肉牛源毛孢子菌Trichosporon loubieri的分離鑒定與藥敏試驗

鐘 銳，姜堯章，馬曉平，*，左之才，黃小麗，鄧俊良，沈留紅，余樹民

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，四川 成都 611130)

毛孢子菌(Trichosporonspp.)可引起人和動物毛孢子菌病。該菌屬于半知菌門、芽生菌綱、隱球酵母目、隱球酵母科的酵母樣真菌[1]。毛孢子菌引起淺表感染稱為白毛結節(jié)，為白色、棕黑色或綠色顆粒狀紡錘狀小結節(jié)，包圍毛干并呈不規(guī)則分布，多見于男青年，特別是生殖器周圍。也可引起侵襲性感染，主要包含真菌血癥、單個器官感染和播散性毛孢子菌病。播散性毛孢子菌病是一種致死性的機會性感染，常發(fā)生于免疫低下的病人，尤其是因患有血液病或化療而出現(xiàn)中性粒細胞減少的患者[2]。在惡性血液病患者中，毛孢子菌屬已成為除念珠菌屬外致人類播散性感染第二位的酵母菌[3]。

毛孢子菌的生態(tài)適應性較廣，既可見于環(huán)境中、腐敗物中、寄生于水和植物中，也可分離于人體的特定部位(消化道、呼吸道、泌尿道和皮膚)。1992年，Gueho等人將毛孢子菌分為19個種，至少6個種對人類有致病意義，分別為阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii)、粘質(zhì)毛孢子菌(Trichosporonmucoides)、星形毛孢子菌(Trichosporonasteroids)、皮瘤毛孢子菌(Trichosporoninkin)、皮膚毛孢子菌(Trichosporoncutaneum)及卵形毛孢子菌(Trichosporonovoides)，其中T.asahii最為常見。近年出現(xiàn)了少見毛孢子菌引發(fā)的感染，如Trichosporondermatis和T.loubieri[4]。這些致病毛孢子菌不僅可導致淺部感染，更重要的是可導致免疫低下或免疫功能抑制患者的深部感染[2]，主要表現(xiàn)為真菌血癥及皮膚、臟器的播散性感染[2]。有報道稱毛孢子菌也會引起哺乳動物白毛結節(jié)病[5]，還可以引起貓的系統(tǒng)性感染[6]。本試驗從自然發(fā)病肉牛體表分離到了一株真菌，對其進行形態(tài)學與分子生物學相結合的鑒定，發(fā)現(xiàn)其為T.loubieri，并對該菌進行了小鼠致病性和藥敏試驗。

1 材料與方法

1.1 病料

患皮膚病肉牛(自然發(fā)病)的皮屑和被毛采集自四川某地肉牛養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑和儀器

放線菌酮購自Amresco公司。氯霉素購自北京索萊寶科技有限公司。酵母基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)等其他分子生物學試劑均購自成都擎科梓熙生物技術有限公司。GreenView(EB最新替代品)購自成都博瑞克生物技術有限公司。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer， ITS)通用引物和IGS區(qū)通用引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。伏立康唑、氟康唑、克霉唑等藥敏紙片由丹麥Rosco公司提供。

含放線菌酮和氯霉素的沙氏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(SDA)、尿素瓊脂培養(yǎng)基均按文獻報道的方法配制[7]。

試驗用主要儀器包括上?，槴\RQX-300B智能型人工氣候箱、日本尼康NIKON ECLIPSE CI正置光學顯微鏡和Nikon DS-U3成像系統(tǒng)、德國Thermo Fisher離心機、美國BIO-RAD公司PCR擴增儀PTC200 NDA Engine Cycler、德國萊卡RM2016切片機。

1.3 病牛皮膚真菌病的診斷

1.3.1 病牛皮膚真菌病的診斷

用無菌手術刀片取患處病健結合部皮屑，毛發(fā)數(shù)根，置于載玻片上，滴加100 g·L-1KOH溶液2滴，蓋上蓋玻片，靜置10 min后，鏡檢觀察是否存在菌絲、孢子，及其形態(tài)、排列等，可做出初步診斷[8]。

1.4 真菌的分離純化

1.4.1 病料的采集

在確診為皮膚真菌病的患部用75%乙醇消毒，再用滅菌鑷子在病健結合部取毛15～20根；然后用滅菌刀片刮取皮屑至微微出血，將樣本裝入滅菌試管內(nèi)，20 g·L-1碘酊對取樣處消毒[9]。將采集的樣本放入4 ℃的保溫箱，送實驗室分離培養(yǎng)。

1.4.2 分離培養(yǎng)與純化

將樣品接種到加有放線菌酮和氯霉素的SDA中。25 ℃恒溫培養(yǎng)，每2 d觀察1次。1周后，將單菌落接種到SDA培養(yǎng)基純化，25 ℃培養(yǎng)，用以進行形態(tài)學和分子生物學鑒定、致病性試驗以及藥敏生化試驗。

1.4.3 形態(tài)學鑒定

取單菌落接種于新的SDA培養(yǎng)基中觀察菌落特征。用銅圈法[10]制作菌株小培養(yǎng)以觀察菌絲和孢子形態(tài)。待接種的菌株產(chǎn)孢子后，輕輕取下蓋玻片并置于載玻片上，棉蘭染色鏡檢、拍照。

1.5 分子生物學鑒定

1.5.1 引物

ITS區(qū)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[11]，由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

IGS1區(qū)特異性引物26SF(5′-ATCCTTTGCAGACGACTTGA-3′)和5SR(5′-AGCTTGACTTCGCAGATCGG-3′)[12]，由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

1.5.2 真菌DNA的提取

按照天根生化科技有限公司試劑盒說明書提取純化菌落的DNA。

1.5.3 ITS區(qū)的PCR擴增

采用50 μL反應體系：2×T5 Super PCR Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL。DNA模板2 μL，Deionized water補足至50 μL；擴增反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 3 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min結束反應，16 ℃保存。

1.5.4 IGS區(qū)的PCR擴增

采用50 μL反應體系：2×T5 Super PCR Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL。DNA模板2 μL，Deionized Water補足至50 μL；擴增反應條件：98 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 3 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；結束反應，4 ℃保存。

1.5.5 PCR產(chǎn)物的電泳鑒定

取8 μL擴增產(chǎn)物和10 μL 12 000 bp DNA Ladder Marker，在含EB的10 g·L-1瓊脂糖凝膠的點樣孔中點樣，電壓120 V，電流80 mA，電泳60 min，以凝膠成像系統(tǒng)分析擴增結果。

1.5.6 序列分析

由成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。把已測定序列提交GenBank，獲得序列號。在NCBI中用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行相似性比較，用MEGA 7.0軟件進行多重序列比較，并用最大簡約法(maximum parsimony)構建種系發(fā)生樹，并通過1 000次自展分析(bootstrap)對樹進行置信度檢測。

1.6 動物致病性試驗

刮取SDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)5 d的分離株菌落，并用滅菌生理鹽水混勻制成菌懸液備用，菌懸液濃度為1×107cfu·mL-1。將27只體況相近的6～8周齡健康小鼠(雌雄不限)隨機分為A、B、C三組，每組9只。A組為免疫抑制組，B組為非免疫抑制組，C組為空白對照組。飼養(yǎng)1周消除應激反應后，A組用環(huán)磷酰胺和青霉素鈉進行免疫抑制，腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg·kg-1和青霉素鈉15 mg·只-1，隔天注射一次，連續(xù)3次。A、B、C三組再分別分為皮膚涂擦組A1、B1、C1，皮下注射組A2、B2、C2和腹腔注射組A3、B3、C3，每小組3只。A1、B1組小鼠試驗前剪除背部毛發(fā)，約3 cm×2 cm。接種時消毒后，用無菌粗砂紙輕輕磨破小鼠背部皮膚至點狀滲血為宜，涂布菌懸液，A2、B2組小鼠皮下注射菌懸液0.1 mL，A3、B3組小鼠腹腔注射0.1 mL菌懸液。C1組小鼠皮膚涂擦生理鹽水，C2組小鼠皮下注射0.1 mL生理鹽水，C3組小鼠腹腔注射0.1 mL生理鹽水。觀察接種處皮膚紅斑、脫屑、結痂和毛發(fā)生長變化。若小鼠出現(xiàn)嚴重癥狀提前導致死亡，則將該小鼠解剖并取小鼠患部被侵害組織進行逆培養(yǎng)，并取真菌菌體提取DNA進行分子生物學鑒定。感染后第7天，處死并解剖小鼠，肉眼觀察主要器官的病變，并取接種處皮膚，用100 mL·L-1福爾馬林固定，制作切片，進行HE染色，PAS染色[13]并在光學顯微鏡下進行病理組織學觀察及拍照。

1.7 藥敏試驗

1.7.1 培養(yǎng)基的制備

按照標準對試驗菌株純度檢測用沙氏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(SDA)進行配制[7]。

1.7.2 接種菌液的配置

將待測菌株接種于SDA培養(yǎng)基，挑取菌株用無菌水配制成菌懸液，在530 nm波長，用分光光度計調(diào)整濃度為0.5麥氏比濁管透光度，約為5×105cfu·mL-1，再用生理鹽水1∶1稀釋[14]。

表1小鼠致病性試驗的分組

Table1The grouping in pathogenicity test of mice

分組Group皮膚涂擦組Skininunctiongroup皮下注射組Subcutaneousinjectiongroup腹腔注射組Intraperitonealinjectiongroup免疫抑制組(A組)ImmunosuppressivegroupA1A2A3非免疫抑制組(B組)NonimmunosuppressivegroupB1B2B3空白對照組(C組)BlankcontrolgroupC1C2C3

按丹麥Rosco真菌藥敏紙片擴散法標準，取0.5 mL接種液傾注于9 cm平皿表面，將菌懸液涂布均勻，吸去多余的液體，25 ℃干燥10 min，貼藥片。在25 ℃中培養(yǎng)18～24 h后立即測量[15]。3人共3次分別測量抑菌圈直徑。將9次測量結果取平均值即為最終抑菌圈直徑大小。抑菌圈直徑≥20 mm的記為敏感；抑菌圈直徑在11～20 mm范圍內(nèi)的記為中介；抑菌圈直徑≤11 mm的記為耐藥。

2 結果與分析

2.1 實驗室診斷

在顯微鏡下觀察到菌絲和孢子，結合病牛患部被毛大面積脫落，皮膚角質(zhì)層增厚有大量鱗屑的臨床表現(xiàn)(圖1-A-B)，初步診斷該肉?；颊婢云つw病。

2.2 分離培養(yǎng)

從皮屑和毛發(fā)樣本中分離到3株真菌，經(jīng)形態(tài)學觀察，菌落形態(tài)和菌絲、孢子形態(tài)一致，均為圖2中菌落(圖2-A)和顯微特征(圖2-B-C)，故將各個分離株合并為一個菌株，將其編號為zrfg01。

2.3 形態(tài)學特征

菌落特征：25 ℃ SDA培養(yǎng)基上生長良好，菌落早期較濕潤，后漸干燥，菌落呈乳白色，類酵母型菌落，邊緣不整齊，可見伸入培養(yǎng)基的假菌絲(圖2-A)。

顯微特征：關節(jié)孢子呈柱狀至橢圓形，可見大量呈藕節(jié)狀的假菌絲和呈竹節(jié)狀的菌絲(圖2-B，C)。

2.4 分子生物學鑒定

經(jīng)PCR方法擴增菌株zrfg01的ITS區(qū)，成功獲得目的基因片段514 bp。序列提交GenBank，獲得序列號MF401392.1。用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的序列比對，獲得菌株ITS區(qū)序列與序列號為KC254110.1的T.loubieri相似性達99%。選擇同屬多個菌株做種間發(fā)生樹，發(fā)現(xiàn)各種間分枝混亂，多數(shù)種支持率不高，ITS區(qū)不適合于Trichosporon屬內(nèi)的種間鑒定(圖3)。

圖1 肉牛體表病變Fig.1 Pathological changes of beef cattle

A， 在SDA培養(yǎng)基上的菌落特征；B， 顯微鏡下孢子和菌絲的形態(tài)(200 ×)； C， 顯微鏡下孢子和菌絲的形態(tài)(400×)。A， Colony characteristics of SDA medium； B， Morphology of spores and hyphae under microscope (200 ×)； C， Morphology of spores and mycelium under microscope (400×).圖2 Trichosporon. loubieri的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of Trichosporon. loubieri

經(jīng)PCR方法擴增菌株zrfg01的IGS區(qū)，成功獲得目的基因片段542 bp。序列提交GenBank，獲得序列號MF401393.1。用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的序列比對，獲得菌株IGS區(qū)序列與序列號為KT936593.1的T.loubieri相似性達100%，構建種系發(fā)生樹顯示兩者以100%支持率聚在同一分支。故將zrfg01菌株鑒定為T.loubieri(圖4)。

2.5 致病性試驗

2.5.1 臨床癥狀

涂擦菌懸液1周后，實驗組精神食欲較差，被毛雜亂無光。對照組精神食欲沒有明顯變化。免疫抑制皮下注射組A2注射處形成肉芽組織，中央凹陷，出現(xiàn)潰爛結痂(圖5-B)。健康皮下注射組B2有一小鼠出現(xiàn)小膿腫(圖5-D)，其余沒有明顯變化。涂擦組A1、B1涂擦部位沒有明顯變化，外傷基本痊愈，毛發(fā)開始生長。

2.5.2 剖檢變化

A1組有一只小鼠患部出現(xiàn)膿汁(圖5-A)，其余無明顯變化。A2組皮下注射部形成肉芽腫，肉芽腫內(nèi)包裹著黏稠的膿汁(圖5-B-C)。A3組小鼠皮膚表面無明顯變化，腹腔中肝、腸、胃出現(xiàn)黏連，肝臟上出現(xiàn)膿腫壞死灶(圖5-D-E)。B3組無明顯變化。

圖3 ITS區(qū)種系發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree on ITS sequence of Trichosporon. loubieri

圖4 IGS區(qū)種系發(fā)生樹Fig.4 Phylogenetic tree on IGS sequence of Trichosporon. loubieri

A， 膿汁；B， 肉芽腫外部癥狀；C， 肉芽腫內(nèi)膿汁；D， 肝臟和腸道粘連；E， 肝臟上的膿腫壞死灶。A， Pus；B， External symptoms of granuloma；C， Pus in the granuloma；D， Liver adhesion with intestinal tract；E， An abscess necrotic foci on the liver.圖5 小鼠剖解病變Fig.5 Pathological changes of mice

2.5.3 病理組織學變化

皮膚及臟器組織病理變化主要為感染性肉芽腫，HE染色的病理切片可見肝臟輕度小血管擴張、病灶呈現(xiàn)中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，肝細胞增生、變形不明顯(圖6-A)。肌肉壞死(圖6-B)。皮膚病變處細胞壞死，有成纖維細胞和大量炎性細胞浸潤(圖6-C)。PAS染色在感染組織中可見形態(tài)各異的菌絲及圓形或卵圓形真菌孢子堆積(圖6-D)。

A， 肝臟血管周圍以中性粒細胞為主的炎性浸潤(400×)；B， 肌肉壞死(200×)；C， 真皮層壞死處炎性細胞浸潤(200×)；D， 病灶處PAS染色的孢子和菌絲(400×)。A， Liver vessels are surrounded by inflammatory infiltration neutrophils(400×)；B， Musclenecrosis(200×)；C， Inflammatory cell infiltration in the demis necrosis (200×)；D， Spore and hypha of PAS staining in lesion(400×).圖6 組織病理變化Fig.6 Histopathological change

2.5.4 逆培養(yǎng)結果

逆培養(yǎng)3 d后菌落形態(tài)為乳白色，黏稠，中等大小，邊緣可見伸入培養(yǎng)基的假菌絲。鏡檢可見大量關節(jié)孢子和真假菌絲，與分離株zrfg01的相關特征相符。經(jīng)測序，與分離株zrfg01為同一菌株。

2.6 藥敏試驗

試驗結果表明分離株T.loubieri對特比萘芬和氟胞嘧啶表現(xiàn)為耐藥，對伊曲康唑和酮康唑表現(xiàn)為中度敏感，對克霉唑、咪康唑、兩性霉素B、氟康唑和伏立康唑均表現(xiàn)為敏感。藥敏試驗結果歸納于表1。

表1T.loubieri對九種抗真菌藥物敏感性

Table1Susceptibility ofT.loubierito nine antifungal drugs

藥物名稱Drug抑菌圈直徑平均值Averagediametersofinhibitionzone/mm結果Results克霉唑CTRIM24.0S咪康唑MICOZ19.3S伊曲康唑ITRAC16.8I特比萘芬TERBI10.0R兩性霉素BAMPHO22.0S酮康唑KETOC18.3I氟胞嘧啶FLU-110.0R氟康唑FLUCZ22.7S伏立康唑VOR-122.7S

S為敏感(≥20 mm)；I為中度敏感(11～20 mm)；R為耐藥(≤11 mm)。

S， Sensitivity；I， Intermediate sensitivity；R， Resistance.

3 討論

隨著烈性傳染病被控制，一些少發(fā)病逐漸顯現(xiàn)出來。目前對阿薩希毛孢子菌病研究較多，對T.loubieri、T.dermatis等研究較少，但也有報道稱某些動物對這些少見的毛孢子菌易感。T.montevideense造成狗的肉芽腫性腦膜炎[16]。T.beigelii導致奶牛乳腺炎[17]。本試驗首次發(fā)現(xiàn)T.loubieri導致肉牛身體皮膚癬菌病。目前國內(nèi)對于T.loubieri研究很少，國外有報道稱該菌感染貓，引起全身多處潰瘍，剖解可見胸腔淋巴結，肺、胸膜上有多處白色結節(jié)病灶區(qū)[6]。多囊腎病患者在腎切除術后被該菌感染[18]。之后陸續(xù)有報道T.loubieri引起人的肺炎[19]、真菌血癥、肝臟損傷[20]等。

真菌核糖體RNA(rRNA)基因是串聯(lián)重復排列的結構，每個重復結構編碼18S、5.8S和26S基因，在兩個不同的區(qū)域間存在內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和基因間隔區(qū)(IGS)[21]。ITS具有準確、快速、引物通用性強、便于高通量測序與分析等優(yōu)點，因此被廣泛應用于真菌系統(tǒng)發(fā)育、種間和種內(nèi)遺傳多樣性研究[22]。近年，真菌rDNA ITS區(qū)測序后BLAST分析用于菌種的分子鑒定已廣泛應用，相似性超過98%的菌株可認定為同一菌種[22]，但根據(jù)本試驗ITS區(qū)構建的系統(tǒng)發(fā)生樹的結果不能確定該毛孢子菌的種，與夏志寬等[21]的報道一致。

IGS(intergenic spacer)是rDNA中變異最快的區(qū)域，且各重復單位間具有同步進化的特點，因此被廣泛用于同屬真菌不同種間、種內(nèi)不同群體間、近緣類群、雜交類群等關系的比較研究[23]。毛孢子菌屬各菌種間形態(tài)、生理、生化特點均較接近，單靠表型特征不易區(qū)別。根據(jù)本試驗研究結果，發(fā)現(xiàn)ITS區(qū)不能有效進行毛孢子菌的種間鑒定，而IGS區(qū)能清晰鑒定毛孢子菌分離株。

近年來，隨著免疫低下宿主的增多，臨床上真菌感染的發(fā)生越來越普遍。除念珠菌外，毛孢子菌、鐮刀菌、接合菌等引發(fā)的感染呈日漸增多趨勢[24]。早有報道阿薩希毛孢子菌、頭狀地霉菌、皮毛孢子菌以及皮瘤毛孢子標準株對于伊曲康唑、特比萘芬及兩性霉素B均不敏感[25]。也有報道稱毛孢子菌引起的感染對于臨床常見抗真菌藥物的反應均不是很好，應用兩性霉素B以及氟康唑治療失敗的事件時有報道[26]。而本試驗結果表明T.loubieri對兩性霉素B和氟康唑敏感，對伊曲康唑中度敏感。臨床上對毛孢子菌抗真菌藥物敏感性研究十分有限，不同種的毛孢子菌對抗真菌藥物的敏感性有一定的差異，如阿薩希毛孢子菌對兩性霉素B敏感，而皮膚毛孢子菌對其耐藥[27-28]。由于耐藥性的產(chǎn)生，大多數(shù)毛孢子菌感染人類和其他動物在臨床上的治療效果甚微。因此將毛孢子菌鑒定到種，對不同種的菌株進行體外藥敏試驗，對于臨床上選擇敏感藥物治療毛孢子菌感染具有重要的意義。

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