肝細(xì)胞肝癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定*

胡書婭，郭慶喜，楊 楠，劉祖平，楊成萬(wàn)，蒲 霞

腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移不僅源于腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和突變等，還與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)[1]，腫瘤微環(huán)境成分復(fù)雜，其中活化的成纖維細(xì)胞被稱為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinoma-associated fibro?blasts，CAFs），它通常來(lái)源于靜止的成纖維細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化、血管周細(xì)胞的分化、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[2]，具有獨(dú)特的細(xì)胞表型和生物學(xué)行為，是腫瘤微環(huán)境中最重要的宿主細(xì)胞之一[3]。原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞肝癌CAFs接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)的特性，是進(jìn)一步研究肝細(xì)胞癌CAFs本身的基因表達(dá)和生物學(xué)特性以及它與肝癌細(xì)胞之間的相互作用的理想模型。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種有效的原代CAFs的培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶消化液和雙抗（青鏈霉素液）購(gòu)自Biodder公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；L-谷氨酰胺購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)使用含20%FBS+1%雙抗+1%L-谷氨酰胺的完全培養(yǎng)基；波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）多克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司。細(xì)胞爬片蓋玻片使用24孔板專用細(xì)胞爬片。

1.2 標(biāo)本來(lái)源及采集

所取組織來(lái)源于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科手術(shù)切除標(biāo)本，術(shù)后病理診斷為低分化肝細(xì)胞性肝癌。標(biāo)本獲取前已取得本人知情同意。標(biāo)本于手術(shù)切除離體后，用無(wú)菌手術(shù)刀片切取體積大于1 cm3的新鮮組織塊，生理鹽水沖洗3次后，置于含DMEM/F12+1%雙抗的50 ml離心管內(nèi)，于冰盒中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

1.3 CAFs的培養(yǎng)、分離純化

超凈臺(tái)內(nèi)，用含雙抗的PBS液反復(fù)漂洗組織，剔除多余的血管、脂肪、筋膜及壞死組織等，用無(wú)菌眼科剪將組織剪成1 mm3左右的組織塊，PBS反復(fù)沖洗。將組織塊均勻放入預(yù)鋪血清的培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中放置1 h后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶倒置培養(yǎng)12 h，然后加入完全培養(yǎng)基，正置繼續(xù)培養(yǎng)。

在細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。去除組織塊，PBS清洗細(xì)胞3次，常規(guī)1∶2傳代，再次長(zhǎng)滿后進(jìn)行分離純化傳代。根據(jù)成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度及貼壁能力的差異，應(yīng)用差速酶消化法聯(lián)合反復(fù)貼壁法純化細(xì)胞。經(jīng)3次傳代后可獲得純化的CAFs。

1.4 CAFs的鑒定

1.4.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁、生長(zhǎng)狀況及形態(tài)變化并拍照。

1.4.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

將無(wú)菌圓形蓋玻片（直徑14 mm）放在24孔板中，細(xì)胞消化后制成2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，滴加在蓋玻片上，使其不溢出蓋玻片，將孔板放入培養(yǎng)箱2 h使細(xì)胞貼壁后，每孔補(bǔ)加1 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)70%融合時(shí)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。除去培養(yǎng)液，PBS漂洗3次（每次5 min），將蓋玻片放入丙酮中固定20 min。

免疫化學(xué)染色采用S-P法，具體方法如下：細(xì)胞爬片PBS洗5 min，3次；加一抗（vimentin、α-SMA、FAP）4 ℃孵育4 h，PBS洗5 min，3次；加二抗工作液，37℃孵育1 h，PBS洗5 min，3次；常規(guī) DAB 顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照；細(xì)胞漿或細(xì)胞膜中的棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性染色。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞純化與培養(yǎng)

培養(yǎng)第4 d可見(jiàn)細(xì)胞從組織邊緣游出（圖1A），最快20 d長(zhǎng)滿瓶底，此時(shí)見(jiàn)成纖維細(xì)胞團(tuán)圍繞上皮細(xì)胞團(tuán)分區(qū)生長(zhǎng)（圖1B）。經(jīng)過(guò)純化，第4代細(xì)胞幾乎不見(jiàn)上皮樣細(xì)胞存在（圖1C）。CAFs細(xì)胞大小不等，多呈梭形或星芒狀，有多個(gè)突起，核為圓形或卵圓形，部分細(xì)胞呈漩渦狀排列。

圖1 顯微鏡下CAFs的形態(tài)

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

CAFs表達(dá)vimentin、α-SMA、FAP，均為胞漿著色，呈棕黃色顆粒狀（圖2）。

圖2 免疫組化結(jié)果

3 討 論

隨著1989年P(guān)aget提出腫瘤的“種子與土壤”學(xué)說(shuō)以來(lái)，代表“土壤”的腫瘤微環(huán)境就成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)，而CAFs是影響腫瘤生長(zhǎng)最重要的“土壤”。大量研究表明，CAFs可促進(jìn)血管生成、免疫抑制、激活信號(hào)通路、促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化，還可通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸、分泌細(xì)胞因子、修飾細(xì)胞外基質(zhì)成分等多種方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，增加腫瘤細(xì)胞的惡性表型[4-7]。眾所周知，大部分的肝細(xì)胞癌發(fā)生于肝纖維化或肝硬化，針對(duì)CAFs的靶向治療不僅能抑制纖維化，還能抑制肝癌的進(jìn)展[8]。隨著研究的不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CAFs的基因組比腫瘤細(xì)胞更穩(wěn)定，不易耐藥，將有望成為腫瘤化療的新靶點(diǎn)[2，9]。Dourado等[10]還強(qiáng)調(diào)CAFs在口腔鱗狀細(xì)胞癌中可被視為一個(gè)有用的預(yù)后指標(biāo)。CAFs在腫瘤微環(huán)境中扮演重要角色，成為研究熱點(diǎn)，而獲得純化的CAFs為前提。因此CAFs的原代培養(yǎng)、純化和鑒定是有必要的。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)CAFs的原代培養(yǎng)主要采取組織塊貼壁法和酶消化法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織塊貼壁法獲得成功。組織塊貼壁法是將小塊狀組織貼在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁上進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，部分細(xì)胞會(huì)從組織中游出然后貼壁生長(zhǎng)。該方法操作簡(jiǎn)便，易于掌握，無(wú)需特殊試劑或器材，不損傷細(xì)胞，可重復(fù)率高。缺點(diǎn)是細(xì)胞遷出貼壁的周期相對(duì)較長(zhǎng)。

酶消化法是利用消化酶將組織中的細(xì)胞分散，形成單細(xì)胞懸液，再進(jìn)行過(guò)濾、離心、接種的方法。胰酶主要用于消化上皮成分多而間質(zhì)少的組織，可以聯(lián)合EDTA進(jìn)行消化；而膠原酶對(duì)細(xì)胞的間質(zhì)有很好的消化作用，消化能力較胰酶弱。酶消化法有以下缺點(diǎn)：①酶處理時(shí)間和酶濃度難掌控。消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或酶濃度過(guò)高可導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，貼壁率低，消化時(shí)間過(guò)短或酶濃度低將造成收集的可用細(xì)胞少。有學(xué)者通過(guò)不同消化時(shí)間和不同濃度梯度的預(yù)實(shí)驗(yàn)，來(lái)確定乳腺癌酶消化的最佳消化時(shí)間和最佳濃度[11]，這無(wú)疑增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性；②酶解離細(xì)胞時(shí)容易導(dǎo)致細(xì)胞破損，使獲得的細(xì)胞狀態(tài)欠佳；③步驟繁瑣，更易污染。

無(wú)論哪一種原代培養(yǎng)方法，最終所得的原代細(xì)胞都是多種細(xì)胞混雜存在，因此細(xì)胞的分離純化就成了原代培養(yǎng)中關(guān)鍵的一步。原代細(xì)胞的分離純化方法有自然純化法、機(jī)械刮除法、差速酶消化法、反復(fù)貼壁法和磁珠分選等。培養(yǎng)初期，肝癌細(xì)胞分散或成片生長(zhǎng)在CAFs中，可使用差速酶消化法聯(lián)合反復(fù)貼壁法純化細(xì)胞；胰酶消化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)上皮樣細(xì)胞比成纖維細(xì)胞先脫壁，因此可在上皮樣細(xì)胞脫壁后倒出胰蛋白酶消化液，PBS液洗滌后將原培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)；或者再加入胰酶消化剩下的細(xì)胞，將細(xì)胞懸液用不同時(shí)間梯度貼壁，觀察到成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間更短。需要指出的是，不同腫瘤組織中上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的反應(yīng)不同，例如，消化喉和口腔腫瘤的混雜細(xì)胞時(shí)，CAFs就比鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞先脫壁[12]。另外，可利用成纖維細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)進(jìn)行自然純化[13]。機(jī)械刮出法適用于大范圍細(xì)胞的篩選，對(duì)小區(qū)域的污染細(xì)胞效果不佳。免疫磁珠分選法和流式細(xì)胞儀分選法的純化速度快，但費(fèi)用相當(dāng)昂貴，而且分選過(guò)程中可能造成細(xì)胞活性下降甚至裂解死亡，導(dǎo)致繼續(xù)培養(yǎng)困難[14]。本實(shí)驗(yàn)中，采用差速酶消化法聯(lián)合反復(fù)貼壁法獲得了CAFs。

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞即為腫瘤間質(zhì)中活化的成纖維細(xì)胞，其在形態(tài)和生物學(xué)行為上具有平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的雙重特性。vimentin是間充質(zhì)細(xì)胞和中胚層來(lái)源細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞）中間絲的主要結(jié)構(gòu)蛋白[15]，該表達(dá)陽(yáng)性，提示CAFs可能為成纖維細(xì)胞來(lái)源。另外CAFs還表達(dá)自身的特異性蛋白FAP和α-SMA，其表達(dá)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道一致[16-17]，證實(shí)我們建立的細(xì)胞為純度高的CAFs。

原代CAFs分離培養(yǎng)還要注意幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：①所取組織要選取較典型區(qū)域，避開(kāi)出血壞死區(qū)，離體后迅速取材，低溫運(yùn)輸；②整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作，用含雙抗的PBS液多次漂洗組織，可達(dá)到很好的滅菌作用；③原代培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基中應(yīng)加入高濃度的胎牛血清，不應(yīng)低于20%，另外可加入一些利于細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，如谷氨酰胺；④爬片時(shí)滴加的細(xì)胞懸液不要溢出蓋玻片，否則細(xì)胞會(huì)生長(zhǎng)在孔板上；⑤分離時(shí)可聯(lián)合多種純化方法，起到最顯著的作用；⑥組織塊貼壁時(shí)，完全培養(yǎng)基以剛好浸潤(rùn)組織為宜，不宜過(guò)多。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)組織塊貼壁法成功培養(yǎng)、分離純化出原代肝細(xì)胞肝癌CAFs，實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性，獲得了高活力、高純度的細(xì)胞，為后續(xù)研究提供了良好的細(xì)胞模型，也為肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生、發(fā)展和針對(duì)CAFs的靶向治療提供了手段。

1. Affo S，Yu LX，Schwabe RF.The role of cancer-associ?ated fibroblasts and fibrosis in liver cancer[J].Annu Rev Pathol，2017，12:153-186.

2. Luo HJ，Tu G，Liu ZM，et al.Cancer-associated fibro?blasts:a multifaceted driver of breast cancer progression[J].Cancer Lett，2015，361(1):155-163.

3. Sukowati CH，Anfuso B，Croce LS，et al.The role of multipotent cancer associated fibroblasts in hepatocarcino?genesis[J].BMC Cancer，2015，15:188.

4. Yang J，Lu Y，Lin YY，et al.Vascular mimicry forma?tion is promoted by paracrine TGF-and SDF1 of can?cer-associated fibroblasts and inhibited by miR-101 in he?patocellularcarcinoma[J].CancerLett，2016，383(1):18-27.

5. Deng Y，Cheng J，F(xiàn)u B，et al.Hepatic carcinoma-asso?ciated fibroblasts enhance immune suppression by facilitat?ing the generation of myeloid-derived suppressor cells[J].Oncogene，2017，36(8):1 090-1 101.

6. Yamamura Y，Asai N，Enomoto A，et al.Akt-girdin sig?naling in cancer-associated fibroblasts contributes to tu?mor progression[J].Cancer Res，2015，75(5):813-823.

7. Yu Y，Xiao CH，Tan LD，et al.Cancer-associated fibro?blasts induce epithelial-mesenchymal transition of breast cancer cells through paracrine TGF-signalling[J].Br J Cancer，2014，110(3):724-732.

8. Liu J，Chen S，Wang W，et al.Cancer-associated fibro?blasts promote hepatocellular carcinoma metastasis through chemokine-activatedhedgehogandTGF-pathways[J].Cancer Lett，2016，379(1):49-59.

9. Takai K，Le A，Weaver VM.Targeting the cancer-asso?ciated fibroblasts as a treatment in triple-negative breast cancer[J].Oncotarget，2016，7(50):82 889-82 901.

10. Dourado MR，Guerra ENS，Salo T，et al.Prognostic val?ue of the immunohistochemical detection of cancer-asso?ciated fibroblasts in oral cancer:a systematic review and meta-analysis[J].JOral Pathol Med，2017,doi:10:1111/jop.12 623.

11. 彭瓊樂(lè)，孫艷，趙瀏陽(yáng)，等.人乳腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及其生物學(xué)特性[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2012，25(10):1 368-1 372.

12. 周美玲，李傳祝，王瓊，等.人口腔癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J].口腔生物醫(yī)學(xué)，2016，7(2):57-61.

13. 王正彩，翟麗麗，楊迷玲，等.人胃癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，27(8):860-862，868.

14. 楊柳曉，高強(qiáng).肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的分離、純化及鑒定[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2016，23(2):131-135.

15. 周偉，李妙齡，范學(xué)慧，等.人心房成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，39（06）：523-526.

16.Yan Y，Wang RF，Guan WB，et al.Roles of microR?NAs in cancer associated fibroblasts of gastric cancer[J].Pathol Res Pract，2017，213(7):730-736.

17. Ji X，Ji J，Shan F，et al.Cancer-associated fibroblasts from NSCLC promote the radioresistance in lung cancer cell lines[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(5):7 002-7 008.