Hedgehog信號(hào)通路與多發(fā)性骨髓瘤耐藥性的評(píng)述*

劉志強(qiáng)，柳 靜

1 HH信號(hào)通路的組成和活化機(jī)制

在哺乳動(dòng)物中，HH信號(hào)通路的核心元件是包括3個(gè)配體 sonic hedgehog（SHH）、desert hedgehog（DHH）和Indian hedgehog（IHH）、1個(gè)12次跨膜的膜受體Patched1（PTCH1）、1個(gè)像G蛋白耦聯(lián)受體的7次跨膜蛋白smoothened（SMO）和3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子glioma-associated oncogene homolog 1（GLI1）、glioma-associated oncogene homolog 2（GLI2）和 glioma-associated oncogene homolog 3（GLI3）[1]。

纖毛是細(xì)胞膜上的突出結(jié)構(gòu)，由微管支撐，HH信號(hào)通路的主要元件皆與它密切相關(guān)。它為這些信號(hào)通路中的分子提供了特定的區(qū)域，對(duì)其分布和功能極其關(guān)鍵。纖毛可能還有其他的作用，其中信號(hào)通路各分子的濃度可以調(diào)控對(duì)信號(hào)的反應(yīng)，而纖毛細(xì)胞器本身也具有特殊的固有調(diào)節(jié)。例如，最近有研究表明，纖毛中有一個(gè)脂質(zhì)膜成分對(duì)纖毛的功能和HH信號(hào)通路十分重要[2]。

當(dāng)沒(méi)有HH配體時(shí)，PTCH1定位在纖毛上，對(duì)纖毛上積累的SMO起抑制作用，這是哺乳動(dòng)物激活信號(hào)通路不可避免的一步。PTCH1在纖毛上發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，一個(gè)強(qiáng)有力的證據(jù)就是PTCH1可以抑制SMO的活性，其對(duì)SMO的抑制作用是通過(guò)纖毛上PTCH胞內(nèi)不同長(zhǎng)度截短的尾巴調(diào)整其強(qiáng)度[3]。當(dāng)與HH配體結(jié)合時(shí)，PTCH1離開纖毛，從而解除了對(duì)SMO的抑制作用，允許SMO易位到纖毛中。對(duì)于纖毛上PTCH1的離開和SMO的進(jìn)入之間的關(guān)系以及信號(hào)通路的激活至今仍是一個(gè)謎。在進(jìn)入纖毛之前，SMO與Discs Large Homolog 5（DLG5）在基底部結(jié)合，這一步對(duì)隨后信號(hào)通路的激活十分重要[4]。在纖毛中，SMO與Ellis-van Creveld syndrome protein（EVC）和EVC2形成復(fù)合體傳導(dǎo)HH信號(hào)[5]。SMO的激活觸發(fā)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄因子GLI在纖毛的轉(zhuǎn)運(yùn)及加工處理，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性[6]。

哺乳動(dòng)物的3個(gè)GLI蛋白含有共同的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括5個(gè)串聯(lián)的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)和一個(gè)C端激活結(jié)構(gòu)域，只有GLI2和GLI3包含N端阻遏物結(jié)構(gòu)域[7]。GLI1編碼一個(gè)前饋通路的激活因子用于對(duì)通路激活作出響應(yīng)，Gli1的轉(zhuǎn)錄完全取決于HH信號(hào)通路的激活[8]。GLI2和GLI3可形成全長(zhǎng)的激活因子或截短的抑制形式[9]。GLI的直接功能是決定細(xì)胞的命運(yùn)，是組織形態(tài)的控制、細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活調(diào)節(jié)器，HH信號(hào)通路的不同元件也在正/負(fù)反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[8]。

大量的研究發(fā)現(xiàn)HH信號(hào)通路中與GLI調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物GLI蛋白的兩個(gè)核心調(diào)控蛋白是 suppressor of fused（SUFU）和 kin-esin family member 7（KIF7）。在細(xì)胞質(zhì)中，SUFU通過(guò)對(duì)三個(gè)GLI蛋白的阻滯從而對(duì)哺乳動(dòng)物HH信號(hào)通路起負(fù)調(diào)控作用，在核內(nèi)SUFU也能與GLI2反應(yīng)抑制GLI2的活性[10]。KIF7是一種驅(qū)動(dòng)蛋白，在纖毛的順行性傳輸（從基部到頂端）中起作用[11]。在從基部到頂端過(guò)程中有一系列激酶調(diào)控GLI的磷酸化，包括protein kinase A（PKA）、casein kinase I（CK1）、glycogen synthase kinase 3β（GSK3β）12。GLI2和 GLI3被PKA、CK1、GSK3β磷酸化，然后被蛋白酶體加工處理形成各自的阻遏形式GLI2R和GLI3R[12]。在這種情況下，定位于纖毛基部的G蛋白偶聯(lián)受體GPR161上調(diào)cAMP，激活了PKA活性[13]。一旦信號(hào)活化，KIF移動(dòng)到纖毛的頂部促進(jìn)GLI2和GLI3的激活，抵制SUFU的活性，cAMP的水平因GPR161離開纖毛和PDE4的降解作用而下調(diào)，PKA的活性也因其下調(diào)而受限制[14]。綜上所述，從SUFU解離出來(lái)的GLI2和GLI3形成了激活的GLI2和GLI3（GLI2A和GLI3A），轉(zhuǎn)移到核內(nèi)并激活它們的靶基因。在經(jīng)典HH信號(hào)通路中，大多數(shù)GLI依賴的HH靶基因的激活都是受GLI2A調(diào)控的[15]。

2 Hedgehog信號(hào)通路在造血系統(tǒng)中的作用

在胚胎造血中，Hh信號(hào)通路隨時(shí)間和環(huán)境而改變。小鼠研究表明，IHH在早期的血生成和血管生成的激活過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IHH和SMO缺失都與“血島”分化和功能血管重建的抑制有關(guān)[16]。相反，在替代實(shí)驗(yàn)條件下，IHH缺乏沒(méi)有損害早期的紅細(xì)胞生成、造血干細(xì)胞(haematopoietic stem cell，HSC)或祖細(xì)胞形成[17]。反而晚期紅細(xì)胞生成有缺陷，常常導(dǎo)致致命性妊娠中期貧血。在哺乳動(dòng)物胚胎中出現(xiàn)多功能HSCs的第一個(gè)確定位點(diǎn)被稱為主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephros，AGM)區(qū)域。Gering和Patient提出，至少在斑馬魚胚胎中，Hh通路抑制環(huán)巴胺在早期造血過(guò)程中，使SMO穩(wěn)定在非活性狀態(tài)下，導(dǎo)致HSC血生成缺陷[18]。此外，Zhao等在SMO敲除小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，HSC在二次移植中出現(xiàn)長(zhǎng)期的功能性缺陷，表明SMO在HSC功能中起著重要的作用[19]。在小鼠造血細(xì)胞中，條件性缺失PTCH1未能誘導(dǎo)Hh通路的功能上調(diào)，且無(wú)表型效應(yīng)[20]。相反，在骨髓微環(huán)境中缺失PTCH1，增加了c-kit+/Sca-1+陰性細(xì)胞，髓樣祖細(xì)胞的動(dòng)員，以及T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的凋亡。因此，PTCH1的缺失導(dǎo)致了不同細(xì)胞外機(jī)制的造血作用，細(xì)胞循環(huán)增加，而不是直接激活造血細(xì)胞中的Hh信號(hào)通路。這些研究強(qiáng)調(diào)了Hh通路抑制藥物對(duì)造血直接和間接作用的重要性。

為了探討GLI家族成員在正常造血過(guò)程中的重要性，研究通路遠(yuǎn)端的SMO和PTCH1，Merchant等發(fā)現(xiàn)在Gli1敲除的小鼠模型中的HSC和祖細(xì)胞分布位置是不同的。與野生型小鼠相比，Gli1敲除小鼠增加了長(zhǎng)期的HSC，缺陷的HSC和祖細(xì)胞增殖，降低了骨髓分化。此外，Gli1敲除的HSCs的細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)減少，極有可能導(dǎo)致增殖減弱?？傮w而言，Hh信號(hào)在正常的造血過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[21]。然而，與這些結(jié)果形成鮮明對(duì)比的是，其他實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)使用增益和功能損失條件的SMO基因模型表明，Hh通路活性實(shí)際上對(duì)HSC的維持和功能是可有可無(wú)的。Dierks等指出，當(dāng)胎鼠肝臟的SMO/HSCs(妊娠14～5 d)移植到C57BL/6小鼠時(shí)，未出現(xiàn)明顯的再生能力缺陷。然而，明顯的是CD8+T細(xì)胞幾乎完全喪失，強(qiáng)調(diào)了Hh信號(hào)通道對(duì)淋巴細(xì)胞發(fā)育的重要性[22]。其他的工作也證明，條件性SMO缺失或過(guò)度激活對(duì)成人HSC的功能和自我更新無(wú)顯著影響。在SMO缺陷小鼠中，SMO缺失對(duì)HSCs的相對(duì)頻率或絕對(duì)數(shù)量均無(wú)影響。如果是這樣的話，至少在成人造血穩(wěn)定時(shí)期時(shí)，這可能會(huì)增加惡性生理造血的治療空窗期。這明顯地對(duì)比了Zhao等人所描述的關(guān)于SMO缺陷小鼠的研究結(jié)果，盡管使用了不同的實(shí)驗(yàn)方法。在Zhao的實(shí)驗(yàn)方法中，雖然SMO缺陷小鼠的HSCs和分化細(xì)胞的頻率與對(duì)照組比較無(wú)變化，但在原發(fā)性和繼發(fā)性移植的HSC長(zhǎng)期功能上存在明顯的缺陷[19]。

3 HH信號(hào)通路與多發(fā)性骨髓瘤藥

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細(xì)胞來(lái)源的惡性血液系統(tǒng)腫瘤，起源于骨髓中的漿細(xì)胞，屬于一種B淋巴細(xì)胞淋巴瘤。目前WHO將其歸為B細(xì)胞淋巴瘤的一種，其特征為骨髓漿細(xì)胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈（M蛋白）過(guò)度生成[23]。多發(fā)性骨髓瘤常伴有多發(fā)性溶骨性損害、高鈣血癥、貧血、腎臟損害、細(xì)菌性感染等并發(fā)癥。西方國(guó)家發(fā)病率估計(jì)為2～3/10萬(wàn)，我國(guó)的發(fā)病率為～1.5/10萬(wàn)，男女比例為1.6︰1，大多患者年齡＞40歲[24]。目前，MM的治療主要靠藥物化療，但是常規(guī)化療效果差，預(yù)后不良，而腫瘤多藥耐藥性（multi-drug resistance，MDR）則是MM化療失敗的關(guān)鍵因素。人惡性腫瘤對(duì)化療的耐藥性可分為先天性耐藥和獲得性耐藥。大量研究表明，HH信號(hào)通路在腫瘤耐藥性形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。HH的活化根據(jù)其機(jī)制不同，分為經(jīng)典型活化通路和非經(jīng)典型活化通路。其中經(jīng)典型活化指的是通過(guò)配體，即SHH、IHH、或者DHH與受體PTHC結(jié)合之后，激活GLI轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)生的HH信號(hào)通路活化；而非經(jīng)典型活化指的是不依賴于配體的活化方式，通常包括受體的突變、細(xì)胞漿或者細(xì)胞核內(nèi)其他因子對(duì)GLI1、GLI2等轉(zhuǎn)錄因子的持續(xù)活化性修飾而導(dǎo)致的異?；罨痆25]。無(wú)論是配體依賴型還是非依賴型，腫瘤發(fā)生過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素是因其過(guò)度活化。Munshi實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典和非經(jīng)典的Hedgehog信號(hào)通路的激活在MM腫瘤發(fā)生中都發(fā)揮了重要的作用[26]。Lennon實(shí)驗(yàn)室對(duì)MM病人樣本進(jìn)行GLI3、SHH、PTCH1和p53基因突變的測(cè)序發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)9%的MM患者體內(nèi)存在GLIPR1/GLIPR1L1/GLIPR1L2三個(gè)缺失突變的位點(diǎn)，因?yàn)镚LI3是一種抑制性的轉(zhuǎn)錄因子，因此GLI3的突變?cè)斐闪薍H信號(hào)通路的過(guò)度活化，這也是非經(jīng)典HH信號(hào)通路活化的一種方式[27]。

我們實(shí)驗(yàn)室之前的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典型和非經(jīng)典型Hedgehog信號(hào)通路的活化，都能誘導(dǎo)MM細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。在多發(fā)性骨髓瘤病人的骨髓中，骨髓瘤細(xì)胞能自分泌產(chǎn)生SHH，通過(guò)與PTCH1受體結(jié)合激活HH通路，促進(jìn)下游抗凋亡基因BCL2的表達(dá)，抑制化療藥物馬法蘭、硼替佐米等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而產(chǎn)生腫瘤耐藥[28]。Derick等的研究也發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的SHH因子，也可以通過(guò)旁分泌的方式，激活HH通路，促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增值和化療藥物引起的耐藥性[29]。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)異常活化的MAPK-ERK通路，能夠通過(guò)MEK1抑制GSK3b的水平，從而抑制對(duì)GLI2的泛素化降解，造成GLI2過(guò)度積累從而造成HH通路的過(guò)度活化，促進(jìn)其下游的BCL2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)，從而促進(jìn)MM細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[30]。

隨著對(duì)MM耐藥性產(chǎn)生的研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)一些microRNA是通過(guò)調(diào)控Hedgehog通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Tang等人的研究發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p在多發(fā)性骨髓瘤病人體內(nèi)是低表達(dá)的，但是SMO和GLI1都是高表達(dá)的，尤其是17p染色體缺失突變的病人，這是因?yàn)閙iR-324基因跟HH的基因都定位于同一條染色體上。功能學(xué)的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p可以抑制MM細(xì)胞的增值、抗凋亡和腫瘤細(xì)胞的干性[31]。Xu等的研究發(fā)現(xiàn)，miR-1271在MM的初發(fā)病人和MM細(xì)胞系中都是低表達(dá)的，而且過(guò)表達(dá)miR-1271將抑制MM細(xì)胞的增值，并且能促進(jìn)凋亡。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，miR-1271是通過(guò)直接負(fù)調(diào)控SMO受體實(shí)現(xiàn)的[32]。這些研究的結(jié)果，為未來(lái)開發(fā)逆轉(zhuǎn)MM耐藥性提供了靶點(diǎn)的參考。

Hedgehog信號(hào)通路也可能是通過(guò)促進(jìn)MM腫瘤干細(xì)胞而達(dá)到促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生耐藥性的。Peacock CD等的研究表明，在MM細(xì)胞，有一群比較少的側(cè)群細(xì)胞，其表面標(biāo)志物為CD19+CD138-的為分化細(xì)胞，具有特別高表達(dá)的HH通路活性[33]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤的病人MM細(xì)胞中，RARα2受體比初發(fā)病人顯著增高，而且跟預(yù)后呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。實(shí)際上，高表達(dá)的RARα2是在MM腫瘤干細(xì)胞內(nèi)，其主要的作用有以下幾點(diǎn)：①促進(jìn)腫瘤的耐藥性；②增強(qiáng)其克隆形成能力；③激活Wnt和Hedgehog信號(hào)通路；④增加側(cè)群細(xì)胞的數(shù)量和醛脫氫酶的活力；⑤上調(diào)胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)[34]。由此可見(jiàn)，無(wú)論是HH自身直接活化，還是通過(guò)其他通路誘發(fā)的非經(jīng)典通路活化，都可以通過(guò)維持MM腫瘤干細(xì)胞。因?yàn)槟[瘤干細(xì)胞也是腫瘤產(chǎn)生耐藥性的一種重要機(jī)制，因此Hedgehog信號(hào)通路可能是通過(guò)維持MM細(xì)胞的中路干細(xì)胞干性，從而產(chǎn)生耐藥性。

4 小結(jié)與展望

HH抑制劑已成為治療多種腫瘤的有效手段，但HH通路還沒(méi)有被人們完全了解。結(jié)合目前的研究進(jìn)展，揭示在體內(nèi)更深層次的調(diào)控機(jī)制有利于我們針對(duì)HH通路依賴型腫瘤，包括多發(fā)性骨髓瘤，研發(fā)更有成效的腫瘤治療策略。在治療上，HH通路是一個(gè)重要的腫瘤治療和再生醫(yī)學(xué)靶點(diǎn)。雖然在成體階段靜息狀態(tài)的HH通路被激活對(duì)各種器官再生發(fā)揮重要作用，但并沒(méi)有利用HH通路這些有利方面的臨床報(bào)道。而且，一開始人們把研究集中在HH通路在促腫瘤發(fā)生的破壞性作用上，HH最突出的作用就是刺激和促進(jìn)癌癥發(fā)生，這也使得人們?cè)谶M(jìn)行再生治療時(shí)應(yīng)更加謹(jǐn)慎。

對(duì)于提高對(duì)HH通路依賴型腫瘤的治療策略還有很大的探索空間，目前，vismodegib和sonidegib作為SMO抑制劑，都應(yīng)用到對(duì)SMO的臨床治療，也可以對(duì)晚期和轉(zhuǎn)移性BCC進(jìn)行治療。通過(guò)對(duì)MM患者的研究，尋找鑒定區(qū)分患者響應(yīng)的方法能夠幫助更好的設(shè)計(jì)和解釋臨床試驗(yàn)。

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