單細(xì)胞分析研究進(jìn)展

丁鐘歡 綜述，盧忠心 審校

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430000)

細(xì)胞是組成人體組織與器官的基本單位，通過(guò)細(xì)胞集合進(jìn)行的研究通常會(huì)錯(cuò)失很多重要信息，主要是由于細(xì)胞集合性研究反映的是這一細(xì)胞集體的平均水平，而單個(gè)細(xì)胞間表達(dá)的信息往往千差萬(wàn)別。腫瘤細(xì)胞的突變狀態(tài)、表觀遺傳狀況以及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平等重要信息可能只有一小部分甚至少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞表達(dá)[1]。另外，很多能反映疾病狀態(tài)的珍貴細(xì)胞，如母體血胎兒細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的數(shù)量非常稀少，很容易被大量的背景細(xì)胞所干擾[2]。因此，近年來(lái)隨著個(gè)體化醫(yī)療的發(fā)展及二代測(cè)序技術(shù)的提高，單細(xì)胞分析逐漸受到關(guān)注。

單細(xì)胞分析即是通過(guò)相應(yīng)的技術(shù)對(duì)單個(gè)靶細(xì)胞進(jìn)行分離提取，并通過(guò)全基因組擴(kuò)增及二代測(cè)序等技術(shù)對(duì)靶細(xì)胞內(nèi)的基因組信息、蛋白信息進(jìn)行分析的過(guò)程。通過(guò)單細(xì)胞分析，會(huì)將腫瘤進(jìn)展過(guò)程中的細(xì)胞變化、單個(gè)CTC的遺傳狀態(tài)、細(xì)胞與細(xì)胞間的異質(zhì)性、利用胎兒細(xì)胞遺傳疾病等問(wèn)題迎刃而解[2]。本文將從近年來(lái)單個(gè)細(xì)胞的分離與提取手段、全基因組擴(kuò)增及下游組學(xué)分析等研究進(jìn)展作一綜述。

1　單細(xì)胞的分離與提取

單個(gè)細(xì)胞的分離與提取是進(jìn)行單細(xì)胞分析的前提條件。流式細(xì)胞術(shù)等傳統(tǒng)細(xì)胞分離方法對(duì)單細(xì)胞的分離效果并不理想；近年來(lái)，有很多學(xué)者對(duì)單細(xì)胞的分離與提取方法進(jìn)行了不斷地探索。新發(fā)展的方法是結(jié)合了幾種傳統(tǒng)方法的特點(diǎn)而建立的新方法。例如，CAMPTON等[3]于2015年報(bào)道的單個(gè)CTC的分離檢測(cè)系統(tǒng)-AccuCyte?-CyteFinder?系統(tǒng)將離心、染色、鏡檢、細(xì)胞挑選集于一體，大大提高了單細(xì)胞分離的效率。

另外，傳統(tǒng)方法的改進(jìn)與發(fā)展也是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，很多方法是基于微流控芯片檢測(cè)方法的改進(jìn)。如ZHANG等[4]利用油性小滴將細(xì)胞隔離為單個(gè)細(xì)胞，再與微流控芯片系統(tǒng)結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，其單細(xì)胞的分離效率超過(guò)90%。ANTFOLK等[5]將分離CTC的聲動(dòng)力分選富集芯片與介電電泳芯片結(jié)合成聯(lián)合式的微流控系統(tǒng)可用于單個(gè)CTC的檢測(cè)。還有ZHANG等[6]報(bào)道的“3D凝膠島”芯片芯片，ANTFOLK等[5]報(bào)道的不同組分結(jié)構(gòu)芯片，以及KIM等[7]報(bào)道的單細(xì)胞檢測(cè)芯片等都表明其對(duì)單細(xì)胞具有較好的分離效果。另外，也有免疫磁珠法的改進(jìn)，如HUANG等[8]報(bào)道表明用微磁珠與微流控芯片結(jié)合的新方法能提高對(duì)CTC的捕獲效率，在癌細(xì)胞模型中的捕獲效率超過(guò)97%。也有人工細(xì)胞提取技術(shù)的改進(jìn)，如YOSHINO等[9]首先將乙二醇二丙烯酸酯光聚合水凝膠與微陣列捕獲進(jìn)行結(jié)合對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行分離和下游分析。KRONEIS等[10]報(bào)道的自動(dòng)激光微分離法能準(zhǔn)確地分離特異性染色的單個(gè)靶細(xì)胞。此外，也有利用靶細(xì)胞的新特性或利用新技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞分離的新方法，如DENG等[11]發(fā)現(xiàn)在封閉的小室內(nèi)用激光誘導(dǎo)前向轉(zhuǎn)移技術(shù)也能很好地對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離。 CHEN等[12]利用微量吸管液體乳膠生成器生成很多乳糜狀的油性小滴，能將單個(gè)細(xì)胞包被在此環(huán)境中進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和下游分析。

總的來(lái)說(shuō)，這些研究均表明，可根據(jù)靶細(xì)胞的不同特性進(jìn)行多種不同方法的單細(xì)胞分離，但是這些分離方法仍局限于實(shí)驗(yàn)室探索階段，高效、特異、簡(jiǎn)單的單細(xì)胞分離方法有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2　單細(xì)胞信息分析

2.1全基因組擴(kuò)增單細(xì)胞基因組DNA水平低至6 pg，每個(gè)基因只含有2個(gè)拷貝數(shù)，因此，利用普通方法進(jìn)行單細(xì)胞基因組擴(kuò)增與分析是不可行的[2]。目前為止，傳統(tǒng)的全基因組擴(kuò)增方法主要包括點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)(DOP-PCR)、多重置換擴(kuò)增法(MDA)、多重退火及環(huán)式循環(huán)擴(kuò)增法[2]。由于基因組覆蓋的廣度不同、鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶堿基水平差異產(chǎn)生擴(kuò)增偏倚、等位基因缺失、等位基因優(yōu)先擴(kuò)增等因素會(huì)使這些全基因組擴(kuò)增方法間存在明顯的差異，能影響下游的微陣列芯片及二代測(cè)序分析。

因此，近年來(lái)人們也在對(duì)全基因組擴(kuò)增方法進(jìn)行不斷的改進(jìn)與探索。最近，CHEN等[13]的轉(zhuǎn)座子插入線性擴(kuò)增法通過(guò)轉(zhuǎn)座子插入進(jìn)行線性放大，DNA被含有T7啟動(dòng)子的Tn5轉(zhuǎn)座子隨機(jī)片段化，T7啟動(dòng)子允許線性擴(kuò)增，該方法能在千堿基分辨率進(jìn)行微拷貝數(shù)變異(CNA)、單核苷酸變異(SNV)的檢測(cè)。 PICHER等[14]報(bào)道了一種特殊的DNA聚合酶-TthPrimPol酶，具有比Phi29 DNA酶具有更強(qiáng)的聚合活性，利用該酶進(jìn)行的多重置換擴(kuò)增反應(yīng)比Phi29具有更廣的基因組覆蓋度及單核苷酸變異位點(diǎn)檢測(cè)能力。 LEUNG等[15]通過(guò)一種油性-MDA，能在納米級(jí)體積的基礎(chǔ)上進(jìn)行高效的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增。

總之，隨著單細(xì)胞，特別是CTC、循環(huán)胎兒細(xì)胞等珍貴細(xì)胞在臨床中扮演著越來(lái)越重要的角色，單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)逐漸受到重視，為下游測(cè)序及相應(yīng)基因組分析提供良好的基礎(chǔ)。

2.2單細(xì)胞基因組測(cè)序分析全基因組測(cè)序是篩查單細(xì)胞SNV及CNA的有效手段，是檢測(cè)拷貝數(shù)變異的有效工具。目前為止，大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)主要在2個(gè)平臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè)：Illumina公司的 HiSeq/MiSeq平臺(tái)以及Thermo Fisher Scientific公司的Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)[16]。 HiSeq平臺(tái)因測(cè)序覆蓋度更廣及價(jià)格較為低廉而被更廣泛地使用。而Ion Torrent平臺(tái)則更傾向于靶向測(cè)序，是臨床上用于突變等檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。另外，不同類型變異的檢測(cè)所要求的測(cè)序深度不同；如單細(xì)胞拷貝數(shù)變異分析所要求的測(cè)序深度較淺，可低至0.1～2.0 ×，而單細(xì)胞單核苷酸變異的測(cè)序深度則較大，為30.0～50.0 ×[17]。

值得一提的是，在基因組中，外顯子雖然只占其全長(zhǎng)的1%，卻包含了約85%疾病相關(guān)的變異位點(diǎn)，因此，外顯子組測(cè)序也十分重要。外顯子組測(cè)序只對(duì)外顯子進(jìn)行富集、擴(kuò)增，所以其相比全基因組測(cè)序能更加高效、更利于編碼序列的讀取。目前，幾種可用于單細(xì)胞外顯子建庫(kù)的方法包括NimbleGen′s SeqCap、Agilent SureSelect、 Illumina TruSeq 及Nextera Exome[18]。 CHILAMAKURI等[18]對(duì)這4種方法進(jìn)行評(píng)估結(jié)果顯示，Illumina平臺(tái)能更高效地對(duì)編碼及翻譯區(qū)域的堿基進(jìn)行讀取。此外，Nextera Exome技術(shù)結(jié)合了樣本準(zhǔn)備的簡(jiǎn)化程序及TruSeq的富集程序，使DNA需要量更少、時(shí)間需求更短[19]。

2.3單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析在單細(xì)胞中，mRNA雖然水平較低，但也存在著上千個(gè)拷貝數(shù)，這使單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析成為可能[2]。而mRNA需經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄為cDNA后經(jīng)PCR擴(kuò)增后才能進(jìn)行測(cè)序分析，因此，高效、無(wú)偏差地反轉(zhuǎn)錄是擴(kuò)增、測(cè)序的先決條件。細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄本線性 RNA擴(kuò)增法是最早被用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄組RNA的方法，促進(jìn)了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的發(fā)展[20]。目前，主要有以下幾種改良的cDNA擴(kuò)增法：全組PCR擴(kuò)增法、3′末端擴(kuò)增法及鏈開(kāi)關(guān)介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增[21]。另外，幾種新的RNA測(cè)序方法也在探索與發(fā)展中，其中包括：細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄本分析、單分子熒光原位雜交及熒光原位雜交RNA測(cè)序等[2]。

2.4單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析對(duì)了解細(xì)胞信號(hào)通路及細(xì)胞間的異質(zhì)性具有重要的作用。傳統(tǒng)的蛋白檢測(cè)方法例如凝膠電泳法、免疫測(cè)定法、層析法、質(zhì)譜法都需要大量的細(xì)胞作為標(biāo)本。因此，單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析的主要瓶頸在于單細(xì)胞內(nèi)及其只有少量的蛋白質(zhì)而缺乏有效的擴(kuò)增方法[22]。最近，一些方法學(xué)的發(fā)展也能使單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析具有較好的靈敏度與特異度[2]。如LINDSTROM等[22]報(bào)道的以微流控芯片為基礎(chǔ)，發(fā)展的小型流式細(xì)胞儀能對(duì)少量細(xì)胞(100～1 000)進(jìn)行分析。MELLORS等[23]的研究表明，通過(guò)加入毛細(xì)管電泳改進(jìn)質(zhì)譜的方法使其靈敏度提升，能同時(shí)對(duì)單細(xì)胞中多達(dá)40項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量。 DENG等[24]報(bào)道顯示，的通過(guò)多聚賴氨酸標(biāo)簽結(jié)合微流控芯片的方法能有效對(duì)單個(gè)CTC細(xì)胞蛋白質(zhì)水平進(jìn)行評(píng)估。即便如此，單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析僅僅是一個(gè)開(kāi)端，更簡(jiǎn)便、更靈敏的單細(xì)胞蛋白質(zhì)檢測(cè)方法與手段有待進(jìn)一步的探索和研究。

3　小　　結(jié)

目前，單細(xì)胞的分離與提取方法仍未成熟，近年來(lái)探究的方法常以各種傳統(tǒng)方法相結(jié)合、傳統(tǒng)方法的改進(jìn)以及利用新特性等方式為主；全基因組擴(kuò)增的發(fā)展為單細(xì)胞基因組及轉(zhuǎn)錄組序列分析奠定了良好的基礎(chǔ)；單細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)分析為細(xì)胞間通路及其相互作用提供了條件；完善單細(xì)胞分離、提取手段及信息分析方法對(duì)研究細(xì)胞間異質(zhì)性及稀有細(xì)胞用于疾病診斷等方面具有重要的意義。

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