雙向單因素與田口法優(yōu)化屎腸球菌產(chǎn)谷氨酸脫羧酶培養(yǎng)基

楊勝遠，李 云

（1.嶺南師范學院化學化工學院，熱帶與南海資源協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 湛江 524048；2.韓山師范學院生命科學與食品科技學院，廣東 潮州 521041）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種具有4 個碳原子的非蛋白質組成氨基酸，為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質，具有利尿、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗癌、降血壓和鎮(zhèn)靜作用，已成為備受關注的藥品和保健品成分[1-3]。由于可以通過內酰胺化作用形成2-吡咯烷酮，再通過化學轉化生成聚酰胺4，因此GABA還是生產(chǎn)生物塑料的重要原料[4-5]。

生物合成GABA是一種環(huán)境友好和安全的方式，主要可采用微生物發(fā)酵法[5-12]、微生物全細胞轉化法[13-18]和酶催化合成法[19-22]3 種方法進行生產(chǎn)。但是，無論采用何種生物合成法，其實質都是利用谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD；編號為EC4.1.1.15）。依賴于磷酸吡哆醛的GAD是生物催化L-谷氨酸的α-羧基發(fā)生脫羧反應生成GABA的唯一酶[23]，微生物細胞的GAD活性大小與GABA的產(chǎn)量密切相關。培養(yǎng)條件對微生物產(chǎn)GAD具有重要的影響，適宜的培養(yǎng)基不僅可以提高細胞的GAD活力，而且可以從原料的經(jīng)濟性和配制簡捷性角度降低GABA的生產(chǎn)成本。

GAD廣泛分布于生物活細胞中，從單細胞到哺乳動物細胞均有存在GAD的報道[24]。乳酸菌通常被認為是安全的微生物，可作為益生菌，因此在乳酸菌GAD和利用乳酸菌合成GABA方面?zhèn)涫荜P注[25]。近些年，利用屎腸球菌（Enterococcus faecium）GAD合成GABA的研究也備受青睞。Divyashri等[26]通過動力學和熱力學模型對屎腸球菌分批發(fā)酵法生產(chǎn)GABA的條件進行了探討，GABA的產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了2.9 倍；Pham等[10]模擬胃腸條件，對屎腸球菌游離細胞和海藻酸鈣包埋細胞產(chǎn)GABA的傳質特性進行了研究，海藻酸鈣包埋細胞產(chǎn)GABA能力顯著高于游離細胞；朱泉等[27]也篩選到一株GABA高產(chǎn)屎腸球菌菌株；李云等[15,28]對屎腸球菌的GAD酶學特性、細胞轉化法制備GABA也進行了報道。然而，目前關于屎腸球菌適宜產(chǎn)GAD培養(yǎng)基尚鮮見報道。

實驗比較了4 種已報道用于乳酸菌產(chǎn)GAD的培養(yǎng)基，結果屎腸球菌以蛋白胨-蔗糖-牛肉膏（peptonesucrose-beef extract，PSB）培養(yǎng)基產(chǎn)GAD活力最高，在此基礎上進一步通過雙向單因素和田口試驗設計法作進一步優(yōu)化，以期為屎腸球菌GAD的研究和生產(chǎn)提供更為簡單、高效而經(jīng)濟的培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與試劑

屎腸球菌（E. faecium）LNSF2為嶺南師范學院綠色生物制造研究室保藏菌株，分離自泡菜。

GABA（質量分數(shù)≥99%）、異硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC） 美國Sigma公司；乙腈、乙酸和三乙胺（均為色譜純） 美國TEDIA公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[29]：各成分用量分別為蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐溫80 1.0 g/L、檸檬酸銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、MgSO40.1 g/L、MnSO40.05 g/L、K2HPO42.0 g/L、谷氨酸一鈉（monosodium glutamate，MSG）10.0 g/L。

GYP培養(yǎng)基[16]：各成分用量分別為葡萄糖10.0 g/L、酵母膏10.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、乙酸鈉2.0 g/L、MgSO4·7H2O 20.0 mg/L、MnSO4·4H2O 1.0 mg/L、FeSO4·7H2O 1.0 mg/L、NaCl 1.0 mg/L、MSG 10.0 g/L。

TYG培養(yǎng)基[30]：各成分用量分別為胰蛋白胨5.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、MSG 10.0 g/L。

PSB培養(yǎng)基[8]：各成分用量分別為蛋白胨15.0 g/L、牛肉膏12.5 g/L、蔗糖12.5 g/L、檸檬酸銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、K2HPO41.03 g/L、CaCl22.12 g/L、吐溫80 1.0 g/L、MSG 10.0 g/L。

培養(yǎng)基pH值均調節(jié)到6.8，配制100 mL于250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

1200 Series高效液相色譜儀（配置G1354A四元梯度泵、G1316A柱溫箱、G1314B可變波長紫外檢測器、Chemstation工作站等） 美國Agilent公司；PSH-200生化培養(yǎng)箱 中科生命科技股份有限公司；Centrifuge 5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；VX-200旋渦混合儀美國Labnet公司；AUW120電子分析天平 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

從4 ℃保藏的E. faecium LNSF2斜面挑取1 環(huán)，接入PSB培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，然后按1%（體積分數(shù)，下同）的接種量接入PSB培養(yǎng)基，于37 ℃靜置培養(yǎng)12 h作為種子液。

1.3.2 E. faecium LNSF2發(fā)酵

將E. faecium LNSF2種子液按2%的接種量分別接入實驗設計的培養(yǎng)基，各接種9 瓶，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，作為發(fā)酵醪。發(fā)酵結束后，按同種培養(yǎng)基隨機分成3 組，每組3 瓶，分別將同組的發(fā)酵醪合并，每組3 個平行實驗，每個平行300 mL發(fā)酵醪。

1.3.3 不同培養(yǎng)基對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

分別以文獻報道用于研究Lactobacillus plantarum[29]、L. brevis[16]、Lactococcus lactis[30]和Streptococcus salivarius subsp. thermophilus[8]產(chǎn)GABA或GAD的MRS[29]、GYP[16]、TYG[30]和PSB[8]培養(yǎng)基進行發(fā)酵實驗，比較等體積發(fā)酵醪菌體的GAD活力。發(fā)酵按照1.3.2節(jié)方法進行。

1.3.4 雙向單因素試驗設計

正向單因素試驗培養(yǎng)基設計：以PSB培養(yǎng)基中的蛋白胨15 g/L、牛肉膏12.5 g/L和蔗糖12.5 g/L作為基礎培養(yǎng)基，在基礎培養(yǎng)基中分別添加CaCl22.12 g/L、K2HPO41.03 g/L、檸檬酸銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、吐溫80 1.0g/L、MSG 10.0g/L作為實驗組培養(yǎng)基。以僅由蛋白胨、牛肉膏和蔗糖組成的基礎培養(yǎng)基作為對照組的培養(yǎng)基。

反向單因素試驗培養(yǎng)基設計：以PSB培養(yǎng)基為基礎，分別去除配方中的CaCl2、K2HPO4、檸檬酸銨、乙酸鈉、吐溫80、MSG作為實驗組培養(yǎng)基。以PSB培養(yǎng)基作為對照組的培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基均調節(jié)pH 6.8，分裝100 mL于250 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。發(fā)酵方法按照1.3.2節(jié)進行。

1.3.5 田口試驗設計

在雙向單因素優(yōu)化結果基礎上，選擇用量較大的蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、乙酸鈉和MSG為主要影響因素，以原PSB相應因素的20%為步長，采用Minitab 15軟件選擇田口試驗設計法進行優(yōu)化，田口試驗設計法的因素與水平見表1。各組試驗培養(yǎng)基中非考察因素吐溫80的用量均為1.0 g/L，初始pH值為6.8，分裝100 mL于250 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。發(fā)酵方法按照1.3.2節(jié)進行。田口試驗分析采用2 批次的重復試驗結果作為響應值，選擇望大法分析均值和信噪比，從而選擇各因素的最優(yōu)水平。

表1 田口試驗設計因素與水平Table1 Level and code of independent variables used for Taguchi design g/L

1.3.6 驗證實驗

分別以原PSB培養(yǎng)基及經(jīng)田口試驗優(yōu)化的改良PSB培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，按照1.3.2節(jié)的發(fā)酵方法進行發(fā)酵。比較不同培養(yǎng)基對屎腸球菌的產(chǎn)GAD能力。培養(yǎng)基的pH值均為6.8，裝液量均為100 mL于250 mL三角瓶，滅菌條件為121 ℃滅菌15 min。

1.3.7 GAD活力測定

將300 mL發(fā)酵醪于4 ℃、8 500 r/min離心20 min，收集菌體。分別在含菌體的離心管中加入50 mL生理鹽水，混勻，然后于4 ℃、8 500 r/min離心20 min，收集菌體。分別加入15 mL 0.2 mol/L乙酸-乙酸鹽緩沖液（pH 4.4），冰浴中500 W超聲波破碎3 min（工作5 s，間隔5 s），作為粗酶液。

取粗酶液1 mL，加入1 mL 0.2 mol/L MSG溶液（0.2 mol/L、pH 4.4乙酸-乙酸鹽緩沖液），混勻后于40 ℃水浴恒溫反應6 h，立即加入-20 ℃預冷的無水乙醇8 mL，混勻，取1.0 mL于4 ℃、14 000 r/min離心15 min，收集上清液作為酶反應終止液。以1 mL不含MSG的0.2 mol/L乙酸-乙酸鹽緩沖液（pH 4.4）替代底物按同樣操作獲得的反應液作為空白對照。

將酶反應終止液經(jīng)適當稀釋后，采用高效液相色譜法測定GABA含量。

GAD活力單位定義為：在上述測定條件下1 h生成1 μmol GABA所需要的酶量為1 個酶活力單位（U）。以300 mL發(fā)酵醪的菌體GAD總活力作為各實驗條件下產(chǎn)GAD的響應值。GAD總活力的計算見下式：

式中：A為實驗組酶反應終止液GABA濃度/（μmol/mL）；B為測定實驗組反應終止液GABA濃度時樣品的稀釋倍數(shù)；C為空白組酶反應終止液GABA濃度/（μmol/mL）；D為測定空白組反應終止液GABA濃度時樣品的稀釋倍數(shù)；5為無水乙醇終止酶反應產(chǎn)生的稀釋倍數(shù)；2為酶反應液的總體積/mL；15為以300 mL發(fā)酵醪的菌體所制備的GAD酶液總體積/mL；6為酶反應時間/h。

1.3.8 GAD反應終止液GABA測定

1.3.8.1 色譜條件

參照文獻[31]，略有改變。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長254 nm；進樣量20 μL，柱溫25 ℃。采用流動相A與流動相B體積比80∶20，以0.6 mL/min線性等梯度洗脫。流動相A：稱取8.205 g乙酸鈉，溶于900 mL超純水，加入三乙胺0.5 mL、乙酸0.7 mL和乙腈 5.0 mL，調節(jié)至pH 5.8，定容至1 000 mL。流動相B：60%乙腈溶液。

1.3.8.2 衍生化方法

衍生化方法參照文獻[32]，略作改進。取100 μL標準溶液或GAD反應終止液注入1.5 mL的錐形離心管，加入50 μL乙腈-水-三乙胺-PITC（7∶1∶1∶1，V/V），混勻，室溫下放置1 h 后，加入150 μL流動相A-流動相B（80∶20，V/V），旋渦混合器振蕩1 min，然后加入600 μL正己烷，旋渦混合器振蕩1 min，靜置10 min。用注射器吸取下層溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾備測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

雙向單因素試驗結果采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件以獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析，田口試驗結果采用Minitab 15軟件選擇田口試驗設計法分析工具進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖1 不同培養(yǎng)基對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 1 Effect of different media on GAD production

從圖1可知，PSB培養(yǎng)基最有利于E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD，總活力為（249.96±14.54）U。經(jīng)t檢驗，E. faecium LNSF2在MRS、GYP和TYG培養(yǎng)基中產(chǎn)GAD活力與其在PSB培養(yǎng)基中產(chǎn)GAD活力差異極顯著（P＜0.01），因此選擇PSB培養(yǎng)基作為E. faecium LNSF2的產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

2.2 雙向單因素試驗結果

2.2.1 CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖2 CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 2 Effect of CaCl2 on GAD production

由圖2可知，在正向單因素試驗中，添加CaCl2實驗組的GAD總活力為（135.48±8.52）U，低于對照組的GAD總活力（203.52±9.34）U，經(jīng)t檢驗分析，實驗組與對照組差異極顯著（P＜0.01），說明CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利。在反向單因素試驗中，去除CaCl2實驗組的GAD總活力為（311.98±11.43）U，高于對照組的GAD總活力（257.64±10.48）U，實驗組與對照組差異極顯著（P＜0.01），結果也表明CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利。因此，綜合正向和反向單因素試驗結果，選擇不添加CaCl2。

2.2.2 K2HPO4對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖3 K2HPO4對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 3 Effect of K2HPO4 on GAD production

由圖3可知，添加K2HPO4實驗組的GAD總活力為（119.67±6.82）U，低于對照組的GAD總活力（195.71±8.63）U，經(jīng)t檢驗分析，實驗組與對照組差異極顯著（P＜0.01），說明K2HPO4對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利。雖然實驗組去除K2HPO4后，GAD總活力為（268.09±10.38）U，略高于對照組的GAD總活力（251.83±11.31）U，但是t檢驗表明實驗組與對照組無顯著性差異（P＞0.05），結果表明K2HPO4對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD影響不大。

從結果分析可見，正反兩向的單因素試驗結果并不顯著。由于反向單因素試驗中，培養(yǎng)基組分多，實驗組和對照組的培養(yǎng)基中均存在CaCl2，K2HPO4容易同CaCl2形成磷酸鹽沉淀，從而減弱了對照組中K2HPO4對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的不利影響；而且實驗組去除K2HPO4后，CaCl2無法再通過形成磷酸鹽沉淀而消除，從而造成CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響作用增強。

圖4 K2HPO4和CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的綜合影響Fig. 4 Combined impact of K2HPO4 and CaCl2 on GAD production

為了驗證上述分析的正確性，參照反向單因素試驗設計思路，同時去除PSB培養(yǎng)基的CaCl2和K2HPO4進行進一步實驗，由圖4可知，實驗組GAD總活力為（332.17±8.13）U，較對照組、只含K2HPO4和CaCl2之一實驗組的GAD總活力均顯著提高（P＜0.05）。因此考慮CaCl2與K2HPO4的關系，采信正向單因素試驗的結果，選擇不添加K2HPO4。

2.2.3 檸檬酸銨對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖5 檸檬酸銨對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 5 Effect of ammonium citrate on GAD production

由圖5可知，添加檸檬酸銨實驗組GAD總活力為（101.42±3.18）U，低于對照組GAD總活力（186.55±10.12）U，經(jīng)t檢驗分析，實驗組與對照組差異極顯著（P＜0.01），說明檸檬酸銨對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利。然而，反向單因素試驗結果卻顯示，去除PSB培養(yǎng)基的檸檬酸銨后，GAD總活力只有（215.94±10.38）U，低于含有檸檬酸銨對照組（249.72±10.33）U（P＜0.05），與正向單因素試驗結果矛盾。

上述結果表明CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利，在原PSB培養(yǎng)基的配方中同時存在著檸檬酸銨和CaCl2，由于檸檬酸酸根對金屬離子具有一定的螯合作用，可能檸檬酸銨與Ca2＋形成螯合物，從而可減小檸檬酸銨和CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利影響；去除檸檬酸銨后，造成CaCl2的負面作用突顯，從而造成E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD能力下降。在正向單因素試驗中，培養(yǎng)基不存在CaCl2的影響，檸檬酸銨對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響更直接，結果更可信，因此采信正向單因素試驗結果，選擇不添加檸檬酸銨。

2.2.4 乙酸鈉對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖6 乙酸鈉對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 6 Effect of sodium acetate on GAD production

由圖6可知，在正向單因素試驗結果中，添加乙酸鈉實驗組的GAD總活力為（218.78±7.91）U，高于對照組的GAD總活力（186.55±10.12）U，實驗組與對照組有顯著性差異（P＜0.05）；在反向單因素試驗結果中，去除乙酸鈉實驗組的GAD總活力為（124.51±6.84）U，低于對照組的GAD總活力（249.72±10.33）U，實驗組與對照組差異極顯著（P＜0.01）。正反雙向的單因素結果均表明培養(yǎng)基中添加乙酸鈉更有利于E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD，因此選擇添加乙酸鈉。

2.2.5 吐溫80對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖7 吐溫80對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 7 Effect of Tween 80 on GAD production

由圖7可知，在正向單因素試驗結果中，添加吐溫80實驗組GAD總活力為（208.52±7.63）U，高于對照組GAD總活力（181.46±9.71）U，實驗組與對照組差異顯著（P＜0.05）；在反向單因素試驗結果中，去除吐溫80實驗組GAD總活力為（223.26±8.22）U，低于對照組GAD總活力（251.37±7.86）U，實驗組與對照組差異顯著（P＜0.05）。正反雙向的單因素試驗結果均表明培養(yǎng)基中添加吐溫80更有利于E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD，因此選擇添加吐溫80。

2.2.6 MSG對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

圖8 MSG對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 8 Effect of MSG on GAD production

由圖8可知，在正向單因素試驗結果中，添加MSG實驗組GAD總活力為（196.77±8.14）U，顯著高于對照組GAD總活力（171.12±6.68）U（P＜0.05）；在反向單因素試驗中，去除MSG實驗組GAD總活力為（173.22±6.58）U，顯著低于對照組GAD總活力（247.36±8.35）U（P＜0.01）。結果表明培養(yǎng)基中添加MSG有利于E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD，因此選擇添加MSG。

2.3 田口試驗結果

田口試驗設計及結果如表2所示。采用田口分析的望大法對各因素水平的均值情況和信噪比情況進行分析，結果顯示各因素的均值殘差（圖9）和信噪比殘差（圖10）與模型擬合性較好，符合正態(tài)分布。

表2 田口試驗設計及結果Table2 Taguchi design matrix with experimental values of GAD activity

圖9 均值殘差正態(tài)概率圖Fig. 9 Normal probability pot for mean residual

圖10 信噪比殘差正態(tài)概率圖Fig. 10 Normal probability pot for residual of signal-to-noise ratio

表3 所選因素水平的均值響應Table3 Mean response of factors

表4 均值方差分析Table4 Analysis of variance of mean values

表5 所選因素水平的信噪比響應Table5 Signal-to-noise ratio response of factors

表6 信噪比方差分析Table6 Analysis of variance of signal-to-noise ratio

由表3可知，各因素的均值響應情況為D＞A＞E＞C＞B；由表4可知，A、B、C、D、E均為極顯著因素（P＜0.01）。由表5可知，各因素信噪比響應情況也為D＞A＞E＞C＞B；從表6可知，A、C、D和E為極顯著因素（P＜0.01），B為不顯著因素（P＞0.10）。

因此，綜合考慮影響均值和信噪比的顯著性因素，確定A、C、D和E為位置因素，B為散度因素。首先根據(jù)圖11選擇位置因素的水平使均值最大，即A2C2D3E2，再根據(jù)圖12選擇非位置因素的散度因素B的第1水平，使散度最小化，即B1，最終得出最優(yōu)培養(yǎng)基的組合為A2B1C2D3E2，與非考察因素吐溫80（1.0 g/L）即可得出優(yōu)化后的PSB培養(yǎng)基（稱為改良PSB培養(yǎng)基）組成為蛋白胨15 g/L、牛肉膏10 g/L、蔗糖 12.5 g/L、乙酸鈉6.0 g/L、MSG 10 g/L、吐溫80 1.0 g/L。

圖11 均值主效應圖Fig. 11 Main effect of mean values

圖12 信噪比主效應圖Fig. 12 Main effect of signal-to-noise ratio

2.4 驗證性實驗結果

將優(yōu)化的主要因素的最優(yōu)水平A2B1C2D3E2采用軟件中的“預測田口結果”功能進行預測，預測結果GAD總活力均值為399.30 U，標準差為12.51 U。

以經(jīng)田口優(yōu)化的改良PSB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，進行驗證性實驗，結果GAD總活力為（384.26±10.32）U，與預測值接近。經(jīng)t檢驗，驗證實驗結果與預測值沒有顯著性差異（P＞0.05）。

當以原PSB培養(yǎng)基進行發(fā)酵時，GAD總活力僅為（263.71±9.37）U。采用優(yōu)化后的改良PSB培養(yǎng)基發(fā)酵制備的GAD總活力較優(yōu)化前的PSB培養(yǎng)基提高了45.71%。從表7可知，改良PSB培養(yǎng)基的組分顯著減少，成本更低，配制更簡捷。

表7 優(yōu)化前后PSB的配方Table7 PSB medium components before and after optimization

3 討 論

單因素試驗法可針對性地考察某一因素的作用，已經(jīng)廣泛應用于各種因素篩選的研究中。然而，由于傳統(tǒng)單因素試驗設計是在基礎條件上單向增加或減少某一因素，未考慮因素間的交互作用，容易產(chǎn)生因改變某一因素而致使與之存在交互作用的另一因素的作用凸顯，從而導致誤判。這種情況在多因素共存的研究中尤為普遍。在多因素共存的情況下，各因素功能不同，可能是有利的或有害作用，而有的因素則本身的作用既無益也無害，但可能與其他因素發(fā)生作用而表現(xiàn)出有益或有害的影響。在多因素共存的系統(tǒng)中，甚至可能存在有害因素之間發(fā)生多種形式的相互作用，從而產(chǎn)生有益的表觀現(xiàn)象或表觀參數(shù)。例如，本實驗中CaCl2和K2HPO4對屎腸球菌LNSF2產(chǎn)GAD都是不利的，但是二者卻可發(fā)生反應形成磷酸鹽沉淀，從而減弱彼此的有害作用。如果試驗只是考察單一方向上的增加或去除CaCl2或K2HPO4，則會因改變了原有交互作用而產(chǎn)生誤判。

乳酸菌GAD與細胞生長的耐酸機制有關，可在酸性條件下誘導合成[33]。屎腸球菌是一種乳酸菌，在其生長代謝過程中因產(chǎn)酸而造成培養(yǎng)基pH值下降，從而對其生長和GAD的誘導合成產(chǎn)生影響。乙酸-乙酸鈉緩沖液在pH 3.6～5.8范圍內具有較好的緩沖能力，乙酸鈉在培養(yǎng)基中可以起到緩沖鹽的作用，能在更長時間內維持培養(yǎng)基的偏酸性環(huán)境，對菌體生長和GAD合成更為有利。吐溫80是一種表面活性劑，能起到乳化劑作用，可增加培養(yǎng)基的均勻性和細胞膜的通透性，促進細胞生長。GAD是一種誘導酶，楊勝遠等[34]在唾液鏈球菌嗜熱亞種Y-2產(chǎn)GAD影響因素的研究表明，添加MSG對GAD的合成并沒有明顯的誘導作用，而本研究結果表明添加MSG有利于屎腸球菌產(chǎn)GAD。由此可見，培養(yǎng)基中添加MSG對唾液鏈球菌嗜熱亞種和屎腸球菌產(chǎn)GAD的影響不同，其原因可能是：1）培養(yǎng)基中的蛋白胨和牛肉膏中存在L-谷氨酸，不同微生物對蛋白胨和牛肉膏的水解活性、蛋白酶的作用位點以及細胞對水解形成的L-谷氨酸利用情況不一致，從而導致起誘導作用的游離L-谷氨酸在培養(yǎng)基中的濃度存在差異，因而誘導能力存在差異；2）不同微生物合成GAD的底物誘導作用與底物濃度有一定相關性。具體誘導機制尚待進一步研究。上述分析表明，乙酸鈉、吐溫80和MSG對屎腸球菌產(chǎn)GAD是有利的，這在本研究的雙向單因素試驗中也得到了證實，理論分析與實驗結果相符。

楊勝遠等[35]在解淀粉芽孢桿菌抗菌物質發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化中設計了雙向單因素試驗法，在判斷MgSO4對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)抗菌物質作用方面起到了至關重要的作用。本實驗采用雙向單因素試驗設計法，也成功突破了CaCl2、K2HPO4和檸檬酸銨組分因交互作用而產(chǎn)生的假象。本實驗再次表明，雖然雙向單因素試驗法會增加實驗組數(shù)，增加工作量，但實驗結果能夠起到相互驗證的作用，更有利于對因素作用作出正確判斷，是一種非常有效的因素篩選方法。

田口法是田口玄一于20世紀50年代初在費歇爾多元配制法試驗設計的基礎上開發(fā)的正交試驗技術，研究表明該方法高效、穩(wěn)健[36-38]。本實驗采用雙向單因素試驗法結合田口法，在PSB培養(yǎng)基的基礎上對屎腸球菌產(chǎn)GAD培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，結果表明培養(yǎng)基組分減少而GAD總活力顯著提高，說明采用的試驗設計方法合理、可靠。

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