改善氧化/抗氧化應激平衡及NET和5-HTT表達與瑞波西汀抗抑郁作用有關

李 娜，王 涵，文 威，周岐新

(重慶醫(yī)科大學藥理學教研室，重慶 400016)

抑郁癥是一種以明顯持久的情緒低落或心境改變?yōu)橹饕卣鞯木裾系K。具有高發(fā)病率、高自殺率和高疾病負擔，已成為全球關注的疾病。然而，其確切發(fā)病機制至今未完全明了。近年來發(fā)現(xiàn)氧化應激和自由基增加在神經精神疾病發(fā)病過程中可能起著重要作用［1］。體內自由基誘導脂質過氧化反應生成丙二醛(melondialdehyde，MDA)，后者對機體組織細胞造成嚴重損傷。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)與過氧化氫酶(catalase，CAT)是腦內重要清除自由基的抗氧化酶類，能保護神經細胞免受自由基損傷。因此，機體氧化/抗氧化應激系統(tǒng)平衡可能涉及抑郁癥發(fā)生、發(fā)展和緩解的過程。目前臨床治療抑郁癥的藥物主要包括5-HT再攝取抑制劑、去甲腎上腺素再攝取抑制劑和三環(huán)類抗抑郁藥;它們的作用原理一般認為與抑制神經突觸前膜5-HT轉運體(5-HT transporter，5-HTT)和去甲腎上腺素轉運體(norepinephrine transporter，NET)，使突觸間隙內5-HT和NE水平升高有關。然而Jiang等［2］證明，5-HTT基因敲除小鼠顯示抑郁行為，這似乎與上述藥物抗抑郁原理相矛盾。為此，我們采用慢性輕度不可預見性刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)建立大鼠抑郁模型，研究了選擇性NE重攝取抑制劑瑞波西汀的給予對大鼠抑郁行為的影響及其與氧化/抗氧化應激平衡和腦橋NET和海馬5-HTT表達關系。希望對抑郁癥的發(fā)生機制和瑞波西汀的抗抑郁作用有新的認識和了解。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物清潔級♂Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，180～220 g，重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，醫(yī)學動物許可證號:SCXK(渝)2007-0001。

1.1.2主要試劑與儀器MDA測定試劑盒、SOD測定試劑盒、CAT測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，A003，A001，A007);甲磺酸瑞波西汀(重慶藥友制藥有限責任公司，原料藥，純度＞98%);PCR引物(上海鼎安生物技術有限公司);RNA store組織保存液、TRIzol總RNA提取試劑、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq PCR MasterMix試劑盒 (TIANGEN 公 司，J8414，DP405，KR104，KT201);PCR儀(PTC200型，Bio-rad公司)。

1.1.3藥物配制稱取適量甲磺酸瑞波西汀，以5 g·L-1CMC-Na溶液配制成0.1 g·L-1混懸液，4℃保存。

1.2方法

1.2.1分組與給藥♂ SD大鼠60只，自由攝食飲水，室溫(20±3)℃，正常光照節(jié)律為 8:00～20:00，安靜通風的實驗環(huán)境適應3 d后，采用openfield法篩選大鼠，選取水平活動得分30～120之間的大鼠，隨機分為4組，即正常對照組(NG)、模型組(MG)、瑞波西汀處理的模型組(RMG)和正常組(RNG)。每組15只，NG組和RNG組5只/籠，正常對照組大鼠自由攝食飲水，正常光照節(jié)律，MG組和RMG組采取孤養(yǎng)結合CUMS方式建模。每天上午刺激前1 h灌胃，瑞波西汀給予劑量為0.7 mg·kg-1·d-1，MG組和 NG組給予等體積5 g·L-1CMC-Na溶劑。

1.2.2孤養(yǎng)結合CUMS方式制備動物模型參照Willner等［3］方法并加以改進，建立實驗性抑郁動物模型。刺激方式包括禁食24 h，禁水24 h，通宵照明，間歇照明(光/暗周期為2h/2h，時間20:00～8:00)，潮濕墊料18h，傾斜鼠籠45°24 h，4℃冰水游泳5 min，45℃熱水浴5 min，夾尾1 min，水平震蕩3 min，共10種刺激，每天隨機安排給予1種刺激，每種出現(xiàn)2～3次，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，實驗周期為28 d。d 29，開場實驗。d 30，糖水消耗實驗。

1.2.3行為學檢查

1.2.3.1開場實驗(open-field)參照文獻［4］，使用自制100 cm×100 cm×40 cm木箱，底部平均分為4×4個方格，木箱內全部漆成黑色。保持環(huán)境安靜，將大鼠置于木箱中央，通過攝像系統(tǒng)和電腦視頻系統(tǒng)連接，在計算機上觀察大鼠5 min內的活動情況，記錄大鼠的水平得分(四爪均進入方格的穿越格數)、垂直得分(后肢直立次數)和理毛次數。

1.2.3.2糖水消耗實驗 參照文獻［3］，于建模完成前訓練大鼠試飲10 g·L-1蔗糖水24 h，隨后飲純水24 h，訓練期間正常進食。訓練結束開始實驗:禁食禁水24 h后大鼠單籠放置，同時給予蔗糖水和純水各1瓶。1 h后記錄蔗糖水消耗量和純水消耗量，并計算糖水偏好率(糖水消耗/總液體消耗×100%)。

1.2.4血清MDA含量和SOD、CAT活力測定建模完成后，每組取6只大鼠，斷頭取血，靜置30 min后3 000 r·min-1離心10 min，分離血清-80℃保存。MDA含量和SOD及CAT活力測定按試劑盒說明書規(guī)范進行。

1.2.5海馬病理形態(tài)學觀察造模結束，每組取3只大鼠40 g·L-1水合氯醛(400 mg·kg-1，ip)麻醉，仰臥固定，經左心室注入生理鹽水100 ml，剪碎肝臟作為血液和灌注液出口，再注入40 g·L-1多聚甲醛磷酸鹽緩沖液200 ml固定組織。取腦組織，剝離雙側海馬，40 g·L-1多聚甲醛浸泡過夜，腦組織冠狀切片，切片厚約4 μm，常規(guī)HE染色觀察海馬病理改變。

1.2.6腦橋NET和海馬5-HTT mRNA表達測定

1.2.6.1取材 造模結束，每組取3只大鼠40 g·L-1水合氯醛(400 mg·kg-1，ip)麻醉，斷頭取腦組織，分離腦橋和海馬，置于裝有RNA store組織保存液(每100 mg組織加入1 ml RNA store)的EP管，4℃過夜，移出液體，組織于-80℃保存。

1.2.6.2引物設計 由公司設計合成。引物序列及擴增片段大小見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence and product size of NET and 5-HTT gene

1.2.6.3RT-PCR檢測NET和5-HTT表達 以TRIzol法按試劑盒說明書提取腦橋和海馬樣本總RNA;取 1 μg總 RNA，用 TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒逆轉錄合成 cDNA，反應條件:42℃30min→ 99℃ 5 min→ 4℃ 5 min→ 短時離心后-20℃保存。PCR擴增分別采用NET、5-HTT和βactin引物，擴增條件:94℃ 5 min解鏈→94℃ 30 s變性→60℃ 30 s退火→72℃延伸1 min(擴增循環(huán)NET 33次，5-HTT 31次，β-actin 28次)72℃充分 延伸5min。取15 μl RT-PCR產物，經2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠數字掃描成像系統(tǒng)照相并測定條帶積分吸光度，以待檢基因條帶與內參條帶吸光度比值作為目的基因的相對表達量。

1.3統(tǒng)計學分析實驗數據用±s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用單因素方差分析。

2 結果

2.1瑞波西汀對CUMS致大鼠抑郁行為的影響

2.1.1開場實驗(open-field)CUMS致大鼠(MG組)活動的水平得分、垂直得分和理毛次數都明顯低于NG組，瑞波西汀預處理可逆轉這種改變，瑞波西汀預處理對未接受CUMS刺激的正常大鼠活動無影響(Tab 2)。

Tab 2 Results of the rat behaviors observed in the open-field test(±s，n=9～15)

Tab 2 Results of the rat behaviors observed in the open-field test(±s，n=9～15)

＊＊P＜0.01，*P＜0.05 vs corresponding value of NG;#P＜0.05，##P ＜0.01 vs corresponding value of MG.NG:normal group;MG:model group;RMG:reboxetine(0.7 mg·kg-1·d-1)-treated model group;RNG:reboxetine(0.7 mg·kg-1·d-1)-treated normal group.

Group Crossing Rearing Preening NG 68.5±23.3 20.1±10.4 5.3±2.8 MG 22.8±20.2＊＊ 6.9±5.9＊＊ 2.5±2.1*RMG 54.3±24.1## 15.2±7.2## 5.1±2.3#RNG 63.2±14.3 19.2±7.6 3.9±1.7

2.1.2糖水消耗實驗與正常對照組［(81.2±16.1)%］相比，模型組［(35.8±33.6)%］大鼠糖水偏好率下降(P＜0.01);瑞波西汀預處理的模型組［(62.2±17.4)%］大鼠糖水偏好率較模型組升高(P＜0.01);瑞波西汀預處理的正常組［(76.0±9.6)%］大鼠糖水偏好率與正常對照組無差異。結合開場實驗結果，說明瑞波西汀能明顯改善CUMS誘導的大鼠抑郁行為。

2.2瑞波西汀對大鼠血清MDA水平和SOD及CAT活力影響與NG組比，MG組大鼠血清MDA水平明顯升高(P＜0.01)，SOD、CAT活力下降(P＜0.01);瑞波西汀預處理能逆轉這種變化;瑞波西汀預處理對正常大鼠血清MDA水平以及SOD、CAT活力均無影響(Tab 3)。

Tab 3 Concentration of MDA and the activities of SOD and CAT in serum of rats(xˉ±s，n=6)

2.3瑞波西汀對海馬病理形態(tài)學變化的影響NG組大鼠海馬神經細胞呈圓形，結構清晰完整。與NG組相比，MG組海馬齒狀回、CA1、CA2和CA3區(qū)神經細胞均出現(xiàn)不同程度的核固縮和染色加深，細胞呈不規(guī)則多邊形或梭形，細胞數目明顯減少。瑞波西汀預處理明顯減輕CUMS引起的海馬神經細胞損傷，瑞波西汀預處理對正常大鼠海馬神經細胞形態(tài)無影響(Fig 1)。

Fig 1 Hippocampal histopathology(HE，×100 and ×400)

2.4瑞波西汀對腦橋NET與海馬5-HTT mRNA表達影響與NG組相比，MG組大鼠腦橋NET和海馬5-HTT mRNA表達均明顯降低(P＜0.01)。瑞波西汀預處理阻遏CUMS引起的大鼠NET與5-HTT mRNA表達(P＜0.01)降低，瑞波西汀預處理對正常大鼠NET與5-HTT mRNA表達無影響(Fig 2，Tab 4)。

Fig 2 Expressions of NET mRNA in pons cerebelli and 5-HTT mRNA in hippocampus of rats

Tab 4 Expressions of NET mRNA in pons cerebelli and 5-HTT mRNA in hippocampus of rats(±s，n=3)

Tab 4 Expressions of NET mRNA in pons cerebelli and 5-HTT mRNA in hippocampus of rats(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs corresponding value of NG;##P＜0.01 vs corresponding value of MG.NG:normal group;MG:model group;RMG:reboxetine(0.7 mg·kg-1·d-1)-treated model group;RNG:reboxetine(0.7 mg·kg-1·d-1)-treated normal group.

Group NET/β-actin 5-HTT/β-actin NG 1.37±0.09 0.44±0.01 MG 0.61±0.05＊＊ 0.26±0.01＊＊RMG 1.37±0.05## 0.52±0.05##RNG 1.34±0.08 0.48±0.04

3 討論

CUMS模擬抑郁癥的環(huán)境誘因，誘導實驗動物形成的抑郁癥核心癥狀能被經典的抗抑郁藥物改善。因此該模型常用于抑郁癥的病理生理機制和抗抑郁藥物作用機制的研究［5］。本研究采用 CUMS建立大鼠抑郁模型，觀察瑞波西汀干預對抑郁行為的影響與氧化/抗氧化應激平衡以及與特定情感活動密切相關腦區(qū)NET和5-HTT基因表達的關系。

本實驗結果顯示，CUMS致大鼠出現(xiàn)抑郁行為，同時顯示血MDA水平升高和SOD及CAT活性降低，海馬神經細胞出現(xiàn)明顯病理形態(tài)學損傷，提示抑郁癥大鼠體內出現(xiàn)氧化/抗氧化應激系統(tǒng)失衡，氧化應激的增強損傷了脆弱的海馬神經細胞。相當于臨床病人用量的瑞波西汀給予明顯改善CUMS所致大鼠抑郁癥狀，阻遏MDA升高和SOD及CAT活性降低，減輕了海馬神經細胞損傷。類似的氧化/抗氧化應激失衡可見于相關的臨床抑郁癥病例報道，但抗抑郁藥治療未觀察到氧化/抗氧化應激平衡的改變［6-7］。這種動物模型與臨床病人對抗抑郁藥反應的差異提示臨床抑郁癥病因的復雜性。陳紅霞等［8］也報道慢性應激可致海馬CA1、CA3和齒狀回神經元以及CA1區(qū)星形膠質細胞形狀改變和數目減少。

眾所周知，腦橋藍斑核NE和海馬5-HT神經元與情感障礙性疾病發(fā)病密切相關。因此，本課題研究了CUMS致抑郁大鼠腦橋NET和海馬5-HTT基因表達變化及NET抑制劑瑞波西汀給予的影響。結果顯示，CUMS誘導抑郁行為致大鼠腦橋NET和海馬5-HTT mRNA表達均明顯降低，瑞波西汀給予不僅逆轉了NET mRNA表達降低，也逆轉了海馬5-HTT mRNA低表達。結果提示，抑郁癥發(fā)生可能與NET和5-HTT基因呈低表達狀態(tài)有關，而經典的抗抑郁藥的治療作用機制可能并非完全在于抑制NE和5-HTT轉運體，而是提升其表達。本研究小組的另一實驗也顯示，5-HTT專一抑制劑帕羅西汀也對抑郁癥大鼠的NET和5-HTT基因表達均有明顯提升作用(未發(fā)表的資料)。上述研究結果增強了我們對經典抗抑郁藥的作用可能與提升NET和5-HTT基因表達有關的信念。

本研究結果還揭示，未經受CUMS刺激大鼠接受治療量(7 mg·kg-1·d-1)的瑞波西汀灌胃給予，其行為、體內氧化/抗氧化指標、NET和5-HTT基因表達均無明顯影響。提示瑞波西汀抗抑郁作用有針對性。但 Zhao 等［9］報道，瑞波西汀(20 mg·kg-1·d-1)給予，連續(xù)40 d，使腦橋藍斑核NET表達明顯降低，縫際核5-HTT表達明顯升高。此種差異可能與其實驗的劑量過大和時間過長有關。

總之，本研究結果提示瑞波西汀的抗抑郁作用除與普遍認可的特異性NE重涉取抑制有關外，至少涉及改善機體氧化/抗氧化應激平衡和提升NET及5-HTT基因表達有關。

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