卡托普利對MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化及Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的影響

劉鈺瑜，姚衛(wèi)民，徐道華，崔 燎

卡托普利(captopril，CPT)屬于血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶抑制藥，通過作用于腎素—血管緊張素—醛固酮(renin-angiotensin aldosterone system，RAAS)系統(tǒng)，阻斷血管緊張素Ⅱ的強(qiáng)烈縮血管作用而抗高血壓。RAAS在心血管疾病與骨質(zhì)疏松之間可能存在著相關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CPT具有抗骨質(zhì)疏松作用，可增加維甲酸性骨質(zhì)疏松小鼠股骨的骨鈣和骨羥脯氨酸的含量，對去卵巢大鼠的生物力學(xué)性能有改善作用，也有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用［1-2］，但目前關(guān)于ACEI能否用于骨質(zhì)疏松的防治尚無定論。本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，觀察CPT對成骨細(xì)胞樣細(xì)胞增殖、分化和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的作用，為探討CPT的防治骨質(zhì)疏松作用提供進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胰蛋白酶、MTT、前列腺素E2(Sigma公司);卡托普利標(biāo)準(zhǔn)品(ALEXIS公司);堿性磷酸酶檢測試劑盒(北京中生生物公司)、Access RT-PCR試劑盒(Invitrogen公司)。NAPCO二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(5420-1，Precision Scientific美國);XD-101倒置相差顯微鏡(江南光電股份有限公司);酶標(biāo)儀:Bio-ELX-800型，USA;9600Gen Amp PCR System(美國PE公司);DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，WD-9403C型紫外分析儀(北京六一儀器廠)。RT-PCR選用β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參照，引物由上海生物工程公司合成，序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence of COLL-Ⅰand β-actin

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定MC3T3-E1細(xì)胞的增殖 細(xì)胞以2×104/cm2的密度接種入96孔板，第一孔為空白調(diào)零。細(xì)胞接種24h后加入不同濃度的卡托普利，使終濃度分別是:10-12、10-11、10-10mol·L-1;陽性對照組用前列腺素E2(終濃度是10-7mol·L-1);同時以溶劑作為對照組。于加藥后12、24、36 h進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加20 μl的MTT(5 g·L-1)，繼續(xù)在37℃，5%CO2條件下孵育4 h，吸取培養(yǎng)液后加二甲基亞砜0.15 ml，振搖至結(jié)晶完全溶解，于酶標(biāo)儀檢測其吸光度，檢測波長570 nm，參考波長630 nm。

1.2.2 PNPP法測定MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性 細(xì)胞接種24 h后加藥，加藥方法同前。于藥物作用d 3、d 5、d 7測定細(xì)胞堿性磷酸酶含量。測定時，去掉培養(yǎng)液，PBS沖洗，然后加入堿性磷酸酶檢測試劑盒中新鮮配制的底物100 μl，37℃放置0.5 h，然后用0.1 mol·L-1的 NaOH 100 μl終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀于405 nm波長下測定OD值。樣品OD值在ALP標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取酶活性值(U·L-1)。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá) 細(xì)胞按2×104·cm-2接種于6孔板，24 h后加入不同濃度的藥物，卡托普利的終濃度為 10-13、10-12、10-11、10-10mol·L-1，前列腺素E2的終濃度是10-7mol·L-1。培養(yǎng)7 d后，按照TRIzol試劑盒說明進(jìn)行總RNA的抽提。反應(yīng)條件為50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，54℃退火 30 s，70℃延伸 45 s，35 個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察并拍照。以Bandscan程序?qū)D片行總灰度掃描，與對應(yīng)的β-actin的電泳帶總灰度的比值為半定量結(jié)果(相對值)。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以±s表示。SPSS11.0軟件行方差分析并進(jìn)行Bonferroni組間比較。

2 結(jié)果

2.1 卡托普利對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響 用不含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時間的延長，各組細(xì)胞數(shù)目逐漸下降。與對照組相比，在24 h，卡托普利10-12和10-11mol·L-12個濃度可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在36 h，卡托普利10-12和10-11mol·L-1濃度仍可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但作用不如24 h明顯。與對照組相比，前列腺素E2在用藥后36 h對細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用。見Tab 2。

Tab 2 Effects of captopril on cell growth in MC3T3-E1 cells(±s，n=8)

Tab 2 Effects of captopril on cell growth in MC3T3-E1 cells(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Group 12 h 24 h 36 h Control 0.197±0.023 0.130±0.008 0.116±0.017 PGE210-7mol·L-1 0.218±0.017 0.159±0.009 0.169±0.015＊＊Captopril 10-12mol·L-1 0.196±0.016 0.171±0.013＊＊ 0.148±0.014*Captopril 10-11mol·L-1 0.220±0.018 0.201±0.018＊＊ 0.172±0.019＊＊Captopril 10-10mol·L-10.201±0.015 0.161±0.019 0.128±0.019

2.2 卡托普利對 MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性的影響 用含1%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，各組細(xì)胞ALP含量逐漸增高，在d 5時達(dá)最高值，隨后下降。與對照組相比，卡托普利在d 3和d 5能提高細(xì)胞堿性磷酸酶活性。在d 3，卡托普利10-11和10-10mol·L-1兩個濃度可提高細(xì)胞堿性磷酸酶活性。在d 5，卡托普利10-11mol·L-1濃度仍可提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性，但作用不如3 d時明顯。與對照組相比，前列腺素E2在d 3至d 5對細(xì)胞堿性磷酸酶活性均有明顯的提高作用，見Tab 3。

2.3 卡托普利對MC3T3-E1細(xì)胞Ⅰ型膠原(Type I Collagen，COLL-Ⅰ)基因表達(dá)水平的影響 與對照組相比，加藥后7 d，10-7mol·L-1前列腺素和10-12mol·L-1～10-10mol·L-1濃度的卡托普利可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞表達(dá)COLL-Ⅰ，其中10-11mol·L-1濃度的卡托普利有較強(qiáng)的促進(jìn)COLL-Ⅰ表達(dá)的作用，但是該作用較陽性藥物前列腺素弱，見Fig 1。

Tab 3 Effects of captopril on the ALP activities(U·L－1)in MC3T3-E1 cells(±s，n=8)

Tab 3 Effects of captopril on the ALP activities(U·L－1)in MC3T3-E1 cells(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control

Group 3 d 5 d 7 d Control 234.7±36.2 272.0±30.6 145.9±6.3 PGE210-7mol·L-1 440.4±61.2＊＊ 677.8±142.0＊＊ 620.0±250.1＊＊Captopril 10-12mol·L-1 264.8±57.6 326.3±113.0 190.9±29.8 Captopril 10-11mol·L-1 383.0±72.3＊＊ 427.4±72.6＊＊ 197.7±23.6 Captopril 10-10mol·L-1 358.2±36.5＊＊401.3±89.4 195.4±34.7

Fig 1 Effects of captopril on the COLL-ⅠmRNA expression in MC3T3-E1 cells

3 討論

目前研究表明高血壓與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，很多心血管疾病的患者，往往同時伴有骨質(zhì)疏松，所以我們在使用心血管系統(tǒng)藥物治療這些人群心血管疾病的同時，須注意到藥物對骨量的影響。在臨床用藥中也發(fā)現(xiàn)很多作用于心血管系統(tǒng)的藥物有改變骨量的作用，并影響到病人骨折的發(fā)生率。RAAS在心血管疾病與骨質(zhì)疏松之間可能存在著相關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制。在轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)看到，表達(dá)人類腎素基因的小鼠腎素高表達(dá)后，小鼠血壓正常，但是由于RAAS的激活，導(dǎo)致骨量減少，所以認(rèn)為該系統(tǒng)對骨骼系統(tǒng)的影響，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生甚至可不依賴于高血壓的發(fā)生而獨(dú)立出現(xiàn)［3］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都可以合成和表達(dá)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、血管緊張素受體等RAAS的各組分［4］，雖然骨骼系統(tǒng)局部的RAAS對骨量的影響還沒有完全闡明［5］，但體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)血管緊張素Ⅱ可以抑制成骨細(xì)胞的分化和骨形成［6］。目前一般認(rèn)為RAAS可調(diào)節(jié)骨吸收，血管緊張素Ⅰ和血管緊張素Ⅱ被認(rèn)為是強(qiáng)烈的骨吸收促進(jìn)劑，一些血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制藥通過減少血管緊張素Ⅱ的生成減少骨吸收，而且體外實(shí)驗(yàn)研究表明這類藥物抑制骨吸收的作用并不是直接地抑制破骨細(xì)胞，而是通過作用于成骨細(xì)胞，從而發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞作用的［7］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制藥卡托普利(5 mg·kg-1·d-1)能改善老年去卵巢大鼠的生物力學(xué)性能［1］，卡托普利(6.25 mg·kg-1·d-1)可增加維甲酸性骨質(zhì)疏松小鼠股骨的骨鈣和骨羥脯氨酸的含量［2］。為進(jìn)一步探討卡托普利的促成骨作用，本實(shí)驗(yàn)觀察卡托普利對成骨樣細(xì)胞的作用，并與陽性藥物前列腺素E2進(jìn)行比較。成骨細(xì)胞(osteoblast)是骨形成過程中最重要的功能細(xì)胞，它不僅分泌骨基質(zhì)參與成骨，同時也參與破骨細(xì)胞骨吸收功能的調(diào)節(jié)，因此在骨代謝過程中起著極為重要的作用。結(jié)果顯示前列腺素E2可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，前列腺素E2是一個已被公認(rèn)的促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的工具藥［8］，可通過激活蛋白酶 C，促進(jìn) DNA合成［9］?？ㄍ衅绽蓄愃魄傲邢偎谽2的促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的作用，成骨細(xì)胞數(shù)量的不斷增加可以產(chǎn)生豐富的膠原，從而通過鈣化基質(zhì)的形成產(chǎn)生更多的骨組織?？ㄍ衅绽碳ぜ?xì)胞增殖外，還可促進(jìn)堿性磷酸酶的表達(dá)。堿性磷酸酶的表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的主要特征之一，是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志，其活性的高低可反映成骨細(xì)胞的成熟狀況，還在新骨形成中發(fā)揮著鈣結(jié)合蛋白的作用。卡托普利可促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶，說明其有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用。前列腺素E2也有很強(qiáng)的促進(jìn)堿性磷酸酶表達(dá)的作用。有研究表明低濃度的前列腺素E2可通過促進(jìn)cAMP的合成提高ALP的活性［10］。卡托普利對成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原基因的表達(dá)有促進(jìn)作用，Ⅰ型膠原蛋白是成骨細(xì)胞分化的特征之一，是構(gòu)成骨骼有機(jī)基質(zhì)的主要成分，占骨有機(jī)基質(zhì)90%以上，Ⅰ型膠原在成骨細(xì)胞增殖早期已經(jīng)開始表達(dá)，并隨著基質(zhì)成熟而逐漸增加，其表達(dá)與骨形成活性密切相關(guān)。在礦化期大量形成的Ⅰ型膠原可作為羥基磷灰石結(jié)晶的異質(zhì)晶核，在生物礦化中起一定作用，從而維持骨組織的完整和強(qiáng)度。有研究表明前列腺素E2對膠原合成有促進(jìn)作用［11］，本實(shí)驗(yàn)用前列腺素E2作為陽性藥也證實(shí)了這點(diǎn)，同時提示卡托普利對Ⅰ型膠原基因表達(dá)也有促進(jìn)作用，但比前列腺素E2弱。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)卡托普利有促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞增殖、分化和促進(jìn)Ⅰ型膠原基因表達(dá)，為卡托普利用于骨質(zhì)疏松的防治提供體外實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

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