• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雙向單因素與田口法優(yōu)化屎腸球菌產(chǎn)谷氨酸脫羧酶培養(yǎng)基

    2018-02-09 01:03:22楊勝遠
    食品科學 2018年4期
    關鍵詞:乙酸鈉檸檬酸球菌

    楊勝遠,李 云

    (1.嶺南師范學院化學化工學院,熱帶與南海資源協(xié)同創(chuàng)新中心,廣東 湛江 524048;2.韓山師范學院生命科學與食品科技學院,廣東 潮州 521041)

    γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種具有4 個碳原子的非蛋白質組成氨基酸,為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質,具有利尿、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗癌、降血壓和鎮(zhèn)靜作用,已成為備受關注的藥品和保健品成分[1-3]。由于可以通過內酰胺化作用形成2-吡咯烷酮,再通過化學轉化生成聚酰胺4,因此GABA還是生產(chǎn)生物塑料的重要原料[4-5]。

    生物合成GABA是一種環(huán)境友好和安全的方式,主要可采用微生物發(fā)酵法[5-12]、微生物全細胞轉化法[13-18]和酶催化合成法[19-22]3 種方法進行生產(chǎn)。但是,無論采用何種生物合成法,其實質都是利用谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase,GAD;編號為EC4.1.1.15)。依賴于磷酸吡哆醛的GAD是生物催化L-谷氨酸的α-羧基發(fā)生脫羧反應生成GABA的唯一酶[23],微生物細胞的GAD活性大小與GABA的產(chǎn)量密切相關。培養(yǎng)條件對微生物產(chǎn)GAD具有重要的影響,適宜的培養(yǎng)基不僅可以提高細胞的GAD活力,而且可以從原料的經(jīng)濟性和配制簡捷性角度降低GABA的生產(chǎn)成本。

    GAD廣泛分布于生物活細胞中,從單細胞到哺乳動物細胞均有存在GAD的報道[24]。乳酸菌通常被認為是安全的微生物,可作為益生菌,因此在乳酸菌GAD和利用乳酸菌合成GABA方面?zhèn)涫荜P注[25]。近些年,利用屎腸球菌(Enterococcus faecium)GAD合成GABA的研究也備受青睞。Divyashri等[26]通過動力學和熱力學模型對屎腸球菌分批發(fā)酵法生產(chǎn)GABA的條件進行了探討,GABA的產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了2.9 倍;Pham等[10]模擬胃腸條件,對屎腸球菌游離細胞和海藻酸鈣包埋細胞產(chǎn)GABA的傳質特性進行了研究,海藻酸鈣包埋細胞產(chǎn)GABA能力顯著高于游離細胞;朱泉等[27]也篩選到一株GABA高產(chǎn)屎腸球菌菌株;李云等[15,28]對屎腸球菌的GAD酶學特性、細胞轉化法制備GABA也進行了報道。然而,目前關于屎腸球菌適宜產(chǎn)GAD培養(yǎng)基尚鮮見報道。

    實驗比較了4 種已報道用于乳酸菌產(chǎn)GAD的培養(yǎng)基,結果屎腸球菌以蛋白胨-蔗糖-牛肉膏(peptonesucrose-beef extract,PSB)培養(yǎng)基產(chǎn)GAD活力最高,在此基礎上進一步通過雙向單因素和田口試驗設計法作進一步優(yōu)化,以期為屎腸球菌GAD的研究和生產(chǎn)提供更為簡單、高效而經(jīng)濟的培養(yǎng)基。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌種與試劑

    屎腸球菌(E. faecium)LNSF2為嶺南師范學院綠色生物制造研究室保藏菌株,分離自泡菜。

    GABA(質量分數(shù)≥99%)、異硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate,PITC) 美國Sigma公司;乙腈、乙酸和三乙胺(均為色譜純) 美國TEDIA公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    MRS培養(yǎng)基[29]:各成分用量分別為蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐溫80 1.0 g/L、檸檬酸銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、MgSO40.1 g/L、MnSO40.05 g/L、K2HPO42.0 g/L、谷氨酸一鈉(monosodium glutamate,MSG)10.0 g/L。

    GYP培養(yǎng)基[16]:各成分用量分別為葡萄糖10.0 g/L、酵母膏10.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、乙酸鈉2.0 g/L、MgSO4·7H2O 20.0 mg/L、MnSO4·4H2O 1.0 mg/L、FeSO4·7H2O 1.0 mg/L、NaCl 1.0 mg/L、MSG 10.0 g/L。

    TYG培養(yǎng)基[30]:各成分用量分別為胰蛋白胨5.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、MSG 10.0 g/L。

    PSB培養(yǎng)基[8]:各成分用量分別為蛋白胨15.0 g/L、牛肉膏12.5 g/L、蔗糖12.5 g/L、檸檬酸銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、K2HPO41.03 g/L、CaCl22.12 g/L、吐溫80 1.0 g/L、MSG 10.0 g/L。

    培養(yǎng)基pH值均調節(jié)到6.8,配制100 mL于250 mL三角瓶中,121 ℃滅菌15 min。

    1.2 儀器與設備

    1200 Series高效液相色譜儀(配置G1354A四元梯度泵、G1316A柱溫箱、G1314B可變波長紫外檢測器、Chemstation工作站等) 美國Agilent公司;PSH-200生化培養(yǎng)箱 中科生命科技股份有限公司;Centrifuge 5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司;VX-200旋渦混合儀美國Labnet公司;AUW120電子分析天平 日本Shimadzu公司。

    1.3 方法

    1.3.1 種子液的制備

    從4 ℃保藏的E. faecium LNSF2斜面挑取1 環(huán),接入PSB培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h,然后按1%(體積分數(shù),下同)的接種量接入PSB培養(yǎng)基,于37 ℃靜置培養(yǎng)12 h作為種子液。

    1.3.2 E. faecium LNSF2發(fā)酵

    將E. faecium LNSF2種子液按2%的接種量分別接入實驗設計的培養(yǎng)基,各接種9 瓶,于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h,作為發(fā)酵醪。發(fā)酵結束后,按同種培養(yǎng)基隨機分成3 組,每組3 瓶,分別將同組的發(fā)酵醪合并,每組3 個平行實驗,每個平行300 mL發(fā)酵醪。

    1.3.3 不同培養(yǎng)基對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

    分別以文獻報道用于研究Lactobacillus plantarum[29]、L. brevis[16]、Lactococcus lactis[30]和Streptococcus salivarius subsp. thermophilus[8]產(chǎn)GABA或GAD的MRS[29]、GYP[16]、TYG[30]和PSB[8]培養(yǎng)基進行發(fā)酵實驗,比較等體積發(fā)酵醪菌體的GAD活力。發(fā)酵按照1.3.2節(jié)方法進行。

    1.3.4 雙向單因素試驗設計

    正向單因素試驗培養(yǎng)基設計:以PSB培養(yǎng)基中的蛋白胨15 g/L、牛肉膏12.5 g/L和蔗糖12.5 g/L作為基礎培養(yǎng)基,在基礎培養(yǎng)基中分別添加CaCl22.12 g/L、K2HPO41.03 g/L、檸檬酸銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、吐溫80 1.0g/L、MSG 10.0g/L作為實驗組培養(yǎng)基。以僅由蛋白胨、牛肉膏和蔗糖組成的基礎培養(yǎng)基作為對照組的培養(yǎng)基。

    反向單因素試驗培養(yǎng)基設計:以PSB培養(yǎng)基為基礎,分別去除配方中的CaCl2、K2HPO4、檸檬酸銨、乙酸鈉、吐溫80、MSG作為實驗組培養(yǎng)基。以PSB培養(yǎng)基作為對照組的培養(yǎng)基。

    培養(yǎng)基均調節(jié)pH 6.8,分裝100 mL于250 mL三角瓶,121 ℃滅菌15 min。發(fā)酵方法按照1.3.2節(jié)進行。

    1.3.5 田口試驗設計

    在雙向單因素優(yōu)化結果基礎上,選擇用量較大的蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、乙酸鈉和MSG為主要影響因素,以原PSB相應因素的20%為步長,采用Minitab 15軟件選擇田口試驗設計法進行優(yōu)化,田口試驗設計法的因素與水平見表1。各組試驗培養(yǎng)基中非考察因素吐溫80的用量均為1.0 g/L,初始pH值為6.8,分裝100 mL于250 mL三角瓶,121 ℃滅菌15 min。發(fā)酵方法按照1.3.2節(jié)進行。田口試驗分析采用2 批次的重復試驗結果作為響應值,選擇望大法分析均值和信噪比,從而選擇各因素的最優(yōu)水平。

    表1 田口試驗設計因素與水平Table1 Level and code of independent variables used for Taguchi design g/L

    1.3.6 驗證實驗

    分別以原PSB培養(yǎng)基及經(jīng)田口試驗優(yōu)化的改良PSB培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基,按照1.3.2節(jié)的發(fā)酵方法進行發(fā)酵。比較不同培養(yǎng)基對屎腸球菌的產(chǎn)GAD能力。培養(yǎng)基的pH值均為6.8,裝液量均為100 mL于250 mL三角瓶,滅菌條件為121 ℃滅菌15 min。

    1.3.7 GAD活力測定

    將300 mL發(fā)酵醪于4 ℃、8 500 r/min離心20 min,收集菌體。分別在含菌體的離心管中加入50 mL生理鹽水,混勻,然后于4 ℃、8 500 r/min離心20 min,收集菌體。分別加入15 mL 0.2 mol/L乙酸-乙酸鹽緩沖液(pH 4.4),冰浴中500 W超聲波破碎3 min(工作5 s,間隔5 s),作為粗酶液。

    取粗酶液1 mL,加入1 mL 0.2 mol/L MSG溶液(0.2 mol/L、pH 4.4乙酸-乙酸鹽緩沖液),混勻后于40 ℃水浴恒溫反應6 h,立即加入-20 ℃預冷的無水乙醇8 mL,混勻,取1.0 mL于4 ℃、14 000 r/min離心15 min,收集上清液作為酶反應終止液。以1 mL不含MSG的0.2 mol/L乙酸-乙酸鹽緩沖液(pH 4.4)替代底物按同樣操作獲得的反應液作為空白對照。

    將酶反應終止液經(jīng)適當稀釋后,采用高效液相色譜法測定GABA含量。

    GAD活力單位定義為:在上述測定條件下1 h生成1 μmol GABA所需要的酶量為1 個酶活力單位(U)。以300 mL發(fā)酵醪的菌體GAD總活力作為各實驗條件下產(chǎn)GAD的響應值。GAD總活力的計算見下式:

    式中:A為實驗組酶反應終止液GABA濃度/(μmol/mL);B為測定實驗組反應終止液GABA濃度時樣品的稀釋倍數(shù);C為空白組酶反應終止液GABA濃度/(μmol/mL);D為測定空白組反應終止液GABA濃度時樣品的稀釋倍數(shù);5為無水乙醇終止酶反應產(chǎn)生的稀釋倍數(shù);2為酶反應液的總體積/mL;15為以300 mL發(fā)酵醪的菌體所制備的GAD酶液總體積/mL;6為酶反應時間/h。

    1.3.8 GAD反應終止液GABA測定

    1.3.8.1 色譜條件

    參照文獻[31],略有改變。色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);檢測波長254 nm;進樣量20 μL,柱溫25 ℃。采用流動相A與流動相B體積比80∶20,以0.6 mL/min線性等梯度洗脫。流動相A:稱取8.205 g乙酸鈉,溶于900 mL超純水,加入三乙胺0.5 mL、乙酸0.7 mL和乙腈 5.0 mL,調節(jié)至pH 5.8,定容至1 000 mL。流動相B:60%乙腈溶液。

    1.3.8.2 衍生化方法

    衍生化方法參照文獻[32],略作改進。取100 μL標準溶液或GAD反應終止液注入1.5 mL的錐形離心管,加入50 μL乙腈-水-三乙胺-PITC(7∶1∶1∶1,V/V),混勻,室溫下放置1 h 后,加入150 μL流動相A-流動相B(80∶20,V/V),旋渦混合器振蕩1 min,然后加入600 μL正己烷,旋渦混合器振蕩1 min,靜置10 min。用注射器吸取下層溶液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾備測。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    雙向單因素試驗結果采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件以獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析,田口試驗結果采用Minitab 15軟件選擇田口試驗設計法分析工具進行分析。

    2 結果與分析

    2.1 不同培養(yǎng)基對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

    圖1 不同培養(yǎng)基對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 1 Effect of different media on GAD production

    從圖1可知,PSB培養(yǎng)基最有利于E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD,總活力為(249.96±14.54)U。經(jīng)t檢驗,E. faecium LNSF2在MRS、GYP和TYG培養(yǎng)基中產(chǎn)GAD活力與其在PSB培養(yǎng)基中產(chǎn)GAD活力差異極顯著(P<0.01),因此選擇PSB培養(yǎng)基作為E. faecium LNSF2的產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

    2.2 雙向單因素試驗結果

    2.2.1 CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

    圖2 CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 2 Effect of CaCl2 on GAD production

    由圖2可知,在正向單因素試驗中,添加CaCl2實驗組的GAD總活力為(135.48±8.52)U,低于對照組的GAD總活力(203.52±9.34)U,經(jīng)t檢驗分析,實驗組與對照組差異極顯著(P<0.01),說明CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利。在反向單因素試驗中,去除CaCl2實驗組的GAD總活力為(311.98±11.43)U,高于對照組的GAD總活力(257.64±10.48)U,實驗組與對照組差異極顯著(P<0.01),結果也表明CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利。因此,綜合正向和反向單因素試驗結果,選擇不添加CaCl2。

    2.2.2 K2HPO4對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

    圖3 K2HPO4對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 3 Effect of K2HPO4 on GAD production

    由圖3可知,添加K2HPO4實驗組的GAD總活力為(119.67±6.82)U,低于對照組的GAD總活力(195.71±8.63)U,經(jīng)t檢驗分析,實驗組與對照組差異極顯著(P<0.01),說明K2HPO4對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利。雖然實驗組去除K2HPO4后,GAD總活力為(268.09±10.38)U,略高于對照組的GAD總活力(251.83±11.31)U,但是t檢驗表明實驗組與對照組無顯著性差異(P>0.05),結果表明K2HPO4對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD影響不大。

    從結果分析可見,正反兩向的單因素試驗結果并不顯著。由于反向單因素試驗中,培養(yǎng)基組分多,實驗組和對照組的培養(yǎng)基中均存在CaCl2,K2HPO4容易同CaCl2形成磷酸鹽沉淀,從而減弱了對照組中K2HPO4對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的不利影響;而且實驗組去除K2HPO4后,CaCl2無法再通過形成磷酸鹽沉淀而消除,從而造成CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響作用增強。

    圖4 K2HPO4和CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的綜合影響Fig. 4 Combined impact of K2HPO4 and CaCl2 on GAD production

    為了驗證上述分析的正確性,參照反向單因素試驗設計思路,同時去除PSB培養(yǎng)基的CaCl2和K2HPO4進行進一步實驗,由圖4可知,實驗組GAD總活力為(332.17±8.13)U,較對照組、只含K2HPO4和CaCl2之一實驗組的GAD總活力均顯著提高(P<0.05)。因此考慮CaCl2與K2HPO4的關系,采信正向單因素試驗的結果,選擇不添加K2HPO4。

    2.2.3 檸檬酸銨對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

    圖5 檸檬酸銨對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 5 Effect of ammonium citrate on GAD production

    由圖5可知,添加檸檬酸銨實驗組GAD總活力為(101.42±3.18)U,低于對照組GAD總活力(186.55±10.12)U,經(jīng)t檢驗分析,實驗組與對照組差異極顯著(P<0.01),說明檸檬酸銨對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利。然而,反向單因素試驗結果卻顯示,去除PSB培養(yǎng)基的檸檬酸銨后,GAD總活力只有(215.94±10.38)U,低于含有檸檬酸銨對照組(249.72±10.33)U(P<0.05),與正向單因素試驗結果矛盾。

    上述結果表明CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利,在原PSB培養(yǎng)基的配方中同時存在著檸檬酸銨和CaCl2,由于檸檬酸酸根對金屬離子具有一定的螯合作用,可能檸檬酸銨與Ca2+形成螯合物,從而可減小檸檬酸銨和CaCl2對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD不利影響;去除檸檬酸銨后,造成CaCl2的負面作用突顯,從而造成E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD能力下降。在正向單因素試驗中,培養(yǎng)基不存在CaCl2的影響,檸檬酸銨對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響更直接,結果更可信,因此采信正向單因素試驗結果,選擇不添加檸檬酸銨。

    2.2.4 乙酸鈉對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

    圖6 乙酸鈉對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 6 Effect of sodium acetate on GAD production

    由圖6可知,在正向單因素試驗結果中,添加乙酸鈉實驗組的GAD總活力為(218.78±7.91)U,高于對照組的GAD總活力(186.55±10.12)U,實驗組與對照組有顯著性差異(P<0.05);在反向單因素試驗結果中,去除乙酸鈉實驗組的GAD總活力為(124.51±6.84)U,低于對照組的GAD總活力(249.72±10.33)U,實驗組與對照組差異極顯著(P<0.01)。正反雙向的單因素結果均表明培養(yǎng)基中添加乙酸鈉更有利于E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD,因此選擇添加乙酸鈉。

    2.2.5 吐溫80對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

    圖7 吐溫80對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 7 Effect of Tween 80 on GAD production

    由圖7可知,在正向單因素試驗結果中,添加吐溫80實驗組GAD總活力為(208.52±7.63)U,高于對照組GAD總活力(181.46±9.71)U,實驗組與對照組差異顯著(P<0.05);在反向單因素試驗結果中,去除吐溫80實驗組GAD總活力為(223.26±8.22)U,低于對照組GAD總活力(251.37±7.86)U,實驗組與對照組差異顯著(P<0.05)。正反雙向的單因素試驗結果均表明培養(yǎng)基中添加吐溫80更有利于E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD,因此選擇添加吐溫80。

    2.2.6 MSG對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響

    圖8 MSG對E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD的影響Fig. 8 Effect of MSG on GAD production

    由圖8可知,在正向單因素試驗結果中,添加MSG實驗組GAD總活力為(196.77±8.14)U,顯著高于對照組GAD總活力(171.12±6.68)U(P<0.05);在反向單因素試驗中,去除MSG實驗組GAD總活力為(173.22±6.58)U,顯著低于對照組GAD總活力(247.36±8.35)U(P<0.01)。結果表明培養(yǎng)基中添加MSG有利于E. faecium LNSF2產(chǎn)GAD,因此選擇添加MSG。

    2.3 田口試驗結果

    田口試驗設計及結果如表2所示。采用田口分析的望大法對各因素水平的均值情況和信噪比情況進行分析,結果顯示各因素的均值殘差(圖9)和信噪比殘差(圖10)與模型擬合性較好,符合正態(tài)分布。

    表2 田口試驗設計及結果Table2 Taguchi design matrix with experimental values of GAD activity

    圖9 均值殘差正態(tài)概率圖Fig. 9 Normal probability pot for mean residual

    圖10 信噪比殘差正態(tài)概率圖Fig. 10 Normal probability pot for residual of signal-to-noise ratio

    表3 所選因素水平的均值響應Table3 Mean response of factors

    表4 均值方差分析Table4 Analysis of variance of mean values

    表5 所選因素水平的信噪比響應Table5 Signal-to-noise ratio response of factors

    表6 信噪比方差分析Table6 Analysis of variance of signal-to-noise ratio

    由表3可知,各因素的均值響應情況為D>A>E>C>B;由表4可知,A、B、C、D、E均為極顯著因素(P<0.01)。由表5可知,各因素信噪比響應情況也為D>A>E>C>B;從表6可知,A、C、D和E為極顯著因素(P<0.01),B為不顯著因素(P>0.10)。

    因此,綜合考慮影響均值和信噪比的顯著性因素,確定A、C、D和E為位置因素,B為散度因素。首先根據(jù)圖11選擇位置因素的水平使均值最大,即A2C2D3E2,再根據(jù)圖12選擇非位置因素的散度因素B的第1水平,使散度最小化,即B1,最終得出最優(yōu)培養(yǎng)基的組合為A2B1C2D3E2,與非考察因素吐溫80(1.0 g/L)即可得出優(yōu)化后的PSB培養(yǎng)基(稱為改良PSB培養(yǎng)基)組成為蛋白胨15 g/L、牛肉膏10 g/L、蔗糖 12.5 g/L、乙酸鈉6.0 g/L、MSG 10 g/L、吐溫80 1.0 g/L。

    圖11 均值主效應圖Fig. 11 Main effect of mean values

    圖12 信噪比主效應圖Fig. 12 Main effect of signal-to-noise ratio

    2.4 驗證性實驗結果

    將優(yōu)化的主要因素的最優(yōu)水平A2B1C2D3E2采用軟件中的“預測田口結果”功能進行預測,預測結果GAD總活力均值為399.30 U,標準差為12.51 U。

    以經(jīng)田口優(yōu)化的改良PSB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基,進行驗證性實驗,結果GAD總活力為(384.26±10.32)U,與預測值接近。經(jīng)t檢驗,驗證實驗結果與預測值沒有顯著性差異(P>0.05)。

    當以原PSB培養(yǎng)基進行發(fā)酵時,GAD總活力僅為(263.71±9.37)U。采用優(yōu)化后的改良PSB培養(yǎng)基發(fā)酵制備的GAD總活力較優(yōu)化前的PSB培養(yǎng)基提高了45.71%。從表7可知,改良PSB培養(yǎng)基的組分顯著減少,成本更低,配制更簡捷。

    表7 優(yōu)化前后PSB的配方Table7 PSB medium components before and after optimization

    3 討 論

    單因素試驗法可針對性地考察某一因素的作用,已經(jīng)廣泛應用于各種因素篩選的研究中。然而,由于傳統(tǒng)單因素試驗設計是在基礎條件上單向增加或減少某一因素,未考慮因素間的交互作用,容易產(chǎn)生因改變某一因素而致使與之存在交互作用的另一因素的作用凸顯,從而導致誤判。這種情況在多因素共存的研究中尤為普遍。在多因素共存的情況下,各因素功能不同,可能是有利的或有害作用,而有的因素則本身的作用既無益也無害,但可能與其他因素發(fā)生作用而表現(xiàn)出有益或有害的影響。在多因素共存的系統(tǒng)中,甚至可能存在有害因素之間發(fā)生多種形式的相互作用,從而產(chǎn)生有益的表觀現(xiàn)象或表觀參數(shù)。例如,本實驗中CaCl2和K2HPO4對屎腸球菌LNSF2產(chǎn)GAD都是不利的,但是二者卻可發(fā)生反應形成磷酸鹽沉淀,從而減弱彼此的有害作用。如果試驗只是考察單一方向上的增加或去除CaCl2或K2HPO4,則會因改變了原有交互作用而產(chǎn)生誤判。

    乳酸菌GAD與細胞生長的耐酸機制有關,可在酸性條件下誘導合成[33]。屎腸球菌是一種乳酸菌,在其生長代謝過程中因產(chǎn)酸而造成培養(yǎng)基pH值下降,從而對其生長和GAD的誘導合成產(chǎn)生影響。乙酸-乙酸鈉緩沖液在pH 3.6~5.8范圍內具有較好的緩沖能力,乙酸鈉在培養(yǎng)基中可以起到緩沖鹽的作用,能在更長時間內維持培養(yǎng)基的偏酸性環(huán)境,對菌體生長和GAD合成更為有利。吐溫80是一種表面活性劑,能起到乳化劑作用,可增加培養(yǎng)基的均勻性和細胞膜的通透性,促進細胞生長。GAD是一種誘導酶,楊勝遠等[34]在唾液鏈球菌嗜熱亞種Y-2產(chǎn)GAD影響因素的研究表明,添加MSG對GAD的合成并沒有明顯的誘導作用,而本研究結果表明添加MSG有利于屎腸球菌產(chǎn)GAD。由此可見,培養(yǎng)基中添加MSG對唾液鏈球菌嗜熱亞種和屎腸球菌產(chǎn)GAD的影響不同,其原因可能是:1)培養(yǎng)基中的蛋白胨和牛肉膏中存在L-谷氨酸,不同微生物對蛋白胨和牛肉膏的水解活性、蛋白酶的作用位點以及細胞對水解形成的L-谷氨酸利用情況不一致,從而導致起誘導作用的游離L-谷氨酸在培養(yǎng)基中的濃度存在差異,因而誘導能力存在差異;2)不同微生物合成GAD的底物誘導作用與底物濃度有一定相關性。具體誘導機制尚待進一步研究。上述分析表明,乙酸鈉、吐溫80和MSG對屎腸球菌產(chǎn)GAD是有利的,這在本研究的雙向單因素試驗中也得到了證實,理論分析與實驗結果相符。

    楊勝遠等[35]在解淀粉芽孢桿菌抗菌物質發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化中設計了雙向單因素試驗法,在判斷MgSO4對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)抗菌物質作用方面起到了至關重要的作用。本實驗采用雙向單因素試驗設計法,也成功突破了CaCl2、K2HPO4和檸檬酸銨組分因交互作用而產(chǎn)生的假象。本實驗再次表明,雖然雙向單因素試驗法會增加實驗組數(shù),增加工作量,但實驗結果能夠起到相互驗證的作用,更有利于對因素作用作出正確判斷,是一種非常有效的因素篩選方法。

    田口法是田口玄一于20世紀50年代初在費歇爾多元配制法試驗設計的基礎上開發(fā)的正交試驗技術,研究表明該方法高效、穩(wěn)健[36-38]。本實驗采用雙向單因素試驗法結合田口法,在PSB培養(yǎng)基的基礎上對屎腸球菌產(chǎn)GAD培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,結果表明培養(yǎng)基組分減少而GAD總活力顯著提高,說明采用的試驗設計方法合理、可靠。

    [1] SCHULLER H M, AL-WADEI H A, MAJIDI M. Gammaaminobutyric acid, a potential tumor suppressor for small airwayderived lung adenocarcinoma[J]. Carcinogenesis, 2008, 29(10): 1979-1985.DOI:10.1093/carcin/bgn041.

    [2] DHAKAL R, BAJPAI V K, BAEK K H. Production of gaba(γ-aminobutyric acid) by microorganisms: a review[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2012, 43(4): 1230-1241. DOI:10.1590/S1517-83822012000400001.

    [3] 楊勝遠, 陸兆新, 呂鳳霞, 等. γ-氨基丁酸的生理功能和研究開發(fā)進展[J]. 食品科學, 2005, 26(9): 546-551. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2005.09.149.

    [4] KAWASAKI N, NAKAYAMA A, YAMANO N, et al. Synthesis,thermal and mechanical properties and biodegradation of branched polyamide 4[J]. Polymer, 2005, 46(33): 9987-9993. DOI:10.1016/j.polymer.2005.06.092.

    [5] PARK S J, KIM E Y, NOH W, et al. Synthesis of nylon 4 from gammaaminobutyrate (GABA) produced by recombinant Escherichia coli[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2013, 36(7): 885-892.DOI:10.1007/s00449-012-0821-2.

    [6] JORGE J M P, LEGGEWIE C, WENDISCH V F. A new metabolic route for the production of gamma-aminobutyric acid by Corynebacterium glutamicum from glucose[J]. Amino Acids, 2016,48(11): 2519-2531. DOI:10.1007/s00726-016-2272-6.

    [7] LI H, QIU T, HUANG G, et al. Production of gamma-aminobutyric acid by Lactobacillus brevis NCL912 using fed-batch fermentation[J]. Microbial Cell Factories, 2010, 9(10): 85-92. DOI:10.1186/1475-2859-9-85.

    [8] YANG S Y, Lü F X, LU Z X, et al. Production of γ-aminobutyric acid by Streptococcus salivarius subsp. thermophilus Y2 under submerged fermentation[J]. Amino Acids, 2008, 34(3): 473-478. DOI:10.1007/s00726-007-0544-x.

    [9] DIVYASHRI G, PRAPULLA S G. An insight into kinetics and thermodynamics of gamma-aminobutyric acid production by Enterococcus faecium CFR 3003 in batch fermentation[J]. Annals of Microbiology, 2015, 65(2): 1109-1118. DOI:10.1007/s13213-014-0957-1.

    [10] PHAM V D, LEE S H, PARK S J, et al. Production of gammaaminobutyric acid from glucose by introduction of synthetic scaffolds between isocitrate dehydrogenase, glutamate synthase and glutamate decarboxylase in recombinant Escherichia coli[J]. Journal of Biotechnology, 2015, 207: 52-57. DOI:10.1016/j.jbiotec.2015.04.028.

    [11] CHOI J W, YIM S S, LEE S H, et al. Enhanced production of gammaaminobutyrate (GABA) in recombinant Corynebacterium glutamicum by expressing glutamate decarboxylase active in expanded pH range[J].Microbial Cell Factories, 2015, 14(1): 21-32. DOI:10.1186/s12934-015-0205-9.

    [12] SHI F, JIANG J, LI Y, et al. Enhancement of gamma-aminobutyric acid production in recombinant Corynebacterium glutamicum by coexpressing two glutamate decarboxylase genes from Lactobacillus brevis[J]. Journal of Industrial Microbiology, 2013, 40(11): 1285-1296.DOI:10.1007/s10295-013-1316-0.

    [13] 楊勝遠, 陸兆新, 呂鳳霞, 等. 唾液鏈球菌嗜熱亞種Y-2細胞轉化法制備γ-氨基丁酸[J]. 食品科學, 2011, 32(1): 162-167.

    [14] 李云, 楊勝遠, 陳郁娜, 等. 戊糖片球菌HS2細胞制備γ-氨基丁酸的研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學, 2010, 49(6): 1450-1453. DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2010.06.010.

    [15] 李云, 楊勝遠, 陳郁娜, 等. 屎腸球菌HS3細胞轉化法生物合成γ-氨基丁酸的研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學, 2010, 37(6): 12-14. DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2010.06.025.

    [16] CHOI S I, LEE J W, PARK S M, et al. Improvement of gammaaminobutyric acid (GABA) production using cell entrapment of Lactobacillus brevis GABA 057[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006, 16(4): 562-568.

    [17] PLOKHOV A Y, GUSYATINER M M, YAMPOLSKAYA T A, et al.Preparation of γ-aminobutyric acid using E. coli cells with high activity of glutamate decarboxylase[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2000, 88: 257-265.

    [18] KE C, YANG X, RAO H, et al. Whole cell conversion of L-glutamic acid into gamma aminobutyric acid by metabolically engineered Escherichia coli[J]. Springer Plus, 2016, 5: 591-598. DOI:10.1186/s40064-016-2217-2.

    [19] DINH T H, HO N A T, KANG T J, et al. Salt-free production of γ-aminobutyric acid from glutamate using glutamate decarboxylase separated from Escherichia coli[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2014, 89: 1432-1436. DOI:10.1002/jctb.4251.

    [20] KANG T J, HO N A, PACK S P. Buffer-free production of gammaaminobutyric acid using an engineered glutamate decarboxylase from Escherichia coli[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2013, 53(3): 200-205.

    [21] LAMMENS T M, DE BIASE D, FRANSSEN M C R, et al. The application of glutamic acid α-decarboxylase for the valorization of glutamic acid[J]. Green Chemistry, 2009, 11(10): 1562-1567.

    [22] 焦陽, 汪建敏, 楊勝遠, 等. 固定化唾液鏈球菌生產(chǎn)γ-氨基丁酸的研究[J]. 核農(nóng)學報, 2009, 23(6): 1026-1031.

    [23] TAKAHASHI C, SHIRAKAWA J, TSUCHIDATE T, et al.Robust production of gamma-amino butyric acid using recombinant Corynebacterium glutamicum expressing glutamate decarboxylase from Escherichia coli[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2012, 51(3): 171-176. DOI:10.1016/j.enzmictec.2012.05.010.

    [24] MATSUKAWA S, UENO H. Analysis of intron-exon positioning on glutamate decarboxylase and its relation with evolution[J]. Journal of Biological Macromolecules, 2007, 7(3): 35-48.

    [25] GREWAL J, KHARE S K. 2-Pyrrolidone synthesis from γ-aminobutyric acid produced by Lactobacillus brevis under solid-state fermentation utilizing toxic deoiled cottonseed cake[J]. Bioprocess & Biosystems Engineering, 2017, 40(1): 145-152. DOI:10.1007/s00449-016-1683-9.

    [26] DIVYASHRI G, PRAPULLA S G. Mass transfer characterization of gamma-aminobutyric acid production by Enterococcus faecium CFR 3003: encapsulation improves its survival under simulated gastrointestinal conditions[J]. Bioprocess & Biosystems Engineering, 2015,38(3): 569-574. DOI:10.1007/s00449-014-1296-0.

    [27] 朱泉, 程金龍, 朱元召, 等. 產(chǎn)γ-氨基丁酸屎腸球菌的篩選及γ-氨基丁酸的定量[J]. 動物營養(yǎng)學報, 2016, 28(8): 2504-2511. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.022.

    [28] 李云, 楊勝遠, 楊韻晴, 等. 產(chǎn)γ-氨基丁酸屎腸球菌的鑒定及其谷氨酸脫羧酶酶學性質[J]. 生物技術, 2010, 20(1): 27-30. DOI:10.16519/j.cnki.1004-311x.2010.01.006.

    [29] RATANABUREE A, KANTACHOYE D, CHARERNJIRATRAKUL W, et al. Enhancement of GABA in a fermented red seaweed beverage by starter culture Lactobacillus plantarum DW12[J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2011, 14(3): 1-14. DOI:10.2225/vol14-issue3-fulltext-2.

    [30] NOMURA M, NAKAJIMA I, FUJITA Y, et al. Lactococcus lactis contains only one glutamate decarboxylase gene[J]. Microbiology, 1999,145(6): 1375-1380. DOI:10.1021/jp045667c.

    [31] ROSSETTI V, LOMBARD A. Determination of glutamate decarboxylase by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1996, 681(1):63-67. DOI:10.1016/0378-4347(96)88202-8.

    [32] 楊菁, 孫黎光, 白秀珍, 等. 異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法同時測定18 種氨基酸[J]. 色譜, 2002, 20(4): 269-371.DOI:10.3321/j.issn:1000-8713.2002.04.022.

    [33] CHRISTENSEN J E, DUDLEY E G, PEDERSEN J A, et al.Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 1999, 76: 217-246.

    [34] 楊勝遠, 陸兆新, 余勃, 等. 唾液鏈球菌嗜熱亞種Y-2產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的影響因子確立[J]. 食品科學, 2008, 29(12): 457-464.

    [35] 楊勝遠, 韋錦, 鄭燮茹. 解淀粉芽孢桿菌抗菌物質發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 食品科學, 2015, 36(11): 150-156. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201511029.

    [36] 曾鳳章, 趙霞. 田口方法及其標準化設計[J]. 機械工業(yè)標準化與質量, 2003(11): 7-9.

    [37] TENG Y, XU Y. Culture condition improvement for whole cell lipase production in submerged fermentation by Rhizopus chinensis using statistical method[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(9): 3900-3907.

    [38] 趙玉萍, 徐巖, 朱春. 田口設計優(yōu)化耶氏酵母生產(chǎn)γ-癸內酯[J].食品工業(yè)科技, 2012, 33(22): 326-330. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.22.080.

    猜你喜歡
    乙酸鈉檸檬酸球菌
    添加脫氫乙酸鈉導致面包有毒?
    小蘇打檸檬酸自制清潔劑
    一株禽源糞腸球菌的分離與鑒定
    分光光度法測定污水處理用乙酸鈉含量的研究
    檸檬酸中紅外光譜研究
    乙酸鈉結構研究
    煤炭與化工(2021年1期)2021-02-26 05:26:48
    結節(jié)病合并隱球菌病的研究進展
    IL-33在隱球菌腦膜炎患者外周血單個核中的表達及臨床意義
    一株副球菌對鄰苯二甲酸酯的降解特性研究
    光催化Fe(Ⅲ)/檸檬酸降解諾氟沙星
    應用化工(2014年1期)2014-08-16 13:34:08
    亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 日韩国内少妇激情av| av福利片在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 看免费av毛片| 精品免费久久久久久久清纯| 午夜a级毛片| 亚洲国产欧美网| 俄罗斯特黄特色一大片| 免费看a级黄色片| 精品福利观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产视频一区二区在线看| 日本vs欧美在线观看视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 黄片播放在线免费| 女性生殖器流出的白浆| 真人做人爱边吃奶动态| 成人国产一区最新在线观看| 久久精品国产综合久久久| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲片人在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品免费一区二区三区在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 88av欧美| 成年版毛片免费区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲精品一区av在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久久久久大精品| av中文乱码字幕在线| 激情在线观看视频在线高清| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 搡老岳熟女国产| 欧美不卡视频在线免费观看 | 无遮挡黄片免费观看| 夫妻午夜视频| 成人黄色视频免费在线看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲av片天天在线观看| 一级片'在线观看视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲伊人色综图| 香蕉久久夜色| 99精品久久久久人妻精品| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 午夜免费成人在线视频| av电影中文网址| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产熟女午夜一区二区三区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产三级在线视频| www.熟女人妻精品国产| 欧美成狂野欧美在线观看| 嫩草影院精品99| 波多野结衣高清无吗| 不卡一级毛片| netflix在线观看网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品国产高清国产av| av天堂久久9| 亚洲成国产人片在线观看| 香蕉丝袜av| 88av欧美| av视频免费观看在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品久久电影中文字幕| 在线观看免费日韩欧美大片| 香蕉丝袜av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 成年人免费黄色播放视频| 午夜a级毛片| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美日韩乱码在线| 国产一区二区三区视频了| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 热re99久久国产66热| 一级作爱视频免费观看| 久久性视频一级片| 中亚洲国语对白在线视频| 麻豆av在线久日| 欧美激情高清一区二区三区| a级片在线免费高清观看视频| 搡老岳熟女国产| 一区福利在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久久久九九精品影院| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 老鸭窝网址在线观看| 一进一出好大好爽视频| 身体一侧抽搐| av免费在线观看网站| svipshipincom国产片| 叶爱在线成人免费视频播放| 美女大奶头视频| 手机成人av网站| 少妇的丰满在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲成人久久性| 高潮久久久久久久久久久不卡| tocl精华| 十八禁网站免费在线| 久久久国产欧美日韩av| 激情视频va一区二区三区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 麻豆成人av在线观看| 老司机亚洲免费影院| 一级毛片精品| 中文字幕人妻熟女乱码| 嫩草影院精品99| 亚洲少妇的诱惑av| 午夜91福利影院| 亚洲一区高清亚洲精品| av网站免费在线观看视频| 一级a爱片免费观看的视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 黄色丝袜av网址大全| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲精品一二三| 亚洲精品国产区一区二| 欧美成人午夜精品| 一二三四在线观看免费中文在| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲国产精品合色在线| 人妻久久中文字幕网| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产91精品成人一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲avbb在线观看| 91国产中文字幕| 90打野战视频偷拍视频| av中文乱码字幕在线| 97人妻天天添夜夜摸| 高清av免费在线| 日韩大码丰满熟妇| 男女之事视频高清在线观看| 波多野结衣高清无吗| 成人永久免费在线观看视频| 国产激情欧美一区二区| 久久精品国产综合久久久| 高清欧美精品videossex| 久久热在线av| 在线观看免费高清a一片| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 一区二区三区激情视频| 一本综合久久免费| 一级毛片女人18水好多| 国产高清国产精品国产三级| 国产在线精品亚洲第一网站| 两个人看的免费小视频| 99精品在免费线老司机午夜| 最近最新中文字幕大全电影3 | 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精华一区二区三区| 日韩视频一区二区在线观看| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲精品一二三| 欧美日本中文国产一区发布| 免费高清在线观看日韩| 99精国产麻豆久久婷婷| 91av网站免费观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品av久久久久免费| 国产有黄有色有爽视频| 久久人妻熟女aⅴ| a级毛片在线看网站| 在线观看免费午夜福利视频| 最新在线观看一区二区三区| 成人黄色视频免费在线看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| av片东京热男人的天堂| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 天堂中文最新版在线下载| 91成年电影在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 十八禁人妻一区二区| 久久香蕉激情| www国产在线视频色| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 99国产精品99久久久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 不卡一级毛片| 久久国产乱子伦精品免费另类| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品久久久精品久久久| 91在线观看av| 我的亚洲天堂| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲精品一二三| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产精品国产高清国产av| 真人做人爱边吃奶动态| 免费在线观看日本一区| 国产激情欧美一区二区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| tocl精华| 免费av毛片视频| 超碰成人久久| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩有码中文字幕| 精品国产一区二区久久| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产主播在线观看一区二区| 老司机在亚洲福利影院| 欧美日韩精品网址| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 男人舔女人的私密视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久 | 97碰自拍视频| 精品人妻在线不人妻| av在线天堂中文字幕 | 久久久久久久久中文| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲三区欧美一区| 亚洲av美国av| 一区二区三区精品91| 淫妇啪啪啪对白视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 成人三级黄色视频| 国产亚洲欧美98| www.精华液| 免费看十八禁软件| 91国产中文字幕| 黑丝袜美女国产一区| 黄片大片在线免费观看| 亚洲视频免费观看视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 夜夜夜夜夜久久久久| 大型黄色视频在线免费观看| 久久久国产成人免费| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲专区字幕在线| 人人妻人人澡人人看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 狂野欧美激情性xxxx| 久久中文看片网| 欧美丝袜亚洲另类 | 一级片免费观看大全| 男人舔女人的私密视频| 亚洲专区中文字幕在线| 成人国产一区最新在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日本a在线网址| 在线观看一区二区三区激情| 精品高清国产在线一区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产成人系列免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产伦人伦偷精品视频| 久久久国产欧美日韩av| 成人国语在线视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 免费人成视频x8x8入口观看| 午夜日韩欧美国产| www日本在线高清视频| 国产国语露脸激情在线看| 天天影视国产精品| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| netflix在线观看网站| 亚洲一区二区三区不卡视频| 一区二区三区国产精品乱码| 丰满迷人的少妇在线观看| 咕卡用的链子| 国产激情欧美一区二区| 我的亚洲天堂| 欧美乱色亚洲激情| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产精品香港三级国产av潘金莲| 高清毛片免费观看视频网站 | 18美女黄网站色大片免费观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美另类亚洲清纯唯美| 18禁美女被吸乳视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 免费少妇av软件| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲午夜理论影院| 男女高潮啪啪啪动态图| 操出白浆在线播放| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 两人在一起打扑克的视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产熟女午夜一区二区三区| 大型av网站在线播放| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 一区二区日韩欧美中文字幕| 午夜两性在线视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 日韩欧美三级三区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 18禁观看日本| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美日韩精品网址| 少妇 在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 久久精品91蜜桃| 亚洲色图av天堂| 午夜免费鲁丝| 精品久久久久久久久久免费视频 | 69精品国产乱码久久久| 亚洲人成伊人成综合网2020| 99香蕉大伊视频| 18禁美女被吸乳视频| 国产一区二区在线av高清观看| 制服人妻中文乱码| 国产成人av激情在线播放| 久久久久久久久中文| 国产精品久久久久成人av| 多毛熟女@视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲熟女毛片儿| 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品综合久久久久久久免费 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 男人操女人黄网站| 午夜影院日韩av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 最好的美女福利视频网| 免费高清视频大片| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 天堂动漫精品| 久久精品国产清高在天天线| 国产免费av片在线观看野外av| 丁香欧美五月| 国产在线精品亚洲第一网站| 桃红色精品国产亚洲av| 青草久久国产| 日韩有码中文字幕| 一级作爱视频免费观看| x7x7x7水蜜桃| 欧美乱妇无乱码| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲第一青青草原| 国产成人欧美| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产伦人伦偷精品视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 天堂√8在线中文| 精品国产美女av久久久久小说| 午夜免费观看网址| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 激情在线观看视频在线高清| 国产视频一区二区在线看| 黄色 视频免费看| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久国产成人免费| 欧美中文日本在线观看视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 色综合站精品国产| 天天添夜夜摸| x7x7x7水蜜桃| 人妻久久中文字幕网| 成人精品一区二区免费| 国产片内射在线| tocl精华| 国产一区二区激情短视频| 国产一区二区激情短视频| 香蕉丝袜av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一级片免费观看大全| tocl精华| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产激情久久老熟女| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产精品久久电影中文字幕| 国产高清国产精品国产三级| xxxhd国产人妻xxx| 国产熟女xx| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久伊人香网站| 中文字幕人妻熟女乱码| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久这里只有精品19| 在线av久久热| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品国产一区二区久久| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美乱妇无乱码| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费日韩欧美在线观看| 久久精品91蜜桃| 午夜福利欧美成人| 国产有黄有色有爽视频| 制服诱惑二区| 国产精品永久免费网站| 无限看片的www在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 在线观看免费视频网站a站| 日韩精品免费视频一区二区三区| 在线免费观看的www视频| 久久久久久久精品吃奶| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产1区2区3区精品| 成年版毛片免费区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 高潮久久久久久久久久久不卡| 757午夜福利合集在线观看| 日本五十路高清| 国产一区二区激情短视频| a在线观看视频网站| bbb黄色大片| 伦理电影免费视频| 91九色精品人成在线观看| 不卡一级毛片| 国产av在哪里看| 美女高潮到喷水免费观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 香蕉丝袜av| 久久久久精品国产欧美久久久| 日本欧美视频一区| 午夜老司机福利片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 成人亚洲精品一区在线观看| 婷婷丁香在线五月| 一级毛片高清免费大全| 国产成人欧美| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久人妻av系列| 亚洲av五月六月丁香网| 久久久久久免费高清国产稀缺| 岛国在线观看网站| 亚洲精品在线观看二区| 国产成年人精品一区二区 | 亚洲性夜色夜夜综合| 精品乱码久久久久久99久播| av超薄肉色丝袜交足视频| 婷婷丁香在线五月| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲精品国产区一区二| 日韩欧美三级三区| 午夜免费激情av| 91麻豆av在线| 国产亚洲精品一区二区www| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 免费在线观看完整版高清| 男人的好看免费观看在线视频 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 欧美日韩瑟瑟在线播放| 村上凉子中文字幕在线| www.www免费av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 9热在线视频观看99| 午夜a级毛片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日本五十路高清| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲av成人一区二区三| 久久亚洲精品不卡| 在线天堂中文资源库| 女人精品久久久久毛片| 中文字幕最新亚洲高清| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 成人三级黄色视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 免费看十八禁软件| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 在线观看免费视频网站a站| 国产av精品麻豆| av天堂久久9| 色老头精品视频在线观看| 久久狼人影院| 最近最新免费中文字幕在线| 91麻豆av在线| 最近最新中文字幕大全电影3 | 精品无人区乱码1区二区| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲国产精品sss在线观看 | 18禁观看日本| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产精品影院久久| 久久久久久久午夜电影 | 午夜福利,免费看| 色综合站精品国产| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美乱色亚洲激情| www.自偷自拍.com| 超色免费av| 级片在线观看| 老汉色∧v一级毛片| av在线播放免费不卡| 日韩欧美一区视频在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 国产亚洲欧美精品永久| 免费日韩欧美在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 日本免费a在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品国产国语对白av| 亚洲精品一二三| 国产欧美日韩一区二区精品| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜激情av网站| 狠狠狠狠99中文字幕| 热re99久久国产66热| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产人伦9x9x在线观看| 久久狼人影院| 精品欧美一区二区三区在线| 91字幕亚洲| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久国产精品影院| 午夜亚洲福利在线播放| 国产成人精品久久二区二区免费| 十八禁网站免费在线| 欧美大码av| 在线观看一区二区三区| 一进一出抽搐动态| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 成人精品一区二区免费| 免费av毛片视频| 夫妻午夜视频| 午夜福利欧美成人| 久久草成人影院| 一区福利在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 大香蕉久久成人网| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产黄色免费在线视频| 国产乱人伦免费视频| 日本a在线网址| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 9热在线视频观看99| 99riav亚洲国产免费| ponron亚洲| 亚洲人成伊人成综合网2020| www.自偷自拍.com| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲三区欧美一区| 在线观看舔阴道视频| 国产三级在线视频| 美女午夜性视频免费| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久国产亚洲av麻豆专区| 免费高清视频大片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 免费看a级黄色片| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 少妇的丰满在线观看| 久久 成人 亚洲| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 中文字幕最新亚洲高清| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产精品偷伦视频观看了| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久国产乱子伦精品免费另类| 99国产精品一区二区蜜桃av| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美日韩一级在线毛片| 热99re8久久精品国产| 久久人人97超碰香蕉20202| www.www免费av| 国产极品粉嫩免费观看在线| 高潮久久久久久久久久久不卡| 91成年电影在线观看| 日日夜夜操网爽| av在线天堂中文字幕 | 成熟少妇高潮喷水视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 很黄的视频免费| 亚洲成人久久性| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久久国产成人免费| 日韩国内少妇激情av| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产成人av激情在线播放|