病原菌菌絲生長的抑制作用

數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P<0.05水平顯著差異(Duncan氏新復(fù)極差法)。

The data were the average of three replicates.The different small letters after the same column figures indicated significant difference at the level ofP<0.05 by Duncan’s new multiple range test.

2.3 抗生素藥敏性測定結(jié)果

采用平板擴散法，對菌株WKFF34進行了11類，共30種抗生素的藥敏試驗，結(jié)果見表4。從表4可以看出，菌株WKFF34對7類12種抗生素如四環(huán)素、復(fù)方新諾明、萬古霉素、氯霉素、米諾環(huán)素、麥迪霉素、強力霉素、多粘菌素、新霉素、慶大霉素、阿米卡星和氨芐西林敏感，對其余18種抗生素如呋喃唑酮、氯氟沙星、克林霉素、諾氟沙星、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星、紅霉素、氧氟沙星、青霉素、苯唑西林、羧芐西林和哌拉西林耐藥。

表4 菌株WKFF34的抗生素藥敏測定

“-”為沒有抑菌圈，S為敏感，R為耐藥，根據(jù)CLSI標(biāo)準判定。

“-”means no inhibitory zone,“S” means susceptible and “R” means resistant(R) according to the cut-off values by CLSI standards interpretation.

2.4 菌株WKFF34的溶藻活性

通過雙層藻平板法測定了菌株對銅綠微囊藻的溶藻作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株WKFF34對銅綠微囊藻具有明顯的溶藻圈，溶藻圈直徑為22 mm(圖1)。說明菌株WKFF34菌株對銅綠微囊藻具有溶藻活性。

圖1 菌株WKFF34對銅綠微囊藻的溶藻圈Fig.1 The algae-lysing zoom of strain WKFF34 to Microcystis aeruginosaon double algae plate

2.5 菌株特征及多相分類鑒定

A:菌落,B:菌絲(光鏡,400×),C:孢子鏈(掃描電鏡,3K×),D:孢子(掃描電鏡,20K×)A:Colony,B:Mycelium(OM,400× ),C:Spore chains(SEM,3K×),D:Spores(SEM,20K×)圖2 菌株WKFF34的菌落、菌絲和孢子的形態(tài)特征Fig.2 Morphology of mycelium and spores of strain WKFF34

2.5.1 形態(tài)與培養(yǎng)特征 菌株WFKK34在高氏一號培養(yǎng)基上生長良好，在培養(yǎng)基上剛長出來時呈白色，隨培養(yǎng)時間延長，孢子堆由薄變厚，菌落顏色由白色變?yōu)闇\黃色，見圖2(A)。在光學(xué)顯微鏡(OM)下觀察發(fā)現(xiàn)，菌株WKFF34氣生菌絲豐富無隔閡，基內(nèi)菌絲不斷裂，分枝多，不斷裂，見圖2(B)。通過掃描電鏡(SEM)對菌株WKFF34的孢子鏈和孢子形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)菌株WKFF34的孢子鏈直且長，偶有波曲，孢子呈棒狀、光滑、不運動，孢子頂端及側(cè)面略有凹陷，且孢子長為7～13 μm，寬在5～7 μm，結(jié)果見圖2(C、D)。

對菌株WKFF34在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征進行了觀察研究，發(fā)現(xiàn)其在大多數(shù)培養(yǎng)基上都能正常生長，結(jié)果見表5。菌株WKFF34除在ISP4、察氏培養(yǎng)基、葡萄糖酵母培養(yǎng)基上生長情況一般外，其他培養(yǎng)基的生長情況均良好；菌絲白色至黃色，在高氏一號，馬鈴薯葡萄糖瓊脂，淀粉銨瓊脂，察氏培養(yǎng)基上不產(chǎn)生可溶性色素。

2.5.2 生理生化特征 對菌株WKFF34的部分生理生化特征進行了測定，結(jié)果見表6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株WKFF34能利用多種物質(zhì)為碳源、氮源；淀粉水解，明膠液化，硝酸鹽還原反應(yīng)呈陽性；牛奶凝固和胨化，纖維素水解反應(yīng)，H2S產(chǎn)生呈陰性。

2.5.3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 放線菌WKFF34的16S rRNA PCR產(chǎn)物經(jīng)過測序后得到的基因核苷酸序列為1 412 bp，GenBank的序列注冊號為KY630730。用Blast軟件從GenBank等數(shù)據(jù)庫中進行序列相似性搜索，發(fā)現(xiàn)WKFF34菌株與鏈霉菌屬菌株高度相關(guān)，WKFF34菌株與鏈霉菌屬菌株的同源性為99%～100%，說明該菌株屬于鏈霉菌屬成員。用鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹見圖3。菌株WKFF34在系統(tǒng)進化樹上與多株鏈霉菌屬菌株的遺傳距離很小，與藍微褐鏈霉菌模式菌株S.cyaneofuscatusJCM4364(AY999770)相似性為99.64%、S.luridiscabieiS63(AF361784，相似性為99.49%)、S.californicusNBRC3368(AB184755，相似性為99.35%)、S.albovinaceusNBRC12739(AB249958，相似性為98.92%) 聚在同一分支上，序列相似性極高。綜合該菌株的形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，并與藍微褐鏈霉菌模式菌株StreptomycescyaneofuscatusJCM 4364的特征進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者極為相似，鑒定菌株WKFF34屬于鏈霉菌屬Streptomyces成員，為有效發(fā)表種藍微褐鏈霉菌Streptomycescyaneofuscatus的一個菌株，命名為StreptomycescyaneofuscatusWKFF34。

表5 菌株WKFF34的培養(yǎng)特征

“—”為不產(chǎn)生可溶性色素。

“—”means no soluble pigment.

“+”表示陽性，“-”表示陰性。

“+” tested Positive,“-” tested Negative.

分支處的數(shù)值為Bootstrap 法重復(fù)1 000次評估得到各節(jié)點支持率；標(biāo)尺0.01為進化距離。Numbers at nodes indicating values for each node out of 1 000 bootstrap replications;Scale 0.01 meaning evolutionary distance.圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株WKFF34和相關(guān)鏈霉菌屬典型菌株的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strain WKFF34 and related Streptomyces strains

3 結(jié)論與討論

放線菌作為重要的微生物資源，受到人們的關(guān)注已數(shù)十年，大量的研究發(fā)現(xiàn)放線菌能產(chǎn)生多種具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，如抗生素、抗腫瘤物質(zhì)、抗菌活性物質(zhì)、免疫抑制劑、植物生長促生活性物質(zhì)和一些酶類等等，廣泛應(yīng)用醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。盡管近年來新型抗生素的篩選難度越來越大，但研究發(fā)現(xiàn)來自不同生境的可培養(yǎng)放線菌仍然是目前微生物源生物活性物質(zhì)的最重要資源，一種微生物可以產(chǎn)生大量的次生代謝物，最高可達50種化合物[20]。人類對新型高生物活性抗生素等生物活性物質(zhì)的需求，從各種環(huán)境中對產(chǎn)抗生素和多種生物活性物質(zhì)的新放線菌資源的篩選依然具有很大的吸引力和必要性。

本研究發(fā)現(xiàn)分離自辣椒根際土壤的菌株WKFF34具有典型的鏈霉菌屬特點，16S rRNA序列分析菌株WKFF34與藍微褐鏈霉菌模式菌株StreptomycescyaneofuscatusJCM4363(AY999770)具有最大的相似性，達99.64%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分枝，親緣關(guān)系最近。基于16S rRNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，通過比較兩者之間的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征、以及生理生化特征測定結(jié)果，將菌株WKFF34鑒定藍微褐鏈霉菌StreptomycescyaneofuscatusWKFF34(序列注冊號為KY630730)。

關(guān)于藍微褐鏈霉菌Streptomycescyaneofuscatus的研究主要集中在醫(yī)學(xué)與小分子物質(zhì)方面[21-22]，如能產(chǎn)具有抗腫瘤活性的色霉素[23-25]、蒽環(huán)霉素類[26-28]等不同結(jié)構(gòu)類型的抗生素，抗菌活性方面的研究也僅是針對部分人體致病菌的抗菌作用，如黃苛從銀杏根際土壤中分離到S.cyaneofuscatusJSM 20.1菌株的發(fā)酵產(chǎn)物對革蘭氏陰性菌(產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌)、陽性菌(枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌和金黃色葡萄球菌)及真菌(白色念珠菌)有較好抑制作用[29]，劉曉瑜等[30]從多種藥用植物中分離到的5株內(nèi)生鏈霉菌菌株(GS3、GS10、MD1、MD2和GXDJ6)，經(jīng)鑒定均為S.cyaneofuscatus菌株，對耐甲氧金黃色葡萄球菌(MRSA)具有拮抗作用。而針對該菌株涉及到的農(nóng)用拮抗活性報道極少，僅見Xue 等[31]從青海油菜的根際放線菌中分離到的一株S.cyaneofuscatusZY-153菌株，發(fā)現(xiàn)對棉花黃萎病具有拮抗作用，同時在種子包衣和土壤接種試驗中表現(xiàn)出一定的生防作用，其它關(guān)于藍微褐鏈霉菌的農(nóng)用拮抗活性未見報道。因此本研究通過對菌株WKFF34在農(nóng)用生物活性的測定，發(fā)現(xiàn)該菌株具有與前人研究不一樣的更廣譜的抗菌活性，首次發(fā)現(xiàn)菌株WKFF34對細菌性的柑橘潰瘍病菌、煙草青枯病菌具有抑菌活性，但對白菜軟腐病菌無活性；抗真菌活性方面，發(fā)現(xiàn)放線菌WKFF34的發(fā)酵液對多種供試植物病原菌都表現(xiàn)出不同程度的抑制活性，具有廣譜的抑菌活性，其中對油菜菌核病原菌的抑制活性最高，抑制率為80.43%，對蘋果炭疽病原菌、水稻紋枯病原菌、茄子黃萎病原菌也具有較強的抑菌活性，抑制率均分別為79.48%、70.00%和63.63%，對蘋果腐爛病原菌以及番茄灰霉病原菌也有一定的抑制作用；值得注意的是對卵菌類的馬鈴薯晚疫病菌和辣椒疫霉病菌也具有一定的抑制作用，抑制率分別為46.15%和49.07%；但對小麥赤霉病原菌的抑制效果較差，抑制率僅為16.35%。研究結(jié)果顯示藍微褐鏈霉菌WKFF34菌株的發(fā)酵液對多種植物病原菌表現(xiàn)出較好的抑菌效果，顯示出該菌株在農(nóng)用拮抗活性方面具有良好的開發(fā)利用價值。本研究還首次測定了菌株WKFF34對11類30種抗生素的敏感性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株對青霉素類中的氨芐西林，大環(huán)內(nèi)酯類的麥迪霉素，多肽類的萬古霉素與多粘菌素，磺胺類的復(fù)方新諾明，酰胺類的氯霉素，氨基糖苷類的阿卡米星、慶大霉素和新霉素，四環(huán)素類的四環(huán)素、米諾環(huán)素和強力霉素等7類12種抗生素保持敏感性。

令人感興趣的是，菌株WKFF34對導(dǎo)致淡水發(fā)生藍藻水華的銅綠微囊藻也具有明顯的溶藻活性。前人研究發(fā)現(xiàn)對銅綠微囊藻等藍藻具有溶藻活性的細菌較多[32]，具有溶藻作用的放線菌報道相對較少[33]。本研究首次發(fā)現(xiàn)藍微褐鏈霉菌對銅綠微囊藻具有溶藻活性，對進一步拓寬了放線菌對水華污染進行生物防治研究具有重要意義，為放線菌應(yīng)用于藍藻導(dǎo)致的淡水環(huán)境問題的生物防治提供了一種潛在的微生物資源。

由于前人研究發(fā)現(xiàn)藍微褐鏈霉菌具有優(yōu)良的產(chǎn)生多種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物活性物質(zhì)能力，而目前該菌株應(yīng)用于防治植物病害的研究極少，開展對菌株WKFF34的農(nóng)用生物活性研究可以為其在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，有關(guān)該菌株對植物病害的防治實驗、農(nóng)用抗菌物質(zhì)的分離純化及其防病抑菌機理，包括對銅綠微囊藻的溶藻作用物質(zhì)分離與溶藻機理等均有待進一步研究。

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