肝郁脾虛證大鼠海馬Notch信號通路改變及逍遙散的調(diào)節(jié)作用＊

劉玥蕓，趙 歆，張 曼，閆秋瑩，姜幼明，岳利峰，陳家旭＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院 北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學研究生院 北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院 北京 100700）

慢性應激是抑郁、焦慮等情緒障礙的主要致病或誘發(fā)因素，本課題組在既往研究中，成功的運用慢性束縛應激方式建立了中醫(yī)肝郁脾虛證大鼠模型，并結合中藥逍遙散對其進行了系統(tǒng)的機制研究[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)抑郁、焦慮等疾病能明顯引起海馬神經(jīng)元再生障礙的發(fā)生，表明慢性應激在直接損傷海馬神經(jīng)元的同時還可能引起海馬神經(jīng)元修復障礙，故神經(jīng)細胞再生可做為抑郁癥及抗抑郁藥的最終作用靶點[4-8]，但其中涉及的信號傳導通路有哪些，尚不明了。而Notch信號系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關，主要作用是調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）的增殖、促神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化和學習記憶功能，可以作為一個良好的切入點。

綜上，能導致中醫(yī)肝郁脾虛證的慢性應激，通過不同的途徑可以引起海馬神經(jīng)元損傷及再生障礙，而Notch信號通路是其中重要的一種，本實驗選擇Notch信號通路作為切入點，研究其在肝郁脾虛證模型大鼠海馬中的變化，以期找到此通路的調(diào)節(jié)機制及中藥逍遙散的干預作用，豐富證候生物學基礎研究領域中的內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

圖1 大鼠束縛造模

Sprague-Dawley(SD）成年雄性健康大鼠，清潔級，體質(zhì)量180-200 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物實驗室（SPF級動物實驗室），光照節(jié)律12L：12D（7：00-19：00），室溫22 ± 2℃，相對濕度保持在30%-40%，喂常規(guī)顆粒飼料及飲用水。適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 實驗藥物

1.2.1 中藥

按照《太平惠民和劑局方》原方比例購買柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓、炙甘草、薄荷、生姜共4200 g。以上藥材均購于北京同仁堂（毫州）飲片有限責任公司提供，根據(jù)《北京市中藥炮制規(guī)范》，按原書配伍比例由中日友好醫(yī)院中藥制劑室煎煮、濃縮制成藥粉810 g備用，使用時用去離子水溶解配制成混懸液，按大鼠用藥量進行換算使用。

1.2.2 西藥

鹽酸氟西汀膠囊（生產(chǎn)廠：Patheon France；分包裝廠：禮來蘇州制藥有限公司；批號：0955A）作為西藥的陽性對照，規(guī)格20 mg·粒-1（成人用藥量為20 mg·d-1），給藥時按大鼠用藥量進行換算。

1.3 主要試劑和儀器

1.3.1 主要試劑

多聚甲醛（北京鼎國昌盛生物有限公司），無水乙醇（分析純）（北京化學試劑公司），二甲苯（分析純）（北京化學試劑公司），焦油紫（sigma），苯酚（北京化學試劑公司），中性樹膠（北京國藥集團），Rabbit anti-NICD（abcam），Rabbit anti-Hes5（abcam），Rabbit anti-Hes1（Epitomics），Rabbit anti-Jag1（Epitomics），β-actin（Epitomics），山羊抗兔IgG（HRP）（北京康為世紀生物技術有限公司），組織蛋白抽提試劑盒（Pierce），BCA蛋白定量試劑盒（Pierce），BSA（sigma），蛋白 maker（Fermentas），ECL化學發(fā)光試劑盒（Pierce），Tris-Glycine SDS（北京康為世紀生物技術有限公司），Tris-Glycine（北京康為世紀生物技術有限公司），TBS（北京康為世紀生物技術有限公司），SDS-Page凝膠制備試劑盒（北京康為世紀生物技術有限公司），SDS-Page Loading Buffer（北京康為世紀生物技術有限公司），總RNA提取試劑盒（Qiagen），cDNA反轉錄試劑盒（Fermentas），SYBR Green PCR Master Mix（ABI），瓊脂糖（sigma），GoldStar Taq DNA Polymerase（康為世紀），100bp-1000bp DNA Ladder（康為世紀），5×RNA Loading Buffer（康為世紀）。

1.3.2 主要儀器設備

全自動組織脫水機（Leica ASP300S），全自動石蠟包埋機（Leica EG1150H），輪轉式石蠟切片機（Leica RM2245），電熱恒溫干燥箱（Leica），防脫載玻片（世泰），光學顯微鏡（Nikon E200 Nikon），數(shù)碼相機（Nikon 4500 Nikon），Imagepro Plus5.0（Media Cybernetics），脫色搖床TS-1型（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司），Western電泳印跡系統(tǒng)（Biometra），微量加樣搶（Eppendorf），凝膠成像系統(tǒng)（KODAK），PVDF膜（MilliPor），普通PCR儀（Eppendorf），DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司），凝膠電泳系統(tǒng)（Biometra），Real-time qPCR 儀（ABI），紫外分光光度儀（UNIC）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組

48只大鼠適應性飼養(yǎng)1周，根據(jù)體質(zhì)量將大鼠隨機分為4組，每組12只，即正常組對照（Control Group）、模型組（Model Group）、模型+逍遙散組（Model+XYS Group），模型+氟西汀組（Model+Fluoxetine Group）。群籠飼養(yǎng)，4只·籠-1。

1.4.2 模型制備

除正常組以外的各組大鼠均用束縛架進行捆綁束縛造模，3 h·d-1，時間隨機，連續(xù)21天。正常組不予束縛，但在其他組進行束縛的時間內(nèi)禁食水。大鼠束縛架為木質(zhì)結構，底座寬10 cm、長20 cm、厚1 cm。上面束縛臺長22 cm，寬6.6 cm，前端有小架可固定大鼠頭部，束縛臺兩側分別為兩條可調(diào)節(jié)的粘貼軟帶，用于束縛大鼠的胸部和腹部（圖1）。

1.4.3 給藥

造模開始后同時灌胃給藥（每次束縛前30 min），1次·d-1，給藥體積為1 mL·100g-1體質(zhì)量，人體用藥量換算成大鼠等效劑量，給藥量為逍遙散2.11 g·kg-1體質(zhì)量，氟西汀2 mg·kg-1體質(zhì)量，模型組及正常組給予等體積去離子水。

1.4.4 取材

常規(guī)用10%水合氯醛麻醉大鼠，其中6只給予生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注進行前固定后，鍘刀斷頭，冰上取腦，再立即置4℃的4%多聚甲醛，固定72小時后，取材做石蠟包埋；另外6只麻醉后直接冰上取腦，迅速剝離雙側海馬，分成2份置于凍存管中，投入液氮，后移至-80℃冰箱中保存，分別備用于蛋白質(zhì)的提取和總RNA的提取。

1.4.5 尼氏染色

（1）尼氏染液的配制：

取4 g苯酚加入80 mL純水中配成苯酚水溶液，取焦油紫1 g加入苯酚水溶液中，再加入95%乙醇20 mL，混合配制成100 mL焦油紫原液。用時取適量，再用20%乙醇稀釋20倍，即尼氏染色液。

（2）石蠟切片制備：

①沖洗：從多聚甲醛中取出腦組織，在雙蒸水下沖洗1 min；②脫水與透明：將鼠腦組織沿囟門，切出約4 mm厚的冠狀切片進行脫水與透明。脫水順序依次為：70%乙醇20 min，80%乙醇20 min，90%乙醇20 min，95%乙醇20 min，無水乙醇15 min，二甲苯20 min，二甲苯20分鐘；③浸蠟：設置自動脫水浸蠟機的溫度為58℃， 浸蠟時間設置依次為：蠟Ⅰ30 min，蠟Ⅱ30 min，蠟III30 min；④包埋：在全自動石蠟包埋機中進行，將石蠟倒入包埋器中進行預熔，后將組織塊放入完全沒住，將包埋塊放置一旁冷卻；⑤切片：將包埋塊稍作修整，置于輪轉式切片機上進行切片，切片刀角度設置為7°，切片厚度設置為7 μm，進行切片；⑥展片與貼片：將切好的蠟帶用毛筆挑起，放入溫度為42℃的展片鍋內(nèi)（加入雙蒸水預熱）展平組織切片。將防脫載玻片以45度角伸入水內(nèi)，輕輕挑起組織切片，使其貼在載玻片外1/3處；⑦烤片：將載玻片置于烘箱中50℃烘干。

（3）尼氏染色

①烤片：烤箱設置為70℃，載玻片置于內(nèi)烤30 min；②脫蠟：取出載玻片，順序經(jīng)過二甲苯I15 min、二甲苯Ⅱ20 min；③水化：載玻片順序經(jīng)過無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各5 min，再用入雙蒸水中3 min進行水化；④染色：將載玻片放入尼氏染色液中，置于37℃溫箱中約8 min。取出，蒸餾水沖洗1 min；⑤分化：將載玻片置于在95%乙醇中，快速分化60 s；⑥脫水透明：常規(guī)脫水透明，載玻片順序經(jīng)過無水乙醇I、無水乙醇Ⅱ各1 min，二甲苯I、二甲苯Ⅱ各 3 min；⑦封片：將中性樹膠一小滴滴于蓋玻片上，45°角緩慢與載玻片粘合，注意不要產(chǎn)生氣泡，封住標本，晾干，準備光鏡下觀察。

1.4.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）

（1）總蛋白的提?。?/p>

將海馬組織取出解凍，加入組織蛋白抽提試劑盒抽提試劑進行裂解，手持電動勻漿器勻漿，冰上放置30 min，后4℃、12000 r·min-1離心15 min，所得上清液即為總蛋白。

（2）蛋白定量：

采用BCA法蛋白定量，按照試劑盒說明操作，然后用酶標儀進行A562測定，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。

（3）蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠電泳

①首先按照SDS-Page凝膠制備試劑盒說明制備相應的蛋白電泳凝膠；②加樣：樣本蛋白與5×樣品緩沖液以4∶l體積混勻，樣本蛋白含量50 μg·孔-1，保證各孔上樣蛋白含量相同;第一孔加入標記Marker 5 μl。樣本混勻，95℃水浴5 min，冷卻后依順序到樣品上樣孔中；③電泳：濃縮膠電泳電壓設置為80 V；觀測到溴酚藍進入分離膠后，提高電壓到120 V，穩(wěn)定電壓繼續(xù)電泳90 min，直到溴酚藍到達分離膠底部；④濕法轉膜：結束電泳后，將膠和PVDF膜夾好放入電轉系統(tǒng)中，以120 mA轉移90 min；⑤封閉、洗脫：將脫脂奶粉加入TBST溶液中成配置成5%溶液，室溫搖2 h，然后用TBST洗5 min×3次；⑥結合一抗：將PVDF膜置于雜交袋內(nèi)，以每1 cm PVDF膜加入0.1 mL一抗為量（一抗?jié)舛葹镹ICD：1∶200，Hes1：1∶400，Hes5：1∶400，Jad：1∶1000，β-actin：1∶2000），封閉雜交袋，4℃搖床過夜；⑦孵育二抗：棄去雜交液，TBS洗膜3次，每次10 min。每1 cm PVDF膜加入0.1 ml二抗為量（二抗?jié)舛葹?∶4000），封閉雜交袋，室溫下?lián)u床搖動孵育1小時；⑧顯影：TBST洗膜3次，每次10 min；吸干多余的TBST，用ECL發(fā)光液顯影。

（4）實驗結果圖像分析

以β-actin作為內(nèi)參照，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用圖像處理軟件分析各蛋白條帶的灰度值，將內(nèi)參灰度值與各組待測蛋白的灰度值作比較，獲得待測蛋白的相對灰度比值。

表1 PCR引物序列表

1.4.7 實時熒光定量PCR（Real time qPCR）

（1）總RNA的提取

取約100 mg組織置于RNA提取試劑盒所提供的試管中，用手持電動勻漿器進行勻漿，按照試劑盒說明添加試劑提取總RNA，將提取出的總RNA儲存于-80℃冰箱中備用。

（2）RNA濃度與純度檢測

吸取1 μL總RNA加無RNA酶水至20 μL，用紫外分光光度計分別測定A260、A280值，以無RNA酶水調(diào)零。A260和A28O的比值能反映RNA中蛋白質(zhì)等有機物污染程度，當A260/A280在1.8-2.0之間表明RNA質(zhì)量較好，無污染或降解，故我們將A260和A28O比值在1.8-2.0之間RNA樣品用于后續(xù)實驗，比值低于1.5或高于2.2者棄去。根據(jù)A260的值計算RNA濃度：A260x稀釋倍數(shù)x40/1000.

（3）實時熒光定量PCR反應

①引物合成，本實驗使用華大基因公司設計合成的引物，序列如下（表1）；②逆轉錄，cDNA第一鏈合成采用Fermentas公司的逆轉錄試劑盒操作方法進行，放入普通PCR儀進行逆轉錄，溫度為42℃60 min，70℃5 min。產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

③ 實時熒光定量PCR，反應體系：5×SYBR Green I PCR buffer 5 μl，上、下游引物（10 pmol·μL-1）各1 μL，dNTP（10 mM）1 μL，Taq 酶（3U·μL-1）1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 10 μL，總體積25 μL。

反應條件：

NICD：95℃ 10 min，35個 PCR 循環(huán)（95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

Jag1：95℃ 10 min，35個PCR 循環(huán)（95℃ 30 s、58℃30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

Hes1：95℃ 10 min，35 個 PCR 循環(huán)（95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

Hes5：95℃ 10 min，35 個 PCR 循環(huán)（95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

β-actin：95℃ 10 min，35個PCR 循環(huán)（95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

（4）實驗結果分析

通過熔解曲線分析定量PCR質(zhì)量。樣品的目的基因和管家基因β-actin分別進行RT-qPCR反應。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

1.5 統(tǒng)計學方法

運用SPSS21.0軟件，對數(shù)據(jù)做正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，兩項均符合，采用單因素方差分析（One-Way，ANOVA）進行統(tǒng)計計算。若數(shù)據(jù)不正態(tài)或方差不齊，則采用K個獨立樣本的非參數(shù)檢驗逐項統(tǒng)計。

2 結果

2.1 尼氏染色

2.1.1 尼氏染色形態(tài)觀察

尼氏染色顯示正常組大鼠海馬CA1、CA3、齒狀回區(qū)可見錐體細胞、顆粒細胞，數(shù)量多，排列緊密，神經(jīng)元細胞核呈橢圓形、圓形，染成淡紫，細胞核仁能清晰可見，胞漿透明，細胞形態(tài)正常，尼氏小體染色后呈塊狀（形如虎斑）或顆粒狀，在正常組中尼氏小體豐富、分布正常。模型組大鼠海馬CA1、CA3、齒狀回錐體細胞、顆粒細胞排列散亂，形態(tài)不規(guī)則，部分細胞核輪廓模糊、界限不清，胞漿中尼氏小體減少；逍遙散和氟西汀組大鼠海馬錐體細胞和顆粒細胞仍很豐富，神經(jīng)元細胞核輪廓尚清楚，胞漿尼氏小體有所減少，但神經(jīng)元在形態(tài)改變上較模型組為輕（圖2）。

2.1.2 尼氏小體計數(shù)

與正常組相比，模型組尼氏小體數(shù)明顯減少（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組的的尼氏體都顯著增多（P＜0.01），提示給藥后能不同程度的減輕尼氏小體在海馬中的丟失情況，改善神經(jīng)元細胞的狀態(tài)（圖3）。

2.2 蛋白免疫印跡

與正常組相比，模型組Notch信號通路相關蛋白表達均顯著降低（P＜ 0.01），給藥組的NICD、Hes1、Hes5蛋白也顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，給藥組的NICD、Hes5、Jag1蛋白表達均上升（P＜0.05或P＜0.01），Hes1蛋白表達中，只有氟西汀組與模型組有顯著差異（P＜ 0.05）（圖4（a-d））。

圖2 尼氏染色

2.3 實時熒光定量PCR

圖3 尼氏小體計數(shù)

與正常組相比，模型組各基因mRNA表達量均降低（P＜0.01），給藥組只有NICD mRNA表達量都降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01），Hes1、Hes5無明顯差異，Jad1只有逍遙散組降低明顯（P＜0.05），而氟西汀組已經(jīng)被逆轉。與模型組相比，給藥組的NICD、Hes1、Hes5 mRNA表達均有顯著上升（P＜0.05，P＜0.01），Jag1只有氟西汀組顯著上升（P＜0.01），逍遙散組無顯著差異（圖5（a-d））。

3 討論

圖4 Notch通路各蛋白western bolt結果

圖5 Notch通路各分子基因表達情況

尼氏體主要由平行排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體組成，主要功能是合成蛋白質(zhì)，作為神經(jīng)活動時所需，如細胞中的某些成分的更新以及產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)有關的蛋白質(zhì)和酶類。軸突端的蛋白質(zhì)大都來自胞體的尼氏體。神經(jīng)元在興奮傳導過程中，不斷消耗某些蛋白質(zhì)物質(zhì)，尼氏體可合成新的蛋白質(zhì)以補充這種消耗。一旦尼氏體丟失，就會通過不同途徑引起神經(jīng)細胞結構和功能失調(diào)。以前的大量研究已經(jīng)證明，慢性應激會引起腦結構和功能的改變，特別是海馬區(qū)神經(jīng)元丟失，樹突減少，突觸終端結構改變和神經(jīng)元再生抑制等[9]，我們的研究結果與此一致。海馬神經(jīng)元形態(tài)的改變和尼氏體的丟失說明慢性束縛應激所致肝郁脾虛證大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)確實受到了影響。模型組尼氏小體明顯丟失，顯示了在慢性應激過程中海馬神經(jīng)元產(chǎn)生了損傷和凋亡，相應的神經(jīng)細胞合成蛋白質(zhì)的功能也會受到影響。而經(jīng)過中藥逍遙散和西藥氟西汀干預過后，尼氏小體丟失的情況得到了明顯改善，提示這幾種藥物能使神經(jīng)元趨向于修復。

Notch信號系統(tǒng)有很強的分化抑制活性，在成年腦組織主要發(fā)揮促進神經(jīng)干細胞增殖的作用。本研究結果顯示，大鼠束縛應激造模后，其海馬Notch通路的功能呈下調(diào)趨勢；藥物干預后，各給藥組大鼠海馬Notch通路各因子（NICD、Hes5、Jag1）蛋白表達顯著上升。NICD是Notch通路的胞內(nèi)活性片段，代表信號系統(tǒng)的激活，該因子的表達增加強有力地提示通路功能的上調(diào)。Hesl、Hes5作為Notch信號途徑的靶基因，較之其他因子（如Hes3），與維持神經(jīng)干細胞在未分化狀態(tài)的聯(lián)系更為緊密。并且發(fā)現(xiàn)在哺乳動物大腦發(fā)育中Hes5可以作為特定標記物來區(qū)分神經(jīng)干細胞與其他祖細胞[10]。因而，Hesl和Hes5的表達增加，與促進神經(jīng)干細胞增殖有密切關系。Jagl可通過作用于Notch受體和其下游效應器（信號分子Shh等）來促進神經(jīng)干細胞的生存[11]。Shh是一種分泌蛋白，具有促進有絲分裂的功能，Jagl可誘導其的長期表達。Shh缺失的大鼠，海馬齒狀回的細胞增殖和神經(jīng)發(fā)生嚴重抑制[12]。Jagl的表達增加，可能通過Shh發(fā)揮其促進海馬神經(jīng)干細胞增殖的作用。以上Notch信號通路各因子對神經(jīng)干細胞的促增殖特性，與本實驗中逍遙散提取物干預后Notch系統(tǒng)因子表達的增加，提示該通路可能與逍遙散改善抑郁大鼠海馬的神經(jīng)再生有關，繼而緩解大鼠肝郁脾虛癥狀。

對照本實驗western blot與RT qPCR的結果可以發(fā)現(xiàn)，XYS干預下的Jag1基因并未明顯上調(diào)，但其相對應的蛋白表達卻明顯上調(diào)；相反的在XYS干預下Hes1基因出現(xiàn)了明顯上調(diào)，但其相應的蛋白表達卻沒有上調(diào)。推測可能有以下幾個原因：①基因與蛋白表達情況相反指出逍遙散在Notch信號通路上的作用靶點可能存在于直接上調(diào)Jag1蛋白中，及阻斷已經(jīng)上調(diào)了的Hes1基因的下游信號轉導中。即基因上調(diào)或下調(diào)的信號在傳遞過程中被干擾，從而直接引起蛋白合成與基因情況不符；②提示逍遙散抗抑郁的機制與氟西汀不同；③不排除基因表達不穩(wěn)定以及調(diào)控滯后的可能性。