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    響應(yīng)面法優(yōu)化金蟬花多糖提取工藝及抗氧化活性分析

    2018-02-09 00:56:46宋佳敏王鴻飛王凱凱邵興鋒李和生
    食品科學(xué) 2018年4期
    關(guān)鍵詞:金蟬液料光度

    宋佳敏,王鴻飛*,孫 朦,王凱凱,許 鳳,邵興鋒,李和生

    (寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系,浙江 寧波 315211)

    金蟬花(Cordyceps cicadae)亦稱蟬花、蟬蛹草、蟬茸草,為麥角菌科真菌蟬草及其寄主山蟬的幼體干燥體,屬蟲草類藥食兩用真菌,主要分布于浙江、安徽、四川、福建等地。據(jù)報(bào)道,金蟬花作為優(yōu)質(zhì)蟲草,其活性成分與冬蟲夏草相似[1],有望成為冬蟲夏草的替代品,近年來受到許多學(xué)者的關(guān)注。金蟬花主要活性成分為多糖、核苷、甘露醇、麥角甾醇等[2-3],其中多糖為其主要有效成分。

    多糖類化合物廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中,主要由醛基和酮基通過苷鍵連接的高分子聚合物,被稱為構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)[4]。研究發(fā)現(xiàn),金蟬花多糖具有抗腫瘤[5]、降血糖[6]、免疫調(diào)節(jié)[7-9]和抗驚厥[10]等重要作用。采用水提法探索金蟬花多糖較適宜的提取工藝條件,并研究金蟬花多糖的抗氧化活性,為金蟬花多糖的開發(fā)及綜合利用提供一定理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    金蟬花產(chǎn)自浙江紹興。

    1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine,DPPH)、濃硫酸(均為分析純) 和光純藥工業(yè)株式會(huì)社;羥甲基氨基甲烷(Tris) 臺(tái)灣生工有限公司;茯苓多糖口服液(國藥準(zhǔn)字B20050015) 湖南補(bǔ)天藥業(yè)有限公司;蒽酮、葡聚糖、無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氫化鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Cary 50 Scan紫外分光光度計(jì) 美國瓦里安技術(shù)(中國)有限公司;WK-200B高速藥物粉碎機(jī) 山東青州市精誠機(jī)械有限公司;H1650型高速臺(tái)式離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)設(shè)備有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;FD-ID-80冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;UH-S2超聲波儀 天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 金蟬花多糖的提取

    參考楊娜等[11]方法:金蟬花→烘干→粉碎過篩(40目)→加水?dāng)噭颉暡ㄝo助處理→熱水浸提→過濾→濃縮→Sevag法去蛋白[12]→醇沉→冷凍干燥→金蟬花粗多糖。

    1.3.2 金蟬花多糖含量測(cè)定

    參考張惟杰等[13]硫酸-蒽酮法,以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并測(cè)定樣品多糖含量。

    1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    配制質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50 μg/mL的葡萄糖溶液,分別取1 mL于各試管中,加4 mL硫酸蒽酮溶液反應(yīng),迅速放入冰水中冷卻,沸水浴10 min,取出放入自來水中冷卻10 min,以蒸餾水代替葡萄糖溶液為空白對(duì)照,在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程y=0.007 9x+0.008 2,R2=0.998 3。

    1.3.2.2 金蟬花多糖含量的測(cè)定

    準(zhǔn)確稱取按1.3.1節(jié)方法得到的金蟬花粗多糖粉末,配得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的粗多糖溶液,取1.0 mL樣品溶液加入4 mL硫酸蒽酮溶液,按1.3.2.1節(jié)方法測(cè)得吸光度,根據(jù)公式(1)計(jì)算金蟬花多糖含量:

    式中:W為金蟬花多糖含量/(mg/g);C為樣品溶液多糖質(zhì)量濃度/(μg/mL);V為樣品定容體積/mL;m為原料質(zhì)量/g。

    1.3.3 單因素試驗(yàn)

    按照1.3.1節(jié)的方法分別考察超聲功率(60、90、120、150、180、200 W)、超聲時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)、浸提溫度(50、60、70、80、90、100 ℃)、浸提時(shí)間(30、60、90、120、150、180 min)以及液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1(mL/g))5 個(gè)因素對(duì)金蟬花多糖提取的影響。

    1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定超聲波輔助處理的功率和時(shí)間,對(duì)其余3 個(gè)因素利用響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14],選取浸提時(shí)間(A)、浸提溫度(B)、液料比(C)3 個(gè)因素為自變量,以金蟬花多糖含量為響應(yīng)值(Y),進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析,得到金蟬花多糖提取的適宜工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

    表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

    1.3.5 金蟬花多糖抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

    1.3.5.1 金蟬花多糖還原力的測(cè)定

    樣品還原能力的測(cè)定采用普魯士藍(lán)法[15],具體操作參照Pan Yingming等[16]方法:準(zhǔn)確吸取1.0 mL不同質(zhì)量濃度多糖溶液,分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.6,0.2 mol/L)和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,50 ℃反應(yīng)20 min,隨后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。3 000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,加2.5 mL無水乙醇和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液,混勻,于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,平行測(cè)定3 次,以VC和茯苓多糖作為對(duì)照。測(cè)得吸光度越大說明樣品還原力越強(qiáng)。

    1.3.5.2 金蟬花多糖清除DPPH自由基能力的測(cè)定[17]

    分別在不同質(zhì)量濃度的多糖溶液中加入2 mL DPPH-乙醇溶液(0.2 mmol/L),振蕩混勻,避光靜置30 min,于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai。同時(shí),用無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液,測(cè)得吸光度Aj,并測(cè)得2 mL DPPH-乙醇溶液和2 mL無水乙醇混合液的吸光度A0。以無水乙醇為參比,以VC和茯苓多糖作為對(duì)照,DPPH自由基清除率按公式(2)計(jì)算:

    式中:A0為2 mL DPPH-乙醇溶液+2 mL無水乙醇吸光度;Ai為2 mL DPPH-乙醇溶液+2 mL樣品溶液吸光度;Aj為2 mL無水乙醇+2 mL樣品溶液吸光度。

    1.3.5.3 金蟬花多糖清除·OH能力的測(cè)定

    采用Fenton反應(yīng)體系法[18-19]:分別往試管中加入不同濃度的多糖溶液1.0 mL,再分別加入1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液,1 mL 6 mmol/L的H2O2溶液和1 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液,37 ℃水浴1 h,在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度Ai。用蒸餾水代替樣品溶液測(cè)得A0,用蒸餾水代替雙氧水溶液測(cè)得吸光度Aj,按照公式(3)計(jì)算·OH清除率:

    式中:A0為1 mL FeSO4溶液+1mL蒸餾水+1mL H2O2溶液+1mL水楊酸-乙醇溶液吸光度;Ai為1 mL FeSO4溶液+1 mL樣品溶液+1 mL H2O2溶液+1 mL水楊酸-乙醇溶液吸光度;Aj為1 mL FeSO4溶液+1 mL樣品溶液+1 mL蒸餾水+1 mL水楊酸-乙醇溶液吸光度。

    參考朱月等[20-21]使用的鄰苯三酚自氧化法:取4.5 mL的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.2,50 mmol/L)于試管中37 ℃水浴預(yù)熱20 min,加入4 mL蒸餾水,37 ℃水浴20 min,取出加入0.5 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚溶液37 ℃水浴預(yù)熱20 min,計(jì)時(shí)1 min后迅速搖勻倒入比色皿,以10 mmol/L的HCl溶液作為對(duì)照,利用US-Vis Analyst軟件,設(shè)置波長(zhǎng)為325 nm,測(cè)定時(shí)間間隔為30 s,測(cè)定其吸光度,以時(shí)間、吸光度為坐標(biāo)作圖,斜率即為鄰苯三酚自氧化速率v0。用4 mL多糖溶液代替4 mL蒸餾水,按上述同樣方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以VC和茯苓多糖作對(duì)照,斜率為加有相應(yīng)濃度樣品溶液的鄰苯三酚氧化速率v1,按公式(4)計(jì)算·清除率:

    式中:v0為鄰苯三酚自氧化速率;v1為加入樣品溶液作為抑制劑后鄰苯三酚氧化速率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)金蟬花多糖含量的影響

    在液料比50∶1(mL/g)、超聲功率150 W、浸提溫度80 ℃、浸提時(shí)間90 min條件下,考察超聲時(shí)間對(duì)金蟬花多糖提取的影響,如圖1所示。

    圖1 超聲時(shí)間對(duì)金蟬花多糖含量的影響Fig. 1 Effect of ultrasonic treatment time on polysaccharide yield

    由圖1可以看出,在超聲時(shí)間小于20 min時(shí),金蟬花多糖含量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加;在20 min時(shí),多糖含量較高,此時(shí)多糖含量為26.77 mg/g。在超聲時(shí)間大于20 min時(shí),金蟬花多糖含量呈現(xiàn)下降,這可能是隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),多糖降解所致[22]。

    2.1.2 超聲功率對(duì)金蟬花多糖含量的影響

    在超聲時(shí)間20 min、浸提溫度80 ℃、浸提時(shí)間90 min、液料比50∶1(mL/g)條件下,考察超聲功率對(duì)金蟬花多糖提取的影響。由圖2可知,超聲功率在60~120 W時(shí),多糖含量隨功率的增加而增加;當(dāng)超過120 W時(shí),多糖含量隨著超聲功率的增加而下降。當(dāng)超聲功率為120 W時(shí),多糖含量較高,可達(dá)26.72 mg/g。

    圖2 超聲功率對(duì)金蟬花多糖含量的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

    2.1.3 浸提時(shí)間對(duì)金蟬花多糖含量的影響

    在超聲時(shí)間20 min、超聲功率120 W、浸提溫度80 ℃、液料比50∶1(mL/g)的條件下,考察浸提時(shí)間對(duì)金蟬花多糖提取的影響。由圖3可知,當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到120 min時(shí),金蟬花多糖含量較高,為27.15 mg/g;隨后隨著時(shí)間延長(zhǎng)多糖含量開始下降,這可能是多糖在水中浸提時(shí)間過長(zhǎng)后結(jié)構(gòu)遭到破壞導(dǎo)致的[23]。

    圖3 浸提時(shí)間對(duì)金蟬花多糖含量的影響Fig. 3 Effect of extraction time on polysaccharide yield

    2.1.4 浸提溫度對(duì)金蟬花多糖含量的影響

    在超聲時(shí)間20 min、超聲功率120 W、浸提時(shí)間120 min、液料比50∶1(mL/g)的條件下,考察浸提溫度對(duì)金蟬花多糖含量的影響。從圖4可看出,當(dāng)浸提溫度小于80 ℃,隨著浸提溫度升高,金蟬花多糖含量不斷的增加;但當(dāng)浸提溫度大于80 ℃時(shí),隨著浸提溫度的升高金蟬花多糖含量反而明顯下降,這一現(xiàn)象可能是由于溫度不斷升高,從而使得多糖部分水解[24]。因此,金蟬花多糖提取溫度可控制在80 ℃左右。

    圖4 浸提溫度對(duì)金蟬花多糖含量的影響Fig. 4 Effect of extraction temperature on polysaccharide yield

    2.1.5 液料比對(duì)金蟬花多糖含量的影響

    當(dāng)超聲時(shí)間20 min、超聲功率120 W、浸提溫度80 ℃、浸提時(shí)間120 min條件下,考察液料比對(duì)金蟬花多糖提取的影響。由圖5可知,液料比對(duì)金蟬花多糖浸提有一定的影響,金蟬花多糖含量隨著液料比的增大呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)液料比達(dá)到50∶1(mL/g)時(shí),金蟬花多糖含量較高,達(dá)27.32 mg/g。

    圖5 液料比對(duì)金蟬花多糖含量的影響Fig. 5 Effect of solvent-to-solid ratio on polysaccharide yield

    2.2 金蟬花多糖提取工藝條件的優(yōu)化

    2.2.1 模型方程建立與顯著性檢驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選用響應(yīng)面分析法對(duì)金蟬花多糖的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

    表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Experimental design with experimental values of polysaccharide yield for response surface analysis

    利用Design-Expert 8.0軟件,建立浸提時(shí)間、浸提溫度及液料比三因子數(shù)學(xué)回歸模型為:Y=27.54-1.06A-0.072B-0.36C-0.24AB-0.19AC-0.035BC-1.12A2-0.45B2-1.0C2。

    表3 回歸模型的方差分析Table3 Analysis of variance of regression model

    從表3可看出,一次項(xiàng)中,A(浸提時(shí)間)對(duì)多糖含量的線性效應(yīng)極顯著(P<0.001),C(液料比)對(duì)多糖含量的線性效應(yīng)顯著(P<0.05),B(浸提溫度)對(duì)多糖含量的線性效應(yīng)不顯著(P>0.05),二次項(xiàng)中,A2、C2影響均極顯著(P<0.001),B2影響顯著(P<0.05),AB、AC、BC影響不顯著(P>0.05)。此模型顯著性檢測(cè)P值為0.000 4,極顯著,失擬項(xiàng)P值為0.055 3,不顯著,校正模型的相關(guān)系數(shù)R2值為0.962 0,決定系數(shù)值為0.913 1,說明選用的模型與實(shí)際情況擬合較好、誤差小,能較好反應(yīng)出各因素與金蟬花多糖含量之間關(guān)系。由F值可知,在試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對(duì)多糖含量的影響大小依次為A(浸提時(shí)間)>C(液料比)>B(浸提溫度)。

    2.2.2 交互作用影響結(jié)果

    圖6 各因素交互作用對(duì)多糖含量影響的響應(yīng)面圖Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on polysaccharide yield

    由圖6可知,浸提時(shí)間、浸提溫度和液料比對(duì)金蟬花多糖的提取都有著顯著的影響。其中,浸提時(shí)間影響最為顯著,圖中曲面陡峭,隨著浸提時(shí)間延長(zhǎng)金蟬花多糖含量增加;液料比的影響相對(duì)顯著,曲面較為陡峭;浸提溫度影響次之,表現(xiàn)為曲面平緩。

    通過回歸模型的分析,以多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),金蟬花多糖適宜的提取工藝參數(shù)為浸提時(shí)間136.33 min、浸提溫度77.80 ℃、液料比47.84∶1(mL/g)。在此條件下,模型預(yù)測(cè)金蟬花多糖含量為26.71 mg/g。考慮到實(shí)際應(yīng)用過程中操作簡(jiǎn)便,將工藝條件修正為浸提時(shí)間130 min、浸提溫度80 ℃、液料比50∶1(mL/g);在此條件下,得到金蟬花多糖含量為26.14 mg/g,誤差為0.57 mg/g,實(shí)際值與理論值基本相符,說明模型對(duì)金蟬花多糖提取工藝條件參數(shù)優(yōu)化可靠可行,具有一定的實(shí)用價(jià)值。

    2.3 金蟬花多糖抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果

    2.3.1 總還原能力

    圖7 不同質(zhì)量濃度多糖的總還原能力Fig. 7 Total reducing capacity of WSP as a function of its concentration

    如圖7所示,在質(zhì)量濃度0.2~1.2 mg/mL范圍內(nèi),金蟬花多糖和VC還原能力均隨著質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng),兩者還原能力相近,而茯苓多糖還原力明顯低于金蟬花多糖和VC。表明金蟬花多糖具有良好的還原能力,此結(jié)果與封燕等[25]的研究結(jié)果相一致。

    2.3.2 清除DPPH自由基的能力

    圖8 多糖對(duì)DPPH自由基清除能力Fig. 8 Scavenging effect of WSP on DPPH

    由圖8可知,金蟬花多糖清除DPPH自由基能力較強(qiáng)。在質(zhì)量濃度10~100 μg/mL范圍內(nèi),金蟬花多糖和VC隨著溶液質(zhì)量濃度的增加,對(duì)DPPH自由基的清除能力先增強(qiáng)后趨于穩(wěn)定,其中當(dāng)質(zhì)量濃度大于60 μg/mL,金蟬花多糖對(duì)DPPH自由基的清除率趨于平緩,基本保持在82%以上,而此質(zhì)量濃度范圍內(nèi),茯苓多糖對(duì)DPPH自由基的清除率基本在10%以下,明顯低于金蟬花多糖。經(jīng)線性擬合,金蟬花多糖對(duì)DPPH自由基的IC50值為28.99 μg/mL。

    2.3.3 對(duì)·OH的清除作用

    圖9 多糖對(duì)·OH的清除能力Fig. 9 Scavenging effect of WPS on ·OH

    由圖9可知,在質(zhì)量濃度0.1~0.6 mg/mL范圍內(nèi),金蟬花多糖隨著質(zhì)量濃度的增加,對(duì)·OH的清除能力逐漸增強(qiáng);金蟬花多糖溶液質(zhì)量濃度從0.1 mg/mL增加到0.6 mg/mL,對(duì)·OH的清除率從29.02%增加到87.56%;此時(shí),VC的清除率基本保持在96%以上,較金蟬花多糖清除能力強(qiáng),但茯苓多糖的清除率基本保持在10%以下,明顯低于金蟬花多糖。根據(jù)清除率擬合曲線y=1.228 7x+0.223 2,R2=0.922 9,經(jīng)線性擬合,金蟬花多糖對(duì)·OH的IC50值為0.19 mg/mL。

    由圖10可知,在質(zhì)量濃度0.1~0.5 mg/mL范圍內(nèi),蟬花多糖對(duì)·清除能力隨著溶液質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng),金蟬花多糖質(zhì)量濃度從0.1 mg/mL增加到0.5 mg/mL,清除率從18.78%增加到67.40%。經(jīng)線性擬合,金蟬花多糖對(duì)·的IC50值為0.30 mg/mL。

    圖10 多糖對(duì)·的清除能力Fig. 10 Scavenging effect of WSP on

    3 結(jié) 論

    采用超聲波輔助水提醇沉法提取了金蟬花多糖,并利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行優(yōu)化,得到金蟬花多糖提取工藝參數(shù)為浸提時(shí)間130 min、浸提溫度80 ℃、液料比50∶1(mL/g),在此條件下金蟬花多糖含量實(shí)際值為26.14 mg/g。

    通過測(cè)定金蟬花多糖總還原力、清除DPPH自由基、·OH、·能力等多項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)金蟬花多糖抗氧化活性,結(jié)果顯示金蟬花多糖對(duì)DPPH自由基、·OH、·的IC50分別為28.99 μg/mL、0.19 mg/mL、0.30 mg/mL,表明金蟬花多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力。研究結(jié)果與魯吉珂[26]、Zhu Zhenyuan[27]等相一致。此外,金蟬花多糖對(duì)DPPH等自由基的清除能力與文獻(xiàn)[28-29]對(duì)冬蟲夏草多糖抗氧化活性的研究結(jié)果相似,這也說明金蟬花多糖具有較好的抗氧化活性。

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