黃獨胚性愈傷組織凍后黑暗培養(yǎng)及其再生植株半薄切片觀察

洪森榮，寧本松，葉思雨，劉 燕，張銘心，占學(xué)林

(上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001)

植物胚性愈傷組織是細胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)化和遺傳育種的較好材料[1-2]。但胚性愈傷組織不宜誘導(dǎo)，一旦誘導(dǎo)出來后需要長期繼代保持。研究表明，胚性愈傷組織多次繼代易引起操作上的主觀污染，而且繼代時間越長，胚性愈傷組織也越易發(fā)生變異。目前，超低溫保存是一種用液氮對植物材料進行長期保存的較佳方法[3]。在-196 ℃液氮中，植物材料的新陳代謝和生長發(fā)育幾乎停止，且具有操作簡單、保存時間長、遺傳變異小等優(yōu)點[4]。因此，對胚性愈傷組織進行超低溫保存具有重要意義[5]?，F(xiàn)有研究表明，在超低溫保存后的再培養(yǎng)環(huán)節(jié)，如果先把凍后材料在黑暗中培養(yǎng)數(shù)天(凍后黑暗培養(yǎng))，再給予一定的光周期，可顯著提高植物材料超低溫保存后的成活率，而直接暴露于一定的光周期，則會顯著降低其成活率[6-8]。

薯蕷科薯蕷屬植物——黃獨(DioscoreabulbiferaL.)的地下塊莖在我國一般稱為“黃藥子”，是一味常用中藥，可用來治療多種癌癥[9]。研究表明，凍后黑暗培養(yǎng)能顯著提高黃獨胚性愈傷組織的成活率[10-11]，但凍后黑暗培養(yǎng)適宜時間以及其凍后再生植株的遺傳穩(wěn)定性還有待優(yōu)化和進一步研究。本文對黃獨胚性愈傷組織凍后黑暗培養(yǎng)的時間進行探討，并對凍后黑暗培養(yǎng)胚性愈傷組織的顯微結(jié)構(gòu)及其再生植株進行半薄切片觀察，旨在為黃獨胚性愈傷組織的超低溫保存提供形態(tài)解剖學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃獨胚性愈傷組織由上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供。

1.2 方法

1.2.1 黃獨胚性愈傷組織凍后黑暗培養(yǎng)及其半薄切片

為了保證黃獨胚性愈傷組織的一致性，取同一個微型塊莖切塊誘導(dǎo)出胚性愈傷組織(能形成胚狀體的愈傷組織)，然后對胚性愈傷組織進行擴大增殖，最后用于后續(xù)試驗。黃獨胚性愈傷組織采用王子成等[11]的方法進行包埋玻璃化法超低溫保存后，經(jīng)化凍洗滌后置于再生培養(yǎng)基(MS+KT 2 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂)上培養(yǎng)，每處理接種凍后培養(yǎng)胚性愈傷組織塊15個，每個胚性愈傷組織塊約為0.2 g。凍后培養(yǎng)方式分2種：1)處理組，黑暗培養(yǎng)數(shù)天后再轉(zhuǎn)入光周期培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng)的時間分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15 d，光周期14 h/10 h(L/D)，光強2 000 lx；2)對照組，凍后不進行黑暗培養(yǎng)，直接光周期培養(yǎng)，光周期14 h/10 h(L/D)，光強2 000 lx。采用以上2種方式培養(yǎng)40 d后進行成活率統(tǒng)計。超低溫保存胚性愈傷組織均可生根發(fā)芽，說明凍后沒有改變它的胚性。黃獨胚性愈傷組織的成活以分化出小苗為標(biāo)志。成活率=(分化出小苗的胚性愈傷組織/接種的凍后培養(yǎng)胚性愈傷組織總數(shù))×100%。

篩選出適宜的凍后黑暗培養(yǎng)時間后，將處理組和對照組的材料切成小塊，迅速放入2.5%戊二醛固定液中，0～4 ℃固定3 h以上；經(jīng)0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液清洗3次，丙酮逐級脫水，Epon樹脂浸透包埋；最后在60 ℃烘箱中聚合。將不同材料的包埋塊置于超薄切片機(Leica ultracut R)上進行切片，半薄切片厚度1 μm，用尖玻璃棒將切片挑至滴有雙蒸水的干凈載玻片上，再將載玻片置于70 ℃恒溫電熱板(Leica EMMP)上展片和干燥，將半薄切片用甲苯胺藍染液染色，置于光學(xué)顯微鏡下(Leica DMLS)觀察，用附帶的成像系統(tǒng)(Canno Power Shot S70)拍照。

1.2.2 再生植株半薄切片

黃獨胚性愈傷組織經(jīng)包埋玻璃化法超低溫保存[11]后，經(jīng)化凍洗滌接種于再生培養(yǎng)基(MS+KT 2 mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂)，黑暗培養(yǎng)3 d后再轉(zhuǎn)入光周期培養(yǎng)，光周期14 h/10 h(L/D)，光強2 000 lx。90 d后取其凍后再生植株(處理組)以及黃獨常溫繼代再生植株(對照組，用帶芽莖段進行常溫繼代再生的植株，無愈傷組織形成)進行半薄切片觀察，方法同1.2.1節(jié)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上實驗均重復(fù)3次，本實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行One-Way ANOVA分析，再進行LSD法檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃獨胚性愈傷組織凍后黑暗培養(yǎng)時間

從圖1可知，凍后黑暗培養(yǎng)時間對黃獨胚性愈傷組織的成活率影響顯著。凍后黑暗培養(yǎng)時間為0 d(直接光周期培養(yǎng)，對照組)，黃獨胚性愈傷組織的成活率僅為52.97%。凍后黑暗培養(yǎng)1 d，黃獨胚性愈傷組織的成活率顯著提高到63.28%。凍后黑暗培養(yǎng)時間繼續(xù)延長，黃獨胚性愈傷組織的成活率也顯著增加，其中，凍后黑暗培養(yǎng)2～5 d，黃獨胚性愈傷組織的成活率遞增直至達到最高值，分別為75.35%、76.58%、78.34%和74.62%，這4個處理間無顯著差異。凍后黑暗培養(yǎng)超過5 d，黃獨胚性愈傷組織的成活率開始顯著下降，凍后黑暗培養(yǎng)6～10 d，其成活率分別為62.43%、65.82%、63.44%、62.40%和63.55%，與凍后黑暗培養(yǎng)1 d無顯著性差異。凍后黑暗培養(yǎng)11～15 d，成活率分別為55.36%、54.60%、54.28%、53.46%和52.69%，與凍后黑暗培養(yǎng)0 d無顯著性差異。

柱子上無相同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.圖1 凍后黑暗培養(yǎng)時間對黃獨胚性愈傷組織成活率的影響Fig.1 Effect of dark culture time on the survival rate of Dioscorea bulbifera L. embryogenic callus after cryopreservation

2.2 黃獨凍后黑暗培養(yǎng)胚性愈傷組織的半薄切片觀察

未經(jīng)凍后黑暗培養(yǎng)，直接置于光周期下培養(yǎng)7 d，會造成胚性愈傷組織細胞排列疏松，細胞外形及大小出現(xiàn)一定的變化，并且局部某些部位也會出現(xiàn)較大的細胞空隙(圖2-A)；凍后黑暗培養(yǎng)3 d，再置于光周期下培養(yǎng)4 d，胚性愈傷組織細胞排列比較緊密，細胞空隙較小(圖2-B)。表明凍后黑暗培養(yǎng)可以在一定程度上保證胚性愈傷組織細胞結(jié)構(gòu)的完整性，這也為凍后黑暗培養(yǎng)促進黃獨胚性愈傷組織的成活提供了形態(tài)解剖學(xué)證據(jù)。

2.3 黃獨凍后黑暗培養(yǎng)胚性愈傷組織再生植株遺傳穩(wěn)定性的半薄切片觀察

對黃獨凍后黑暗培養(yǎng)胚性愈傷組織(凍后黑暗培養(yǎng)3 d后再置于光周期下培養(yǎng)4 d)再生植株以及黃獨常溫繼代再生植株進行半薄切片觀察。結(jié)果表明：2種類型再生植株的根均由表皮、皮層和維管柱構(gòu)成，維管柱外有一層明顯的中柱鞘細胞，中央有大導(dǎo)管，大導(dǎo)管周圍有小導(dǎo)管；另外，維管柱內(nèi)有多個散生韌皮部(圖3)。因此，黃獨凍后黑暗培養(yǎng)胚性愈傷組織再生植株與常溫繼代再生植株的根結(jié)構(gòu)相比較無顯著性差異。2種類型再生植株的的莖均由1層表皮、1～4層皮層以及中央的木質(zhì)部組成，木質(zhì)部間有多個散生韌皮部，木質(zhì)部和散生韌皮部外有1層有限維管束包圍(圖4)。因此，黃獨凍后黑暗培養(yǎng)胚性愈傷組織再生植株與常溫繼代再生植株的莖結(jié)構(gòu)相比較無顯著性差異。2種類型再生植株的葉表皮細胞均呈不規(guī)則形，排列緊密，葉肉由排列緊密的柵欄組織和排列疏松的海綿組織組成；葉片上的氣孔器均由保衛(wèi)細胞組成，氣孔下面有孔下室，有些孔下室下的葉肉細胞呈長條形；葉肉細胞內(nèi)有葉綠體，葉綠體一般排列在葉片向陽面(圖5)。黃獨凍后黑暗培養(yǎng)胚性愈傷組織再生植株葉片細胞的平均葉綠體數(shù)為9.26，常溫繼代胚性愈傷組織再生植株葉片細胞的平均葉綠體數(shù)為8.82，兩者無顯著性差異。

A， 凍后光周期培養(yǎng)7 d； B， 凍后黑暗培養(yǎng)3 d，再光周期培養(yǎng)4 d。A， Cultured in the photoperiod for 7 d after cryopreservation; B， Cultured in the dark for 3 d and then in the photoperiod for 4 d after cryopreservation.圖2 黃獨胚性愈傷組織的半薄切片觀察(×40)Fig.2 Semi thin section observation of embryogenic calli from Dioscorea bulbifera L. (×40)

A和C， 黃獨凍后黑暗培養(yǎng)3 d再光周期培養(yǎng)4 d胚性愈傷組織再生植株； B和D， 常溫繼代再生植株。下圖同。A and C， Plantlet regenerated from Dioscorea bulbifera L. embryogenic calli cultured in the dark for 3 d and then in the photoperiod for 4 d after cryopreservation; B and D， Plantlet regenerated from Dioscorea bulbifera L. embryogenic calli subcultured at room temperature. The same as bellow.圖3 黃獨胚性愈傷組織再生植株根(×10)及其維管柱(×40)的半薄切片觀察Fig.3 Semi thin section observation of the root (×10) and vascular cylinder (×40) of plantlet regenerated from Dioscorea bulbifera L. embryogenic calli

3 討論

研究表明，凍后黑暗培養(yǎng)時間對超低溫保存材料的后期恢復(fù)影響很大。王子成等[12]研究表明，超低溫保存后，黑暗培養(yǎng)1～9 d，馬鈴薯莖尖的存活率隨著培養(yǎng)時間的延長而增大；凍后黑暗培養(yǎng)時間超過11 d，馬鈴薯莖尖的存活率反而顯著下降。本研究也表明，包埋玻璃化法超低溫保存后，黑暗培養(yǎng)1～5 d，黃獨胚性愈傷組織的成活率隨著培養(yǎng)時間的延長而增大；凍后黑暗培養(yǎng)超過5 d，黃獨胚性愈傷組織的成活率顯著下降。本實驗結(jié)果與李紅民等[13]對匍匐翦股穎胚性愈傷組織、簡令成等[14]對甘蔗胚性愈傷組織、蘇新等[15]對浙貝母愈傷組織的研究結(jié)果相一致，推測凍后黑暗培養(yǎng)對細胞的恢復(fù)是必需的，有助于修復(fù)受損傷的膜[16]，恢復(fù)活性氧防御系統(tǒng)功能[17]，減少褐變[18]，從而提高成活率；但凍后黑暗培養(yǎng)時間過長，不利于成活率的增加，可能是暗培養(yǎng)時間過長，光照不足，細胞分裂和分化受到抑制所致[12。同時，本實驗的半薄切片觀察結(jié)果也表明，凍后未經(jīng)黑暗培養(yǎng)直接置于光周期下培養(yǎng)，會造成細胞排列疏松，局部某些部位會出現(xiàn)較大的細胞空隙；凍后經(jīng)過適宜時間的黑暗培養(yǎng)，再置于光周期下培養(yǎng)，細胞排列比較緊密，細胞空隙較小。因此，推測凍后黑暗培養(yǎng)在一定程度上保證了胚性愈傷組織細胞結(jié)構(gòu)的完整性，從而提高了愈傷組織的成活率。

圖4 黃獨胚性愈傷組織再生植株莖(×10)和維管束(×40)的半薄切片觀察Fig.4 Semi thin section observation of the stem (×10) and vascular bundle (×40) of plantlet regenerated from Dioscorea bulbifera L. embryogenic calli

圖5 黃獨胚性愈傷組織再生植株葉(×10)和氣孔器(×40)的半薄切片觀察Fig.5 Semi thin section observation of the leaf (×40) and stomatal apparatus (×40) of plantlet regenerated from Dioscorea bulbifera L. embryogenic calli

由于超低溫保存過程是一種逆境處理，在此過程中，材料會經(jīng)歷滲透脅迫、氧化脅迫、干旱脅迫和低溫脅迫等各種脅迫，這些脅迫對植物的遺傳信息會產(chǎn)生較大的影響[12]。因此，對胚性愈傷組織凍后再生植株的遺傳穩(wěn)定性進行檢測是植物種質(zhì)資源超低溫保存的一個必要步驟。目前，關(guān)于凍后再生植株遺傳穩(wěn)定性的檢測主要是通過形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)[19]、同工酶[20]和DNA分子標(biāo)記[21]的手段來實現(xiàn)的。本實驗對黃獨凍后黑暗培養(yǎng)胚性愈傷組織再生植株以及黃獨常溫繼代再生植株的形態(tài)解剖學(xué)結(jié)構(gòu)進行半薄切片觀察發(fā)現(xiàn)，黃獨凍后黑暗培養(yǎng)胚性愈傷組織再生植株的莖結(jié)構(gòu)、葉肉細胞的平均葉綠體數(shù)量均與常溫繼代再生植株無顯著性差異。黃獨胚性愈傷組織的超低溫保存可保證其形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的一致性，為黃獨胚性愈傷組織的超低溫保存提供了顯微結(jié)構(gòu)依據(jù)。本實驗結(jié)果與李艷娜等[22]對香蕉胚性細胞懸浮系、陳冠群等[23]對百子蓮胚性愈傷組織的研究結(jié)果相一致。

[1] SANDOVAL-CANCINO G， SENZ L， CHAN J L， OROPEZA C. Improved formation of embryogenic callus from coconut immature inflorescence explants[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant， 2016， 52(4): 367-378.

[2] HUGO P F F， LEILA N V， CATARINA C P， et al. High-efficiency cryopreservation ofAraucariaangustifolia(Bertol.) Kuntze embryogenic cultures: ultrastructural characterization and morpho-physiological features[J].PlantCellTissueandOrganCulture， 2016， 66(2): 1-12.

[3] HOFER M. Cryopreservation ofinvitroshoot tips of strawberry by the vitrification method-establishment of a duplicate collection ofFragariagermplasm[J].Cryo-Letters， 2016， 37(3): 163-172.

[4] GUPTA S. Cryopreservation of shoot tips ofFragariaspp. and virus elimination through cryotherapy[J].Cryobiology， 2016， 73(3): 404.

[5] ENGELMANN F， LARTAUD M， CHABRILLANGE N， et al. Cryopreservation of embryogenic calluses of two commercial clones ofHeveabrasiliensis[J].Cryo-Letters， 1997， 18(2): 107-116.

[6] PRUDENTE D O， PAIVA R， PAIVA P D O， et al. Cryopreservation of shoot tips excised from zygotic embryos ofAraucariaangustifolia(Bertol.) Kuntze[J].ActaHorticulturae， 2016 (1113): 257-264.

[8] 蔡月琴， 王艷平， 莊君娥， 等. 紫參薯的包埋玻璃化超低溫保存[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)， 2016， 38(9): 58-64.

CAI Y Q， WANG Y P， ZHUANG J E， et al. Cryopreservation of purple yam (Dioscoreaalata) by encapsulation-vitrification[J].JournalofSouthwestUniversity(NaturalScienceEdition)， 2016， 38(9): 58-64. (in Chinese with English abstract)

[9] 曲曉宇， 周利婷， 張四喜， 等. 黃獨素B致小鼠肝損傷過程中對肝外排型轉(zhuǎn)運體Mrp2表達的影響[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2016， 36(19): 1633-1636.

QU X Y， ZHOU L T， ZHANG S X， et al. Changs of expression of liver afflux transporter Mrp2 during diosbulbin B induced liver injury in mice[J].ChineseJournalofHospitalPharmacy， 2016， 36(19): 1633-1636. (in Chinese with English abstract)

[10] HONG S， YIN M， SHAO X， et al. Cryopreservation of embryogenic callus ofDioscoreabulbiferaby vitrification[J].CryoLetters， 2009， 30(1): 64-75.

[11] YIN M H， HONG S R. A simple cryopreservation protocol ofDioscoreabulbiferaL. embryogenic calli by encapsulation-vitrification[J].PlantCellTissueandOrganCulture， 2010， 101(3): 349-358.

[12] 王子成， 曲先， 薄濤. 超低溫保存脫除兩種馬鈴薯病毒[J]. 河南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)， 2011， 41(6): 609-614.

WANG Z C， QU X， BO T. Elimination of two potato virus by cryopreservation[J].JournalofHenanUniversity(NaturalScienceEdition)， 2011， 41(6): 609-614. (in Chinese with English abstract)

[13] 李紅民， 馬暉玲. 玻璃化法超低溫保存匍匐翦股穎胚性愈傷組織及其植株再生[J]. 甘肅農(nóng)大學(xué)報， 2009， 44(4): 62-66.

LI H M， MA X L. Cryopreservation of creeping bentgrass embryogenic callus by vitrification and its plant regeneration[J].JournalofGansuAgriculturalUniversity， 2009， 44(4): 62-66. (in Chinese with English abstract)

[14] 簡令成， 孫德蘭， 孫龍華. 甘蔗愈傷組織超低溫保存中一些因素的研究[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(英文版)， 1987， 29(2): 123-131.

JIAN L C， SUN D L， SUN L H. Studies on factors in cryopreservation of sugarcane calluses[J].ActaBotanicaSinica， 1987， 29(2): 123-131. (in Chinese with English abstract)

[15] 蘇新， 方堅. 浙貝母愈傷組織超低溫保存的研究[J]. 中藥材， 1990， 13(12): 3-5.

SU X， FANG J. Cryopreservation of calli ofFritillariathunbergiiMiq[J].JournalofChineseMedicinalMaterials， 1990， 13(12): 3-5. (in Chinese)

[16] 文彬. 植物種質(zhì)資源超低溫保存概述[J]. 植物分類與資源學(xué)報， 2011， 33(3): 311-329.

WEN B. An introduction to cryopreservation of plant germplasm[J].PlantDiversityandResources， 2011， 33(3): 311-329. (in Chinese with English abstract)

[17] WEN B， CAI C， WANG R， et al. Cytological and physiological changes in recalcitrant Chinese fan palm (Livistonachinensis) embryos during cryopreservation[J].Protoplasma， 2012， 249(2): 323-335.

[18] KHODDAMZADEH A A， SINNIAH U R， LYNCH P， et al. Cryopreservation of protocorm-like bodies (PLBs) ofPhalaenopsisbellina， (Rchb.f.) christenson by encapsulation-dehydration[J].PlantCellTissueandOrganCulture， 2011， 107(3): 471-481.

[19] 艾鵬飛， 羅正榮. 柿和君遷子試管苗莖尖玻璃化法超低溫保存及再生植株遺傳穩(wěn)定性研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2004， 37(12): 2023-2027.

AI P F， LUO Z R. Cryopreservation ofinvitroshoot-tips of persimmon and date plum by vitrification and genetic stability of regenerated plantlets[J].ScientiaAgriculturaSinica， 2004， 37(12): 2023-2027. (in Chinese with English abstract)

[20] 趙喜亭， 蔣麗微， 宋萍萍， 等. 懷黃菊微滴玻璃化超低溫保存再生植株的生理和同工酶分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 45(5):111-114.

ZHAO X T， JIANG L W， SONG P P， et al. Analysis of physiology and isoenzyme of regenerated plantlets ofChrysanthemummorifolium‘Huaihuang’ cryopreserved by droplet vitrification[J].JournalofHenanAgriculturalSciences， 2016， 45(5): 111-114. (in Chinese with English abstract)

[21] 邵麗， 王子成. 植物種質(zhì)超低溫保存遺傳穩(wěn)定性的研究進展[J]. 植物生理學(xué)報， 2010， 46(11): 1109-1113.

SHAO L， WANG Z C. Review of genetic stability research for plant germplasm cryopreservation[J].PlantPhysiologyJournal， 2010， 46(11): 1109-1113. (in Chinese with English abstract)

[22] 李艷娜， 尉義明， 胡桂兵， 等. 香蕉胚性細胞懸浮系玻璃化法超低溫保存及再生植株遺傳穩(wěn)定性分析[J]. 園藝學(xué)報， 2010， 37(6): 899-905.

LI Y N， WEI Y M， HU G B， et al. Plant regeneration via somatic embryogenesis after cryopreservation of embryogenic cell suspensions of banana (Musaspp. AAA) by vitrification and the genetic stability of regenerated plant[J].ActaHorticulturaeSinica， 2010， 37(6): 899-905. (in Chinese with English abstract)

[23] 陳冠群， 李曉丹， 申曉輝. 百子蓮胚性愈傷組織玻璃化法超低溫保存體系建立及遺傳穩(wěn)定性分析[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)， 2014， 32(5): 76-83， 94.

CHEN G Q， LI X D， SHEN X H. Vitrification-based cryopreservation of embryogenic callus ofAgapanthuspraeconssp. Orientalis and analysis of genetic stability by AFLP[J]. JournalofShanghaiJiaotongUniversity(AgriculturalScience)， 2014， 32(5): 76-83， 94. (in Chinese with English abstract)