孕二烯酮緩釋避孕微針含量及其有關(guān)物質(zhì)的測定方法研究

段雪艷 馬佳男,2 寧美英* 高云華

1.國家衛(wèi)生計生委科學技術(shù)研究所(北京，100081)；2. 北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院；3. 中國科學院理化技術(shù)研究所光化學轉(zhuǎn)換和功能材料重點實驗室

孕二烯酮是屬于19-去甲睪酮系列的第三代孕激素，無雄激素和雌激素活性，表現(xiàn)為較強的孕激素活性，具有良好的避孕效果[1-2]。目前含孕二烯酮的上市產(chǎn)品主要為口服制劑，如美國惠氏公司的上市產(chǎn)品敏定偶就屬于復方短效口服避孕藥，需要每日服用，順應(yīng)性較差[3]。微針是一種新型的透皮給藥技術(shù)，通過穿刺角質(zhì)層而將藥物輸送至皮下，同時又不會觸及痛覺神經(jīng)[4]。溶解微針選用可降解聚合物材料[5-7]，在針體刺入皮膚后，藥物隨著可降解聚合材料溶解在皮下組織液中，被機體吸收。本課題組以溶解性高分子材料為基質(zhì)，將孕二烯酮制備成緩釋避孕微針，以達到緩釋7 d的避孕效果。為了控制微針制劑質(zhì)量，需要建立靈敏度高、專屬性好的孕二烯酮含量及有關(guān)物質(zhì)檢測方法。文獻報道孕二烯酮的分離及測定方法包括紫外吸光度法[7]和高效液相色譜(HPLC)法[8-10]，本文參考文獻方法[9-10]，建立了孕二烯酮緩釋避孕微針的藥物含量及其有關(guān)物質(zhì)的HPLC測定法，為孕二烯酮緩釋避孕微針的體外質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

孕二烯酮原料藥(秦皇島紫竹藥業(yè)有限公司，批號92801510001)；孕二烯酮緩釋微針(自制，批號2017112801,2017112802,2017112803)；孕二烯酮標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號41008-201301)；PVPK30(博愛新開源制藥股份有限公司，批號P160307002-1)；PVPK90(博愛新開源制藥股份有限公司，批號P160305001-1)；無水乙醇(北京化工廠，批號20151008)；甲醇(fisher scientific，批號110939)；聚乙二醇400(天津市光復精細化工研究所，批號20160611)；甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。BT 224 S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；Waters 2695-2487高效液相色譜儀(美國Waters公司)；XS105電子天平(METTLER TOLEDO公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；RT 5 power多點加熱磁力攪拌器(德國IKA)；KH-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2 HPLC條件

色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，UV檢測波長為239 nm；流動相為乙腈-水(55:45)，流速為1 ml/min，進樣量為20 μl；柱溫30℃。

1.3 溶液配制

①對照品儲備液的配制：精密稱取孕二烯酮對照品5 mg，置于25 ml量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。精密量取1 ml原液置于50 ml量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。②供試品溶液的配制：取3片孕二烯酮微針或等量的含藥基質(zhì)溶液，加入10 ml乙醇，室溫攪拌30 min，濾過，取100 μl續(xù)濾液于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為孕二烯酮供試品溶液。③自身對照溶液的配制：精密量取孕二烯酮供試品溶液100μl于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，作為自身對照溶液。④損失供試品溶液的配制：制備孕二烯酮緩釋微針后，將殘留含藥高分子基質(zhì)溶液的槍頭置于錐形瓶中，加入10 ml乙醇，室溫攪拌30 min，濾過，取50 μl續(xù)濾液于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，作為損失供試品溶液。

1.4 專屬性

1.4.1陰性干擾試驗分別稱取3片空白微針基質(zhì)和孕二烯酮緩釋微針，加10 ml乙醇，密封，超聲提取30 min，取100 μl續(xù)濾液，加流動相稀釋至刻度，搖勻，取20 μl注入液相色譜儀進行色譜分析，記錄色譜圖。

1.4.2強降解試驗取載藥微針適量，分別在下述條件下進行實驗。①酸破壞： 加1 mol/L鹽酸1 ml使其溶解，室溫放置24 h后加適量0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至中性，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取適量續(xù)濾液加流動相稀釋，搖勻待測。②堿破壞: 加1 mol/L氫氧化鈉1 ml使其溶解，室溫放置24 h后加適量0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至中性，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液加流動相稀釋，搖勻待測。③氧化破壞:加3%過氧化氫溶液適量使其溶解，室溫放置8 h后，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液加流動相稀釋，搖勻待測。④高溫破壞:于100℃烘箱中24 h，取出后放至室溫，加入適量乙醇使其溶解，取續(xù)濾液加流動相稀釋，搖勻待測。⑤光照破壞:置于(4500±500)Lx光照條件下48 h，取出后加入適量乙醇溶解，取續(xù)濾液加流動相稀釋，搖勻待測。

1.5 線性范圍

精密稱取孕二烯酮對照品5 mg，置于25 ml量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度備用。精密量取1 ml原液置于50 ml量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，作為儲備液。分別取儲備液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 ml于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻、濾過，取續(xù)濾液20 μl進行HPLC 測定，以待測組分峰面積(A)對濃度(C， μg/ml)進行線性回歸。

1.6 精密度

精密稱取孕二烯酮對照品適量，配制高、中、低3個濃度的溶液(1.0,4.0和10.0 μg/ml)，分別進樣，觀察色譜圖，記錄峰面積，計算樣品的日內(nèi)和日間精密度。

1.7 穩(wěn)定性試驗

精密取孕二烯酮對照品適量，配制成一定溶度的溶液，分別于常溫保存24 h和4 ℃冰箱保存72 h，在上述色譜條件下進樣，觀察色譜圖，記錄峰面積，考察樣品在不同儲存條件下的穩(wěn)定性。

1.8 重復性試驗

精密取孕二烯酮對照品適量，配制成一定溶度的溶液，連續(xù)進樣6次，觀察色譜圖，記錄峰面積，計算孕二烯酮峰面積的RSD，考察儀器的精密度。

1.9 定量限和檢出限

按照信噪比3:1和10:1時相應(yīng)濃度的量進樣測定，測定孕二烯酮的定量限和檢出限。

1.10 回收率試驗

取3片空白微針，按照高、中、低劑量分別精密加入孕二烯酮對照品6.0，7.5，9.0 mg(分別相當于處方量的80%，100%和120%)，每組平行3份，加10 ml乙醇，于室溫攪拌30 min，濾過，移取續(xù)濾液50 μl于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，取20μl進樣，記錄峰面積，計算回收率。

1.11 含量測定

取3批孕二烯酮緩釋避孕微針、含藥基質(zhì)溶液，分別按照方法1.3制備供試品溶液；同時制備損失供試品溶液，取20 μl提取液進樣，記錄峰面積，根據(jù)外標法計算孕二烯酮緩釋避孕微針的標示含量，計算公式=M測定/(M基質(zhì)-M損失)×100%。

1.12 有關(guān)物質(zhì)測定

取3批孕二烯酮緩釋避孕微針，按照方法1.3制備孕二烯酮供試品溶液和自身對照溶液，采用方法1.2色譜條件，精密進樣自身對照溶液20 μl，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分峰高約為滿量程的20%，分別將供試品和自身對照溶液精密進樣20 μl，記錄色譜圖至主成分保留時間的2倍，按照自身對照法計算3批孕二烯酮微針雜質(zhì)總含量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

2.1.1陰性干擾試驗HPLC結(jié)果(圖1)表明，輔料對孕二烯酮的測定無干擾。

2.1.2強降解實驗圖2可以看出，A、B、C、D、E保留時間的色譜峰為含藥微針經(jīng)過破壞后出現(xiàn)的新的降解產(chǎn)物，各雜質(zhì)峰與主峰之間分離良好；F保留時間的色譜峰為空白微針經(jīng)過破壞后出現(xiàn)的新降解產(chǎn)物，但不影響孕二烯酮及其有關(guān)物質(zhì)的測定。表明該方法專屬性良好。

2.2 線性范圍

線性回歸方程為：A=63605C+233.82，r=0.9997。結(jié)果表明，孕二烯酮在(0.5 ～ 10.0)μg/ml線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度

日內(nèi)精密度分別為0.10%,0.10%和0.12%，日間精密度分別為0.28%,1.47%和0.99%，儀器的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性

常溫保存和4℃冰箱保存的RSD分別為1.96%和0.40%，表明樣品于常溫24h和4℃冰箱保存72 h的穩(wěn)定性良好。

2.5 重復性

孕二烯酮峰面積的RSD為0.53%，表明儀器的重復性良好。

2.6 定量限和檢出限

孕二烯酮的定量限和檢出限分別為7.5ng/ml和2.5ng/ml。

2.7 回收率

孕二烯酮的回收率分別為96.88%，97.11%和101.3%，RSD分別為0.52%，1.68%和0.06%，平均回收率為98.4%。

2.8 含量測定

3批孕二烯酮微針的實際含量為標示含量的94.26%,101.40%和101.00%。

2.9 有關(guān)物質(zhì)測定

3批孕二烯酮緩釋微針的雜質(zhì)總含量分別為0.14%，0.15%和0.12%，均<1.00%。

3 討論

3.1 溶劑的選擇

孕二烯酮幾乎不溶于水，在甲醇和乙醇等有機溶劑中的溶解性較好。從環(huán)保和經(jīng)濟角度考慮，采用乙醇為孕二烯酮微針的提取溶劑。本實驗結(jié)果表明，采用乙醇進行藥物提取，微針中孕二烯酮的回收率在96.88%～101.30%范圍內(nèi)。

3.2 提取方法的考察

本實驗考察了超聲提取和磁力攪拌提取兩種方式、提取溶劑、提取時間和提取體積對孕二烯酮的含量和有關(guān)物質(zhì)測定的影響。結(jié)果表明：磁力攪拌提取效率高于超聲提取，所以選擇磁力攪拌提取方式；乙醇和乙腈的提取效率相同，從經(jīng)濟和環(huán)保角度選擇乙醇為提取溶劑；提取時間30 min高于15 min的提取效率，但是30min后的提取效率幾乎沒有變化，因此選擇提取時間為30 min；10 ml和20 ml乙醇的提取效率相同，且顯著>5 ml的提取效率，因此選擇溶劑體積為10 ml。最終采用供試品中加入10 ml乙醇，密封，室溫下磁力攪拌30 min的提取方法為最佳提取方法。

3.3 測定方法的優(yōu)化

本研究通過紫外全波長掃描確定了孕二烯酮的最大吸收波長為239 nm；參閱文獻并結(jié)合預實驗，選擇具有柱壓低、選擇性好、可以改善峰形的乙腈作為有機相。通過考察不同組成比例的乙腈與水對主成分測定的影響，結(jié)果表明，乙腈：水的比例為55:45時，孕二烯酮色譜峰的保留時間和峰形為最佳。線性、精密度、穩(wěn)定性和重復性等方法學的考察結(jié)果表明，該HPLC方法專屬性強，靈敏度高，且操作步驟簡便快速，可以同時測定含量和有關(guān)物質(zhì)，為孕二烯酮緩釋避孕微針的進一步研究和開發(fā)提供依據(jù)。

3.4 含量測定

文獻中尚無有關(guān)緩釋微針的含量和有關(guān)物質(zhì)測定方法的報道，本文對孕二烯酮緩釋避孕微針的藥物含量的測定進行了研究。微針的含量計算不同于其他制劑以往的測定方法，因為微針基質(zhì)材料加入定量溶劑后，由于高分子材料的溶脹特性，基質(zhì)溶液的體積會大于定量加入的溶劑體積量，導致基質(zhì)溶液的實際濃度降低。此外，由于緩釋微針制備過程中會有一部分基質(zhì)溶液殘留在移取器中，損失率約為50%。所以在含量測定過程中應(yīng)考慮這兩個因素，否則影響緩釋微針制劑質(zhì)量研究的準確性。

本研究對于孕二烯酮緩釋避孕微針的含量和有關(guān)物質(zhì)研究是首例，且對于以具有溶脹性的材料為基質(zhì)的微針制劑的質(zhì)量控制研究具有重要的指導意義，為微針制劑的進一步研究奠定了重要的科學基礎(chǔ)。