淫羊藿苷對(duì)大鼠精子質(zhì)量和精核蛋白作用的影響*

葛 斌，石 燕，王露娟（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心，貴州遵義563000）

雄性生殖系統(tǒng)損害導(dǎo)致的不育癥已普遍受到國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注[1]。精核蛋白（TNBP）是一種與雄性生育能力密切相關(guān)的堿性蛋白質(zhì)，大鼠精核蛋白（RP）含量在反映精子質(zhì)量方面有著重要意義[2]。淫羊藿苷（ICA）作為一種傳統(tǒng)中藥，可以抑制生精細(xì)胞凋亡、促進(jìn)睪酮分泌并提高陰莖海綿體鳥苷環(huán)磷酸（cGMP）水平。本研究通過觀察不同劑量ICA對(duì)大鼠精子質(zhì)量和TNBP表達(dá)的影響，探索ICA在治療不育癥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠80只，體重210～235 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院動(dòng)物中心提供。合格證編號(hào)：20150017，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度：25℃，濕度：50%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 腺嘌呤由上海遠(yuǎn)幕生物科技有限公司提供；ICA由南京澤朗生物有限公司提供，純度大于或等于98%。

1.1.3 分組 將80只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、ICA低劑量組、ICA高劑量組，每組20只。

1.2 方法

1.2.1 建立模型 對(duì)照組：蒸餾水3 mL灌胃60 d；模型組：腺嘌呤25 mg/100 g和用蒸餾水3 mL配置后灌胃30 d，再以蒸餾水3 mL灌胃30 d；ICA低劑量組：先用腺嘌呤25 mg/100 g和蒸餾水3 mL配置后灌胃30 d，再以ICA 1.8 g/kg和蒸餾水3 mL配置后灌胃30 d；ICA高劑量組：先用腺嘌呤25 mg/100 g和蒸餾水3mL配置后灌胃30d，再以ICA3.6g/kg和蒸餾水3 mL配置后灌胃30 d。

1.2.2 附睪精液采集和測(cè)定 按照文獻(xiàn)[3]方法處死大鼠、采集精液，在37℃恒溫水浴箱液化10 min后置于精子全自動(dòng)分析儀上測(cè)定。

1.2.3 精子堿性蛋白提取及電泳 按照文獻(xiàn)[2]方法提取堿性蛋白，在酸性-尿酸系統(tǒng)中進(jìn)行電泳分析，結(jié)果掃描測(cè)量條帶數(shù)值，總堿性蛋白（TH）/RP比值代表TNBP相應(yīng)含量。

1.2.4 觀察指標(biāo) 精子密度：每毫升精液的精子數(shù)；精子活率：活動(dòng)精子/精子總數(shù)；精子活力：前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)/精子總數(shù)；TNBP相應(yīng)含量：TH/RP。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠精子質(zhì)量比較 模型組、ICA低劑量、ICA高劑量組精子密度、活率和活力均顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ICA低劑量組大鼠精子密度和活力與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ICA高劑量組活率和活力均顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），精子密度與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠精子質(zhì)量比較（±s）

表1 各組大鼠精子質(zhì)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對(duì)照組模型組ICA低劑量組ICA高劑量組活力（%）38.22±5.66 16.04±4.16a 18.40±7.74a 26.65±5.52ab密度（×106mL-1）38.53±3.77 12.98±4.16a 14.71±6.10a 14.64±6.65a活率（%）53.57±5.83 22.74±6.11a 27.32±6.63a 38.73±7.37ab

2.2 各組大鼠TNBP含量比較 模型組和ICA低劑量組、ICA高劑量組TH、TH/RP值均顯著高于對(duì)照組，RP值顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ICA高劑量組TH、TH/RP值均顯著低于模型組，RP值顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠TNBP含量比較（x±s）

3 討 論

目前，男性不育患者發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，近20年來，人類精子數(shù)量平均每年以2%的速度下降。不育不僅影響患者的身心健康，而且還會(huì)帶來一些社會(huì)問題，因此，男性不育癥的研究已經(jīng)引起全世界的高度重視。

腺嘌呤可損傷睪丸組織、曲精小管，并導(dǎo)致生精細(xì)胞和TNBP數(shù)量減少、變性，常用于構(gòu)建睪丸損傷大鼠模型[3]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤大鼠模型無論是精子密度、活力、活率和TNBP均顯著低于對(duì)照組，說明模型建立比較成功。

TNBP又稱魚精蛋白，是在晚期精子細(xì)胞中出現(xiàn)的一類富含精氨酸和半胱氨酸的堿性蛋白質(zhì)。根據(jù)氨基酸的組成序列可分為兩類，一類是P1TNBP，存在于所有哺乳動(dòng)物精子細(xì)胞中；另一類為P2TNBP，只存在于人類及很少一部分哺乳動(dòng)物中。TNBP主要功能是濃縮精子細(xì)胞核，保護(hù)DNA的遺傳信息。

近年研究發(fā)現(xiàn)，精子細(xì)胞內(nèi)組蛋白-精核蛋白反應(yīng)（HPRR）和TNBP的數(shù)量與生育能力有密切關(guān)系[4-5]。哺乳動(dòng)物精子從精原細(xì)胞發(fā)育為成熟精子的過程中，精子細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合體細(xì)胞類型組蛋白，逐漸被TNBP取代，這個(gè)過程稱HPRR，通過HPRR，最終成為高濃度的精子特異性染色質(zhì)。成熟精子內(nèi)的堿性核蛋白主要為TNBP[6]。WU等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)素依賴蛋白激酶4（Camk4）的信使作用與TNBP的轉(zhuǎn)化有關(guān)。1976年，SILVESTRONI等[8]首次報(bào)道15例少精子癥不育患者的成熟精子缺乏TNBP成分，認(rèn)為這是導(dǎo)致原發(fā)性不育癥的原因之一。CARRELL等[9]的研究也發(fā)現(xiàn)，P2精核蛋白異常與生育力減退有關(guān)。DE YEBRA等[10]報(bào)道，116例男性少弱精癥患者TNBP異常率為77.5%，且有些患者P2 TNBP完全缺失。陳暉等[11]對(duì)1 050例少弱精癥患者TNBP分析提示，異常率為81.05%，認(rèn)為男性TNBP指標(biāo)可供臨床評(píng)價(jià)精子受孕能力。費(fèi)江楓等[12]研究發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤誘導(dǎo)的不育大鼠精子中TNBP及其mRNA含量明顯低于正常組。

ICA為淫羊藿的干燥莖葉提取物，是淫羊藿的主要有效成分之一。研究表明，ICA在心腦血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和腫瘤中具有重要的藥理作用。李波等[13]發(fā)現(xiàn)，ICA可使動(dòng)物睪酮水平升高，并調(diào)控下丘腦CHR和垂體POMC基因的表達(dá)水平，說明ICA對(duì)生殖系統(tǒng)的影響主要在下丘腦和垂體組織。高學(xué)勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ICA能促進(jìn)幼年小鼠附睪及精囊的發(fā)育。覃光輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ICA能明顯改善雷公藤多苷對(duì)小鼠睪丸的病理損傷，與模型組相比，治療組小鼠睪丸生精管管壁較厚，細(xì)胞層次較寬，細(xì)胞增殖旺盛。高孟婷等[16]應(yīng)用125I放射免疫法測(cè)定不同濃度ICA對(duì)家兔陰莖海綿體內(nèi)PDE5酶底物cGMP水平的影響。結(jié)果顯示，ICA能提高陰莖海綿體內(nèi)cGMP水平。蔣兆健等[17]也采用125I放射免疫法觀察ICA對(duì)家兔陰莖海綿體平滑肌組織中cGMP水平的影響，結(jié)果顯示，ICA能直接升高cGMP水平。鐘瑜等[18]制備腎陽虛細(xì)胞模型，觀察ICA干預(yù)后糖皮質(zhì)激素受體（GR）的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，經(jīng)ICA干預(yù)后的GR mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加。表明ICA對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用明顯。另外，ICA對(duì)性腺還有較大的影響作用。趙翌等[19]通過在獲能液mTBM+肝素中添加ICA，利用金霉素?zé)晒馊旧ńY(jié)合體外受精試驗(yàn)，觀察新鮮豬精子的體外獲能效果，結(jié)果表明，ICA能夠顯著促進(jìn)豬精子體外獲能效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，ICA高劑量組能顯著提高模型大鼠的精子活率、活力、RP值，說明ICA可促進(jìn)精子獲能、提高TNBP含量；但是本研究也發(fā)現(xiàn)，ICA不能提高精子密度，而且ICA高劑量組雖然可以有效改善大鼠精子的活率、活力和TNBP含量，但仍然低于對(duì)照組。分析原因可能與用藥時(shí)間短和樣本量少有關(guān)，下一步擬擴(kuò)大樣本量、進(jìn)一步延長用藥時(shí)間進(jìn)行研究。

綜上所述，ICA作為一種傳統(tǒng)中藥，可通過提高RP值和精子活率來有效改善雄性生殖功能。

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