DNA損傷修復(fù)的分子機(jī)理研究進(jìn)展*

宋 囡 綜述，石 磊 審校

1 染色質(zhì)化的DNA損傷

真核生物的基因組DNA在細(xì)胞核中是高度折疊和有序組織的[1]。為了實現(xiàn)這種三維構(gòu)象，DNA以染色質(zhì)的形式包裹圍繞在組蛋白上[2-3]。染色質(zhì)纖維具有不同程度的壓縮和不同類型的化學(xué)修飾，從而能夠保證正確的基因表達(dá)以及基因組結(jié)構(gòu)的完整性[1]。染色質(zhì)DNA的完整性很容易受到外源性和內(nèi)源性損傷影響。外源性或環(huán)境的損傷可能來自太陽光中的紫外線（UV），電離輻射（IR，例如來自宇宙輻射和醫(yī)療用X射線或放射治療）以及遺傳毒性致癌物質(zhì)，包括拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑喜樹堿（CPT，拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑）和依托泊苷（Etoposide，拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑）[4]。最常見的細(xì)胞內(nèi)源性的基因毒性壓力包括由于細(xì)胞呼吸作用增加而產(chǎn)生的過量氧自由基，由細(xì)胞分裂異常導(dǎo)致的DNA復(fù)制叉崩潰，減數(shù)分裂過程中的染色體互換，以及脊椎動物淋巴細(xì)胞免疫球蛋白基因的染色體重排[5]。

2 DNA損傷修復(fù)途徑

為對抗DNA損傷，細(xì)胞進(jìn)化出復(fù)雜而精細(xì)調(diào)控的機(jī)制去修復(fù)不同類型的DNA損傷。目前數(shù)百個與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因已被確定，它們主要參與了五個不同的，但功能上又相互關(guān)聯(lián)的途徑：堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)，核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair,NER），錯配修復(fù)（mismatch repair,MMR），非同源末端連接（non-homologous end joining,NHEJ）和同源重組（homologous recombination,HR）。

2.1 堿基切除修復(fù)（BER）

化學(xué)修飾產(chǎn)生的單個堿基損傷會影響堿基形成氫鍵的能力，導(dǎo)致堿基配對錯誤。這些突變可能由IR，拓?fù)洚悩?gòu)酶I或一些抗代謝藥物所誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且主要是通過BER途徑修復(fù)（圖1A）。BER途徑的關(guān)鍵成分是糖基化酶，核酸內(nèi)切酶，DNA聚合酶和DNA連接酶，它們與多聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）和PARP2一起完成這一過程[6]。損傷的堿基首先被糖基化酶和核酸內(nèi)切酶去除從而形成無堿基位點并且產(chǎn)生一個“缺口”或一個單鏈斷裂，接下來可能通過短一點的BER修復(fù)（單個核苷酸被替換）或長一點的BER修復(fù)（有2～10新的核苷酸合成）所加工處理[7]。

圖1 BER和NER

（A）在堿基切除修復(fù)（BER）的第一步，脫氨基堿是由特定的糖基化酶去除。由此產(chǎn)生的嘌呤或嘧啶位點進(jìn)一步被核酸內(nèi)切酶水解。DNA鏈中的缺口之后由DNA聚合酶和DNA連接酶修復(fù)。（B）在識別受損DNA鏈后，核苷酸切除修復(fù)（NER）的執(zhí)行主要包括以下幾個方面：轉(zhuǎn)錄因子TFIIH介導(dǎo)的雙切除，DNA聚合酶，連接依賴DNA連接酶1，F(xiàn)lap內(nèi)切酶1和Ligase-III-XRCC1復(fù)合物來填補缺口，從而完成核苷酸切除修復(fù)（NER）。

2.2 核苷酸切除修復(fù)（NER）

NER的作用是去除DNA上的螺旋結(jié)構(gòu)扭曲產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可能是紫外線輻射或吸煙引起的。著色性干皮?。╔P）蛋白和科凱恩綜合征（CS）相關(guān)蛋白在該通路起著關(guān)鍵作用[7]。真核生物的NER可分為兩個子途徑：全基因組NER（GG-NER）和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的NER（TC-NER）。對于每條子通路來說，由兩組不同的蛋白質(zhì)參與識別DNA損傷[7]。之后，兩條子通路的后續(xù)步驟是相同的：都是由轉(zhuǎn)錄因子II H（TFIIH）造成雙切口，之后通過DNA聚合酶和DNA連接酶1，F(xiàn)lap核酸內(nèi)切酶1（FEN1）或LIGIII-XRCC1復(fù)合物去封閉“缺口”從而完成核苷酸切除修復(fù)（圖1B）。

2.3 錯配修復(fù)（MMR）

錯配修復(fù)是一種識別和修復(fù)子鏈中特定復(fù)制錯誤的系統(tǒng)，如錯誤的核苷酸摻入（錯配），核苷酸的插入或缺失。錯配或不正確的核苷酸能夠被MSH2-MSH6異二聚體識別，而缺失和插入的核苷酸能夠被MSH2-MSH3異二聚體所識別[6,8]。除了特定的錯配修復(fù)因子如MLH1-MLH3異二聚體需要處理下游信號外，其他的DNA修復(fù)途徑的組分包括核酸內(nèi)切酶1（Endonuclease 1），復(fù)制蛋白A（RPA）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和Flap內(nèi)切酶1（FEN1）也參與了損傷后的切除和再合成過程。錯配修復(fù)缺陷導(dǎo)致增加突變率高達(dá)1000倍，可以導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability,MSI）和癌癥發(fā)生[9]。

2.4 非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR）

DNA雙鏈斷裂（Double-strand break,DSB）是最嚴(yán)重的損傷形式，無法修復(fù)的DNA雙鏈斷裂會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而且其異常的修復(fù)可能會導(dǎo)致染色體的缺失轉(zhuǎn)位等變化。DSB修復(fù)一般是通過以下兩個主要途徑之一進(jìn)行修復(fù)：非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復(fù)（HR）。非同源末端連接修復(fù)（NHEJ）是極其容易出錯的一種修復(fù)方式，它通過末端處理加工將斷裂的DNA結(jié)合在一起，但是末端處理過程中會導(dǎo)致一部分DNA片段的缺失。同源重組修復(fù)（HR）使用未受干擾的正確的模板DNA來恢復(fù)原來的DNA序列，同源模板一般由姐妹染色單體提供[7,9]（圖2）。NHEJ發(fā)生在細(xì)胞周期的各個階段，主要在細(xì)胞周期的G0期和G1期，它能快速修復(fù)高達(dá)85%的IR造成的DNA雙鏈斷裂損傷。雖然HR通常僅在細(xì)胞周期的S和G2期發(fā)揮作用，并且只修復(fù)部分DNA雙鏈斷裂損傷，但是他可能是最重要的修復(fù)方式，因為它在處理停滯和崩潰的復(fù)制叉以及DNA雙鏈斷裂損傷時，是高保真的，而且與NER以及Fanconi anaemia通路共同參與處理鏈間交聯(lián)（Interstrand-cross link,ICL）[6]。在HR過程中，DNA雙鏈損傷經(jīng)過末端切除產(chǎn)生單鏈DNA，從而侵入同源DNA，使受損的DNA鏈重新合成[8]。

圖2 DNA雙鏈斷裂DSB修復(fù)和DNA損傷應(yīng)答（DDR）

DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)（DDR）是一個感知損傷和啟動一系列精密事件的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。DDR通常由MRN（MRE11-RAD50-NBS1）復(fù)合物識別損傷位點起始，進(jìn)而招募和激活DDR信號通路關(guān)鍵激酶ATM。之后ATM磷酸化組蛋白突變體H2AX（在人類中是S139位，簡稱γ-H2AX），為MDC1提供一個高度親和的結(jié)合位點，從而協(xié)調(diào)了不同功能的與DNA雙鏈斷裂修復(fù)相關(guān)的下游因子，包括泛素化酶RNF8和RNF168。越來越多的證據(jù)表明，在損傷位點附近的染色質(zhì)微環(huán)境中，應(yīng)答和修復(fù)復(fù)合物的裝配具有時空特異性和高度協(xié)調(diào)性。很多在化學(xué)或物理上以可逆的方式修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的酶復(fù)合物，例如Nucleosome Remodeling and Deacetylase(NuRD)復(fù)合物和Polycomb Repressive Complex(PRC1/2)，已經(jīng)被闡明是重要的DSB應(yīng)答修復(fù)因子。DSB修復(fù)通常通過NHEJ和HR修復(fù)途徑完成：NHEJ在細(xì)胞周期的所有階段修復(fù)DSB，而HR則依賴于一個同源DNA模板的存在，因此通常僅限于S期和G2期。

3 染色質(zhì)環(huán)境下的DNA損傷應(yīng)答、修復(fù)

DNA損傷處的不恰當(dāng)修復(fù)不僅破壞了基因組完整性，而且對DNA復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄等DNA其他活動有著不良影響，最終會導(dǎo)致基因突變和染色體畸型[10]。因此，細(xì)胞通過時間和空間上調(diào)控DNA損傷應(yīng)答（DNA damage response,DDR）來維持基因組完整性的能力對于細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的。DNA損傷應(yīng)答起始主要由磷脂酰肌醇3-激酶樣蛋白激酶（PIKKs）家族蛋白ATM、ATR、和DNA-PK以及PARP家族中的PARP1和PARP2成員來介導(dǎo)完成[11]。這些因子通過檢測/識別特定的DNA損傷信號，通過精密的協(xié)同調(diào)節(jié)方式，來激活DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)[4]。DNA損傷應(yīng)答起始過程活化后，損傷修復(fù)是在染色之微環(huán)境下通過大量的酶促反應(yīng)來完成的，它們在化學(xué)或物理上可逆地修飾修復(fù)蛋白和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖2）。這些酶包括但不限于核酸酶，解旋酶、聚合酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶，重組酶，連接酶，糖基化酶、甲基化、去甲基化酶、泛素連接酶，去泛素化酶激酶和磷酸酶[1,12,16]。除了這些酶，許多DNA損傷應(yīng)答或修復(fù)過程涉及到支架蛋白，支架蛋白缺乏內(nèi)在的催化功能或DNA結(jié)合功能，但能通過不同的識別結(jié)構(gòu)域，或者通過組裝蛋白質(zhì)復(fù)合物，來識別特定的化學(xué)修飾，進(jìn)而參與應(yīng)答修復(fù)過程的完成。為了及時有效地應(yīng)對損傷刺激和高保真地恢復(fù)損傷，在染色質(zhì)穩(wěn)態(tài)微環(huán)境中這些損傷修復(fù)工具以及它們的調(diào)控因子在時間和空間上必須精確調(diào)節(jié)，否則每個步驟的失控都有可能對DNA的完整性造成嚴(yán)重破壞，并影響損傷位點近端或遠(yuǎn)端的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)[17-18]

4 小結(jié)

雖然目前已經(jīng)有很多的工作來研究DNA修復(fù)因子招募到DNA損傷位點的調(diào)控，以及DNA修復(fù)途徑的選擇性所涉及的細(xì)胞機(jī)制，但是在染色質(zhì)環(huán)境中DNA修復(fù)的分子機(jī)制和影響才剛剛開始被理解。近來，一些在腫瘤中異常表達(dá)的表觀遺傳修飾因子，被證明參與了腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)過程[9]。由于靶向表觀遺傳因子已經(jīng)被證明在腫瘤治療過程中有著重要的臨床應(yīng)用價值[19]，我們推測，在腫瘤治療過程中，聯(lián)合放化療和抑制腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)致?lián)p傷應(yīng)答修復(fù)活躍的表觀遺傳因子，包括酶分子或染色質(zhì)結(jié)合蛋白，可以更好的殺傷腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放化療的敏感性。

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