不同肥料對黃果柑果實酚類物質的影響

黃勝佳，葉 霜，劉新亞，席利娟，汪志輝，b，*，付佳玲

(四川農業(yè)大學 a. 園藝學院；b. 果蔬研究所，四川 成都 611130)

中國是柑橘果樹的重要起源地之一，具有豐富的柑橘種質資源。黃果柑是橘和橙的天然雜交柑[1]，具有特晚熟、極豐產、花果同樹等優(yōu)良性狀[2]。柑橘果實富含能參與人體新陳代謝、調節(jié)有關生理活動、對人體保健和疾病防治有重要作用的生物活性物質——酚類物質[3-5]。研究表明，酚類物質具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抗過敏、抗癌、抗突變、抑菌等重要作用[8]。因此，研究不同肥料對柑橘酚類物質含量的影響，對提高柑橘綜合利用價值具有積極意義。

國內外在測定不同柑橘品種、不同部位，以及不同生長時期果實中酚類物質含量等方面已有大量研究，但在環(huán)境因子，如土壤營養(yǎng)對柑橘生物活性物質代謝的影響方面的研究還比較少。已有研究表明，適量限制氮、磷肥的施用有利于黃酮類物質的積累[9]。氮素營養(yǎng)的缺乏會導致萜類、酚類等不含氮次生代謝產物的積累，而增加氮素營養(yǎng)會加速含氮次生代謝產物如生物堿、氰苷等的合成[10]。氮肥能顯著影響西紅柿幼苗中酚的含量[11]，也能影響枸杞中黃酮和類胡蘿卜素等生物活性物質的含量。目前，關于肥料對植物酚類物質含量影響的研究大多注重于氮肥用量，而有關有機肥等肥料對其影響的研究報道較少。

灰色關聯度分析法是一種針對灰色系統來決定因素主次及其關聯程度的評價方法。本研究結合灰色關聯度分析法評價不同施肥處理對黃果柑果實酚類物質的影響，以期為增加果實保健價值和提高柑橘的綜合利用率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗基地與供試植株

試驗于四川省雅安市石棉縣小水村黃果柑示范園中進行。選取生長健壯、樹勢樹形基本一致、株行距為3 m × 4 m、中等管理水平的9 a生黃果柑植株27株作為供試植株。

1.2 試驗材料

有機肥：發(fā)酵后的雞糞，N+P+K≥8%，有機質含量≥40%。

無機肥：尿素(N≥46.3%)，四川玖源農資化工有限公司生產；過磷酸鈣(P2O5≥12.0%)，四川廣漢市蜀峰化工有限責任公司生產；俄羅斯鉀肥(K2O≥60%)，江西宜春市騰達化工有限責任公司生產。

有機無機復混肥：寶施靈黃果柑專用肥。具體配方為硫酸銨(10%)，尿素(19.6%)，磷酸一銨(15.9%)，硅鈣鉀肥(2.5%)，硝酸鉀(1%)，硫酸鉀(19%)，硫酸鋅(2%)，鉬酸銨(0.02%)，氨基酸(5%)，草炭(2%)，泥炭(2%)，堆肥(4%)，煙渣(2%)，青蒿(3%)，米皮(5%)，蘑菇渣(7%)。

標準品：柚皮素(naringenin)，柚皮苷(naringin)，新橙皮苷(neohesperidin)，咖啡酸(caffeic acid)，芥子酸(sinapic acid)，綠原酸(chlorogenic acid)，阿魏酸(ferulic acid)，沒食子酸(gallic acid)，對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)，均購自Sigma公司，純度均在98%以上；甲醇、甲酸和乙腈均為色譜純，購自麥克林公司；水為實驗室自制的超純水。

1.3 試驗設計

本試驗共選擇無機肥(A)、有機肥(B)、有機無機復混肥(C)3類肥料，每類肥料再分別設置低水平(1)、適量(2)、高水平(3)3種用量，共計9個處理，每處理重復3次，以1棵黃果柑作為1個重復。分別于幼果期(5月1日)、果實快速膨大期(8月5日)、轉色期(11月10日)各施肥1次。根據文獻[12]并結合當地黃果柑園地土壤及施肥情況，設計肥料施用量(表1)，其中，A2、B2、C2均為每種類型肥料中最適黃果柑生長發(fā)育的肥料用量。施肥時，圍繞樹冠滴水線的施肥圈，施肥圈要求深度和寬度達到20～30 cm，以見根不傷根為宜，在施肥圈內放入試驗設計用量的肥料，施有機肥時土肥混勻。

1.4 采樣

2016-04-15采收，分株單獨采摘，每株按樹冠外圍的東西南北4個方位隨機采取中等大小、成熟度相對一致、無病蟲害且無霉爛的果實共12個，采回后將果實皮肉分離，置于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 柑橘酚類物質含量測定

1.5.1 樣品前處理

從-80 ℃冰箱中取果肉至研缽中，加入液氮研磨成粉末。準確稱取0.5 g混合樣放入2 mL離心管中，避光條件下加入1.5 mL提取液(甲醇、水、甲酸體積比70%∶28%∶2%)，充分混勻。將離心管放入超聲裝置中輔助提取，超聲30 min后，5 000 r·min-1離心15 min。取出離心管，吸取上清液。用0.45 μm微孔濾膜過濾，貯存于-20 ℃，用于酚酸及類黃酮分析。

表1各處理的施肥安排

Table1Fertilization arrangement of treatments

kg

1.5.2 標準曲線繪制

用色譜純甲醇分別將每瓶定量的20 mg標準品溶解，定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成2 g·L-1的標準品溶液。全程進行避光處理。將上述母液用甲醇分別配制成0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100 mg·L-1的濃度梯度，再配制成混合標準溶液，避光保存于-20 ℃以下環(huán)境中。

對不同質量濃度的混合標準溶液進行色譜分析，以標樣的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制出9種酚類物質的標準曲線，擬算回歸方程和相關系數。

1.5.3 色譜條件

使用安捷倫1260液相色譜儀，C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；流動相A為10%甲酸溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫(洗脫程序如表2所示)；流速1 mL·min-1。

柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素在283 nm波長下檢測[13]；咖啡酸、芥子酸、綠原酸、阿魏酸在320 nm波長下檢測；沒食子酸、對羥基苯甲酸在260 nm波長下檢測[14]。

表2流動相配比與洗脫時間

Table2Flow matching ratio and elution time

t/minA/%B/%095525851542782250643655955

1.6 數據分析

試驗數據用IBM SPSS 19.0軟件進行方差分析。綜合評價基于Critic和熵權2種客觀賦權法進行灰色關聯度分析。

2 結果與分析

2.1 酚類物質標準品的色譜分析

圖1為混合標準品55 min內分別在320、283、260 nm波長下的色譜圖。根據保留時間長短，峰依次為沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素。由圖1可知，8種酚類物質出峰較好，說明本研究所用方法可滿足多種酚類物質的同時分離。圖2為對羥基苯甲酸在260 nm波長下的色譜圖。由于對羥基苯甲酸出峰時間與綠原酸出峰時間相近，故分開測定。

根據色譜圖擬合的回歸方程及相關系數見表3。可以看出，各標準品的濃度與峰面積呈良好的線性相關關系，相關系數均超過0.999 1。

2.2 不同肥料對黃果柑酚酸類物質含量的影響

由表4可知，不同施肥處理黃果柑酚酸含量組成差異較大。各處理條件下，在黃果柑果肉中均檢測到了綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、沒食子酸和對羥基苯甲酸。綠原酸含量以B2處理最高(4.765 μg·g-1)，顯著(P<0.05)高于其他處理，以A3處理最低(2.885 μg·g-1)?？Х人岷恳訠1處理最高(3.529 μg·g-1)，顯著(P<0.05)高于其他處理，以C1處理最低(2.692 μg·g-1)。阿魏酸含量以B1處理最高(1.101 μg·g-1)，顯著(P<0.05)高于其他處理，以C1處理最低(0.838 μg·g-1)。芥子酸含量以B2處理最高(1.749 μg·g-1)，顯著(P<0.05)高于其他處理，以C1處理最低(1.205 μg·g-1)。沒食子酸含量以B1處理最高(3.507 μg·g-1)，顯著(P<0.05)高于其他處理，以B3處理最低(1.595 μg·g-1)。對羥基苯甲酸含量以B2處理最高(6.261 μg·g-1)，顯著(P<0.05)高于其他處理，以C1處理最低(4.262 μg·g-1)。總體來看，酚酸類物質含量最高的主要出現在B1、B2處理。這說明，低水平或適量的有機肥能顯著提高果肉中酚酸物質含量。在施用無機肥的3個處理中，A1處理果肉中酚酸含量顯著(P<0.05)高于A2、A3處理，且僅次于B1、B2處理。這說明，施用低水平平氮磷的無機肥亦能取得較好效果。

1， 沒食子酸； 2， 綠原酸； 3， 咖啡酸； 4， 阿魏酸； 5， 芥子酸； 6， 柚皮苷； 7， 新橙皮苷； 8， 柚皮素。1， Gallic acid; 2， Chlorogenic acid; 3， Caffeic acid; 4， Ferulic acid; 5， Sinapic acid; 6， Naringin; 7， Neohesperidin; 8， Naringenin.圖1 混合標樣在不同波長下的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard samples under different wavelength

1，對羥基苯甲酸 p-hydroxybenzoic acid.圖2 對羥基苯甲酸在260 nm波長下的色譜圖Fig.2 Chromatogram of p-hydroxybenzoic acid under 260 nm wavelength

表3標準曲線及相關系數

Table3Standard curve and correlation coefficient

樣品名稱回歸方程相關系數SampleRegressionequationCorrelationcoefficient咖啡酸Caffeicacidy=139.21x-86.5330.9996阿魏酸Ferulicacidy=107.09x-27.8130.9999綠原酸Chlorogenicacidy=35.869x-9.5490.9992芥子酸Sinapicacidy=100.16x-11.5231.0000新橙皮苷Neohesperidiny=41.455x-22.920.9993柚皮素Naringeniny=72.394x-53.7710.9991柚皮苷Naringiny=27.071x-0.7560.9999沒食子酸Gallicacidy=44.696x+21.6050.9997對羥基苯甲酸p-Hydroxybenzoicacidy=113.19x-16.5810.9996

表4黃果柑果肉中酚酸物質含量

Table4Quantity of phenolic acid in Huangguogan sarcocarp

μg·g-1

表中所有含量均以鮮質量計。同列數據后無相同小寫字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Contents listed in the above table were calculated based on fresh weight. Data within the same column followed by no same letters indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

2.3 不同肥料對黃果柑中類黃酮物質含量的影響

由表5可知，各處理果實中均檢測到了柚皮苷和新橙皮苷，但均未檢測到柚皮素。各處理柚皮苷含量在2.026～4.356 μg·g-1之間，新橙皮苷含量在0.546～0.757 μg·g-1之間。對比果肉中柚皮苷的含量可知，B3處理含量最高，且顯著(P<0.05)高于其他處理。同時，以B3、B2和A1處理的新橙皮苷含量較高。

2.4 基于Critic與熵權法的灰色關聯度分析

2.4.1 熵權法分析

熵原本是熱力學的概念，主要用于形容指標信息的離散程度。一般地，如果某個指標的信息熵(Ej)越小，表明其指標值的變異程度越大，提供的信息量越大，在綜合評價中所起的作用越大,其權重也應越大；反之，某指標的信息熵越大，表明其指標值的變異程度越小，提供的信息量越小，在綜合評價中所起的作用越小，其權重也應越小。

表5黃果柑果肉中類黃酮含量

Table5Quantity of flavonoid in Huangguogan sarcocarp

μg·g-1

ND, 未檢出。

ND, Not detected.

根據熵權法的計算步驟[15]，對不同酚類物質的信息熵和權重熵(ωj)進行測算(因柚皮素在所有處理下都未檢測到，故不予考慮)。由表6可知，柚皮苷、沒食子酸和綠原酸3個指標的熵值低，差異性系數高，差異梯度較大，因此賦予高權重。柚皮苷權重值最大，為0.296 0；其次為沒食子酸(0.292 7)，綠原酸(0.128 4)，阿魏酸權重值最小，為0.034 5。所得指標權重排序為柚皮苷>沒食子酸>綠原酸>對羥基苯甲酸>芥子酸>咖啡酸>新橙皮苷>阿魏酸。

2.4.2 Critic法分析

Critic法是由Diakoulaki等[16]提出的另一種客觀權重賦權的方法。該方法基于評價指標的對比強度和指標之間的沖突性來綜合衡量指標的客觀權重。對比強度，是指同一個指標各個評價方案之間取值差距的大小，以標準差的形式來表現；指標之間的沖突性，以指標之間的相關性為基礎，若2個評價指標之間具有較強的正相關性，則這2個指標的沖突性較低。用Cj表示第個評價指標所包含的信息量，值越大，說明其所包含的信息量越大，則其權重(ωj)亦越大。

表6各指標的權重(熵權法)

Table6Index weights (Entropy weight method)

樣品SampleEjωj綠原酸Chlorogenicacid0.99430.1284咖啡酸Caffeicacid0.99790.0477阿魏酸Ferulicacid0.99850.0345芥子酸Sinapicacid0.99680.0708沒食子酸Gallicacid0.98690.2927對羥基苯甲酸p-Hydroxybenzoicacid0.99620.0847柚皮柑Naringin0.98680.2960新橙皮苷Neohesperidin0.99800.0453

由表7可知，沒食子酸權重值最大(0.252 2)，其次為柚皮苷(0.206 2)、綠原酸(0.195 8)，阿魏酸權重最小(0.025 1)。所得指標權重排序為沒食子酸>柚皮苷>綠原酸>對羥基苯甲酸>咖啡酸>芥子酸>新橙皮苷>阿魏酸。

2.4.3 Critic法與熵權法結合分析

Critic和熵權法計算指標權重都屬于客觀賦權的方法，其中，熵權法主要表現指標數據的離散性，Critic法則既兼顧到指標數據的相關性，又考慮到數據之間的對比強度。如果將這2種方法相結合，則可以充分考慮到數據的離散性、相關性和對比強度，是一種更加完善的進行客觀賦權的方法，計算公式如下：

(1)

式(1)中：ωj是第j個指標權重；qij是指標i與j的相關系數；σj是指標j的標準差；ej是指標j的熵。

基于Critic法與熵權法相結合的權重賦值結果如表8所示，沒食子酸權重值最大(0.195 2)，其次為新橙皮苷(0.178 3)、綠原酸(0.140 3)，芥子酸權重值最小(0.075 5)。所得指標權重排序依次為沒食子酸>新橙皮苷>綠原酸>阿魏酸>對羥基苯甲酸>柚皮苷>咖啡酸>芥子酸。

表7各指標的權重(Critic法)

Table7Index weights (Critic method)

樣品SampleCjωj綠原酸Chlorogenicacid1.36830.1958咖啡酸Caffeicacid0.45210.0647阿魏酸Ferulicacid0.17550.0251芥子酸Sinapicacid0.23980.0343沒食子酸Gallicacid1.76250.2522對羥基苯甲酸p-Hydroxybenzoicacid1.34220.1921柚皮柑Naringin1.44090.2062新橙皮苷Neohesperidin0.20710.0296

表8各指標的權重(基于Critic與熵權法的客觀賦權法)

Table8Index weights (Objective weighting method based on Critic and Entropy method)

樣品Sampleωj綠原酸Chlorogenicacid0.1403咖啡酸Caffeicacid0.0850阿魏酸Ferulicacid0.1172芥子酸Sinapicacid0.0755沒食子酸Gallicacid0.1952對羥基苯甲酸p-Hydroxybenzoicacid0.1075柚皮柑Naringin0.1009新橙皮苷Neohesperidin0.1783

2.4.4 灰色關聯度分析

將灰色關聯分析與客觀賦權法相結合，可以克服采用專家賦權法等主觀賦權的不確定性。對試驗數據進行以下處理：根據實際情況，確定黃果柑主要酚類物質的理想值為參試施肥處理的最高值，組成參考數列X0。為便于分析，采用初值化法對原始數據進行無量綱化處理。求關聯系數，進而分別計算求得關聯度和關聯序。對于不同酚類物質，其相對重要程度不同，采用基于Critic與熵權法的客觀賦權法的結果賦予關聯系數不同的權重值ωj，加權關聯度對各施肥處理進行評價，結果見表9。B1處理的關聯度最大，最接近參考數列，即各酚類物質在B1處理下都具有較高含量，其次為B2和A1處理。

表9不同施肥處理的關聯度

Table9Relational grade of different fertilizer treatments

處理Treatment關聯度RelateddegreeA10.8028A20.6518A30.6187B10.9122B20.8859B30.7447C10.5426C20.5690C30.7505

3 討論

本研究發(fā)現，有機肥、無機肥、有機無機復混肥的施用量對黃果柑酚類物質含量的影響不僅與肥料中氮磷含量密切相關，還與肥料種類相關。單施無機肥時，低水平的氮磷施入量較有利于酚酸和類黃酮物質的積累，這與Copley等[10]、Strissel等[22]的研究結果一致。單施有機肥時，適量或低水平有機肥對增加果實中酚酸含量的效果較好，但當施用高水平有機肥時效果不理想，而適量或高水平有機肥對增加果實中類黃酮物質的效果較好，施用低水平有機肥時效果不明顯。有機無機復混肥的用量則以高水平較好，能顯著增加果肉中酚酸和類黃酮物質含量。本研究在黃果柑果肉中未檢測到柚皮素，與張元梅[14]結果一致。

為準確評價不同施肥處理對黃果柑果實酚類物質的影響，本研究利用基于Critic與熵權法的客觀賦權進行灰色關聯度分析，結果顯示，施用低水平的有機肥對黃果柑果肉中酚類物質含量的提高效果最好，施用適量有機肥和低水平氮磷無機肥的效果次之。因此，在生產實際中，建議適當減少無機肥中氮磷施用量，或適當增施有機肥和有機無機復混肥，以增加黃果柑果肉中酚類物質含量。本研究未涉及不同施肥水平對黃果柑果實發(fā)育和果實品質的影響，在今后的研究中，應進一步結合不同施肥水平對酚類物質、果實生長發(fā)育及果實品質的影響，全面分析，以確定最適肥料種類和施肥量。

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