藏靈菇牦牛酸乳發(fā)酵過程中乳酸菌和酵母菌對品質(zhì)的作用

龍興瑤，李 鍵，謝 婕，趙 欣，王洪偉，張 玉，索化夷,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；2.重慶第二師范學(xué)院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067；3.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

藏靈菇是由數(shù)種乳酸菌、酵母菌、醋酸菌和霉菌共生而成的西藏特有酸乳發(fā)酵劑[1]，其發(fā)酵的酸乳具有改善腸道菌群，增強胃腸道功能[2]、降低血清總膽固醇和甘油三酯、保護肝臟[3]、清除自由基[4]，抗氧化[5]，延緩衰老[6]、預(yù)防改善動脈粥樣硬化[7]等功能，其分泌的胞外多糖能抑制癌細胞增殖，具有抗腫瘤作用[8]。且藏靈菇發(fā)酵的酸乳與普通酸乳在口感和風(fēng)味上具有較大差別，因為藏靈菇發(fā)酵酸乳是酵母菌和乳酸菌共同發(fā)酵而成，所以藏靈菇發(fā)酵酸乳中有其特有的醇香味及起泡性[9]。

作為發(fā)酵劑，藏靈菇中的乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過程中發(fā)揮了主要作用，目前有針對乳酸菌和酵母菌的種類和發(fā)酵特性的研究，其研究結(jié)果表明，藏靈菇中的乳酸菌主要為乳桿菌屬、乳球菌屬、雙歧桿菌屬、微球菌屬，酵母菌主要為假絲酵母屬、魯維酵母屬和酵母屬[10]。藏靈菇發(fā)酵酸乳過程中，乳酸菌和酵母菌的新陳代謝產(chǎn)物能抑制有害菌的生長，酵母菌能分解乳糖，產(chǎn)生維生素促進乳酸菌生長，同時產(chǎn)生的半乳糖能保護乳酸菌細胞免受乳酸濃度的阻礙。乳酸菌能促進釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母的生長，釀酒酵母和乳酸菌共同接種有利于保持產(chǎn)品冷藏期間活菌數(shù)的穩(wěn)定，菌株之間可能存在共生作用[11]。藏靈菇作為發(fā)酵劑的發(fā)酵過程中，乳酸菌和酵母菌各自發(fā)揮的作用還尚未研究清楚。為研究藏靈菇發(fā)酵酸乳中乳酸菌和酵母菌的發(fā)酵特性，明確乳酸菌和酵母菌在酸乳發(fā)酵過程中各自對品質(zhì)、口感所產(chǎn)生的影響，選用實驗室保藏藏靈菇進行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，用放線菌酮和青鏈霉素分別抑制發(fā)酵過程中的酵母菌和乳酸菌，測定并比較正常發(fā)酵酸乳、抑制乳酸菌和酵母菌發(fā)酵酸乳的酸度、乙醇含量、氨基酸態(tài)氮、質(zhì)構(gòu)、游離氨基酸、有機酸、VB1和VB2含量等相關(guān)指標。結(jié)果可指導(dǎo)藏靈菇發(fā)酵酸乳標準的制定，也可保證藏區(qū)牧民家庭式藏靈菇發(fā)酵酸乳的品質(zhì)，對藏靈菇發(fā)酵酸乳產(chǎn)業(yè)起到推動作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏靈菇菌粒為實驗室保藏，采樣于西藏。

牦牛奶粉 紅原牦牛乳業(yè)有限責(zé)任公司；放線菌酮、青鏈霉素、茚三酮 北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、乙酸鈉、甲酸、乙酸、磷酸二氫銨、溴百里香酚藍、氫氧化鈉、重鉻酸鉀、甲醛 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8800氨基酸分析儀 日立（中國）有限公司；DY-09 PHS-3C酸度計 成都世紀方舟科技有限公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；XDB-C18高效液相色譜柱 安捷倫科技有限公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀英國SMS公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵工藝

將3.6 g牦牛奶粉加入30 mL水中混勻，30 ℃預(yù)熱，巴氏殺菌（63 ℃、30 min），冷卻至室溫，接種5%的發(fā)酵劑在37 ℃條件下發(fā)酵10 h后放入4 ℃冷庫，后熟24 h。

1.3.2 抑制發(fā)酵條件

按照不同發(fā)酵時間（2、6、10、22、34 h）和發(fā)酵方式分別發(fā)酵藏靈菇酸乳。分別取0.001、0.002、0.004、0.006 g的放線菌酮溶解于100 mL的原料乳中，按1.3.1節(jié)方法進行發(fā)酵，取發(fā)酵10 h的發(fā)酵乳，按GB 4789.15—2010《食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》[12]，GB 4789.35—2010《食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》[13]分別對酸乳中的酵母菌和乳酸菌計數(shù)，并計算酵母菌的抑制率。吸取0.3、0.5、1.0、1.5 mL的青鏈霉素混合液（青霉素10 kU/mL，鏈霉素10 mg/mL）溶于100 mL的原料乳中進行發(fā)酵，然后取發(fā)酵10 h的發(fā)酵乳，按GB 4789.15—2010、GB 4789.35—2010分別對酸乳中的酵母菌和乳酸菌計數(shù)，并計算乳酸菌的抑制率。

1.3.3 滴定酸度的測定

根據(jù)GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》[14]，進行滴定酸度的測定。

1.3.4 氨基酸態(tài)氮含量的測定

根據(jù)GB 5009.30—2003《醬油衛(wèi)生標準的分析方法測定》[15]，進行氨基酸態(tài)氮含量的測定。

1.3.5 乙醇含量測定

根據(jù)GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法的測定》[16]，進行乙醇含量的測定。

1.3.6 質(zhì)構(gòu)特性測定

選用A/BE探頭對藏靈菇發(fā)酵牦牛酸乳的硬度、稠度、黏聚性和黏性指數(shù)等質(zhì)構(gòu)特性進行測定[17]。其中探頭選擇直徑為35 mm壓力盤，設(shè)定下降速率為10 mm/s，測試和提升速率為1 mm/s，測試深度為發(fā)酵酸奶總高度的70%，記錄速率為200 mg/kg。

1.3.7 游離氨基酸含量的測定

準確稱取樣品400 mg于18 mm×180 mm試管中，向盛有樣品的試管中加入7 mL的鹽酸（6 mol/L），振蕩混勻。用酒精噴燈把該試管口下1/3處拉細到4～6 mm，抽真空10 min后封管。處理過的試管置（110±1）℃恒溫烘箱中沙浴水解22 h，拿出冷至室溫，搖勻過濾，取1 mL濾液于50 mL燒杯中，用60 ℃恒溫水浴蒸干濾液，加入0.02 mol/L鹽酸稀釋6 倍，用0.22 μm濾膜過濾上機分析。

分析周期為53 min；分離柱（4.6 mm×60 mm）柱溫設(shè)為70 ℃，柱壓7.678 MPa，洗脫液以0.4 mL/min流速流經(jīng)此柱；反應(yīng)柱柱溫135 ℃、柱壓0.982 MPa，茚三酮及茚三酮緩沖液以0.35 mL/min流速流經(jīng)此柱；進樣體積為20 μL。

1.3.8 乳酸、乙酸、檸檬酸含量的測定[18]

稱取發(fā)酵乳試樣約5 g（精確到0.000 1 g）于50 mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，超聲5 min，搖勻，濾紙過濾后，吸取濾液過0.45 μm濾膜后作為樣液，供高效液相色譜測定。

色譜柱選用Agilent XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.1 mol/L磷酸二氫銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 2.4，過0.45 μm濾膜）和甲醇；流速為甲醇0.03 mL/min，磷酸二氫銨溶液0.57 mL/min；檢測波長220 nm；色譜柱溫度35 ℃；進樣體積10 μL。

1.3.9 VB1含量的測定[19]

稱取5～10 g（精確至0.01 g）試樣于100 mL三角瓶中，加60 mL的0.1 mol/L鹽酸充分搖勻，用棉花塞和牛皮紙封口，放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在121 ℃保持30 min，待冷卻至40 ℃以下后取出，輕搖數(shù)次；用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)pH值至4.0左右，加入2.0 mL混合酶液，搖勻后置于37 ℃的培養(yǎng)箱中過夜；將酶解液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，濾紙過濾，取濾液備用。取上述濾液10.00 mL于25 mL具塞比色管中，加入5 mL堿性鐵氰化鉀，充分混勻后，加10.00 mL正丁醇，強烈振蕩后靜置約10 min，充分分層，吸取正丁醇相（上層）于4 000～6 000r/min離心5 min，取上清液經(jīng)有機微孔濾膜過濾，供進樣用。

選用C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.05 mol/L乙酸鈉溶液和色譜級甲醇，體積比為65∶35；流速為1.0 mL/min；檢測波長：激發(fā)波長375 nm，發(fā)射波長435 nm；進樣量20 μL。

1.3.10 VB2含量的測定[20]

稱取5～10 g（精確至0.01 g）試樣于100 mL三角瓶中，加60 mL 0.1 mol/L鹽酸充分搖勻，用棉花塞和牛皮紙封口，放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在121 ℃保持30 min，待冷卻至40 ℃以下后取出，輕搖數(shù)次；用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)pH值至4.0左右，加入2.0 mL混合酶溶液搖勻后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜；將酶解液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，用定量濾紙過濾，取濾液再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取濾液備用。

選用C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.05 mol/L乙酸鈉溶液和甲醇，體積比為65∶35；流速設(shè)為1.0 mL/min；檢測波長：激發(fā)波長為462 nm，發(fā)射波長為522 nm；進樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌和乳酸菌的抑制率結(jié)果

表1 添加青鏈霉素發(fā)酵酸乳的菌落計數(shù)Table1 Colony counts of Lactobacillus and yeast in yoghurt with penicillin

表2 添加放線菌酮發(fā)酵酸乳的菌落計數(shù)Table2 Colony counts of yoghurt with cycloheximide

通過對正常發(fā)酵和添加不同量抑制劑發(fā)酵酸奶的菌落計數(shù)分析，由表1、2可以發(fā)現(xiàn)，添加0.004 g/100 mL放線菌酮的發(fā)酵酸乳，對其進行酵母菌計數(shù)，抑制率達到100%，在相同條件下對酸乳中的乳酸菌進行計數(shù)，對乳酸菌無明顯的抑制作用。添加0.5 mL/100 mL青鏈霉素的發(fā)酵酸乳，對乳酸菌進行計數(shù)，抑制率達到89.7%，在相同條件下對酸乳中的酵母菌進行計數(shù)，對酵母菌無明顯的抑制作用。因此選擇0.004 g/100 mL的放線菌酮抑制酵母菌，0.5 mL/100 mL的青鏈霉素抑制乳酸菌。

2.2 3 種發(fā)酵條件對滴定酸度的影響

酸乳的酸度是衡量發(fā)酵劑發(fā)酵性能的主要指標之一，當(dāng)酸度達到一定的數(shù)值之后，酸乳便會凝固。對比圖1中3 種不同發(fā)酵方式，在整個發(fā)酵過程中，抑制酵母菌發(fā)酵的樣品與正常發(fā)酵樣品的變化趨勢基本無差別，而抑制乳酸菌發(fā)酵的樣品，其滴定酸度明顯低于前兩種。藏靈菇酸乳在2～10 h的發(fā)酵過程中，正常發(fā)酵和抑制酵母菌發(fā)酵樣品的滴定酸度由21 °T增加至60 °T，而抑制乳酸菌的樣品只由18 °T增加至22 °T，最終滴定酸度為正常發(fā)酵滴定酸的1/3，這說明乳酸菌是影響酸乳發(fā)酵過程中滴定酸度最主要的因素。

圖1 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過程中滴定酸度變化Fig. 1 Changes in titratable acidity of yogurt during fermentation under different conditions

2.3 3 種發(fā)酵條件對乙醇含量的影響

圖2 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過程中乙醇含量變化Fig. 2 Changes in alcohol content of yogurt during fermentation under different conditions

藏靈菇牦牛發(fā)酵乳屬于Ⅳ型發(fā)酵乳[21]，其獨特的醇香味可能是與酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生乙醇有關(guān)。而乙醇主要是酵母在無氧狀態(tài)下，由乙醇脫氫酶還原乙醛生成[22]。對比圖2中3 種發(fā)酵方式，抑制酵母菌生長的發(fā)酵酸乳，其乙醇含量值明顯低于正常發(fā)酵和抑制乳酸菌發(fā)酵的發(fā)酵樣品。藏靈菇3 種發(fā)酵方式樣品終點的乙醇含量分別為4.44、3.68、2.77 g/kg，抑制酵母菌發(fā)酵的酸乳其乙醇含量約為正常發(fā)酵組的1/2，因此，酵母菌對酸乳發(fā)酵過程中乙醇的產(chǎn)生發(fā)揮了主要的作用。但抑制乳酸菌發(fā)酵的酸乳乙醇含量略低于正常發(fā)酵，說明乳酸菌可能會影響酵母菌產(chǎn)生乙醇。

2.4 3 種發(fā)酵條件對氨基酸態(tài)氮含量的影響

蛋白質(zhì)在微生物水解酶的作用下分解成各種氨基酸，從而使酸乳獲得更豐富的香味，因此氨基酸態(tài)氮的含量在一定程度上可代表酸乳的感官品質(zhì)。如圖3所示，在前發(fā)酵過程的終點10 h時，藏靈菇的氨基酸態(tài)氮含量分別為223.18、202.99、73.56 mg/100 g，說明抑制酵母菌和抑制乳酸菌的發(fā)酵方式對樣品中氨基酸態(tài)氮的含量是有影響的。對比整個發(fā)酵過程，抑制酵母菌的發(fā)酵方式，其氨基酸態(tài)氮含量的變化趨勢與正常發(fā)酵的一致，但抑制了乳酸菌發(fā)酵的樣品，其氨基酸態(tài)氮含量明顯降低，由65 mg/100 g下降為53 mg/100 g，約為正常發(fā)酵的30%，說明蛋白酶主要來源于乳酸菌，乳酸菌對氨基酸態(tài)氮的產(chǎn)生起到了關(guān)鍵的作用。

圖3 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化Fig. 3 Changes in nitrogen amino acid content of yogurt during fermentation under different conditions

2.5 發(fā)酵條件對質(zhì)構(gòu)特性的影響

圖4 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過程中硬度特性變化Fig. 4 Changes in firmness of yogurt during fermentation under different conditions

圖5 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過程中稠度特性變化Fig. 5 Changes in consistency of yogurt during fermentation under different conditions

硬度和稠度反映了酸乳的爽滑性及細膩度，而黏聚性和黏性指數(shù)則代表探頭在離開酸乳時的附著力，一般情況下稠度越大的酸乳，其黏著力也較大。通過對發(fā)酵酸乳硬度、稠度、黏聚性和黏性指數(shù)的測定（圖4～7），可以模擬酸乳的口感，使酸乳在咀嚼特性方面有更好的量化指標[23-24]。在進行酸奶質(zhì)構(gòu)的測定時，抑制乳酸菌活性的發(fā)酵方式，在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵酸乳都未凝乳，因此未對其進行質(zhì)構(gòu)測定。可能原因為抑制乳酸菌的繁殖，使酸乳產(chǎn)酸量不足，酸乳中的蛋白質(zhì)達不到凝固的酸度等電點，凝膠結(jié)構(gòu)無法形成。

圖6 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過程中黏聚性變化Fig. 6 Changes in cohesiveness of yogurt during fermentation under different conditions

圖7 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過程中黏性指數(shù)變化Fig. 7 Changes in viscosity index of yogurt during fermentation under different conditions

綜合分析抑制酵母菌活性和正常發(fā)酵兩種發(fā)酵方式下各樣品的硬度、稠度、黏聚性和黏性指數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)抑制酵母菌活性后，酸奶在質(zhì)構(gòu)特性方面并沒有出現(xiàn)太大的變化，質(zhì)構(gòu)各項指數(shù)變化趨勢的曲線幾乎相同，但各項指標均與正常發(fā)酵組存在一些差別。這說明雖然酵母菌對發(fā)酵酸乳的質(zhì)構(gòu)存在一些影響，但乳酸菌才是酸乳發(fā)酵過程中最重要的影響因素。

2.6 3 種發(fā)酵條件對游離氨基酸含量的影響

游離氨基酸可直接被人體吸收，吸收速率快，利用率高[25]。如表3所示，在3 種發(fā)酵方式中，含量最高的氨基酸為脯氨酸和絲氨酸，而非高薇等[26]實驗結(jié)果中的谷氨酸、脯氨酸和賴氨酸。單抑制酵母菌發(fā)酵的條件下，藏靈菇發(fā)酵酸乳的氨基酸總含量與正常發(fā)酵方式相差較小，單抑制乳酸菌的發(fā)酵方式所產(chǎn)生的游離氨基酸與正常發(fā)酵方式相比相差較大，特別是賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸7 種必需氨基酸在抑制乳酸菌以后含量明顯下降，只有正常發(fā)酵組的一半左右。說明乳酸菌在發(fā)酵過程中對游離氨基酸的產(chǎn)生起主要作用，酵母菌影響較小。

表3 不同發(fā)酵條件藏靈菇酸乳發(fā)酵過程中游離氨基酸含量變化Table3 Changes in free amino acid content of yogurt during fermentation under different conditions

2.7 3 種發(fā)酵條件對有機酸含量的影響

圖8 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過程中各有機酸含量變化Fig. 8 Changes in organic acid contents of yogurt during fermentation under different conditions

有機酸作為乳酸風(fēng)味的重要來源，其中乳酸與滴定酸呈正相關(guān)，乙酸和檸檬酸也可分解為相關(guān)的酯、氨基化合物或某些醇類物質(zhì)，為酸乳帶來豐富而清爽的口感[27]。從圖8結(jié)果來看，抑制乳酸菌之后的酸乳其乳酸、乙酸在整個發(fā)酵過程中幾乎沒有產(chǎn)生，檸檬酸也逐漸減少，這與根據(jù)周劍忠等[28]的研究結(jié)果相似，說明乳酸菌是影響乳酸和乙酸生成的重要因素。乳酸菌和酵母菌對檸檬酸的影響并沒有明顯的規(guī)律，但總量都低于正常發(fā)酵。

2.8 3 種發(fā)酵條件對VB1、VB2含量的影響

圖9 不同發(fā)酵方式藏靈菇酸乳發(fā)酵過程中VB1和VB2變化Fig. 9 Changes in VB2 content of yogurt during fermentations under different conditions

如圖9所示，抑制乳酸菌后，VB1明顯下降，由20 μg/100 g下降為18 μg/100 g；VB2含量在后期有小幅提升，且趨勢與正常發(fā)酵相似。抑制酵母菌活性的酸乳，其VB2含量相對較低，特別是在發(fā)酵后期VB2更明顯降低，由168 μg/100 g下降為157 μg/100 g。說明乳酸菌與VB1的生成有關(guān)，酵母菌與VB2的生成有關(guān)。

3 討 論

藏靈菇作為藏區(qū)特有的發(fā)酵劑，其發(fā)酵的酸乳風(fēng)味獨特，適口性良好，對身體有益。但現(xiàn)階段的開發(fā)利用和發(fā)酵研究程度不夠。本實驗采用抑制酵母菌和乳酸菌的方式研究乳酸菌和酵母菌分別對發(fā)酵的影響。測定結(jié)果中正常發(fā)酵酸乳滴定酸度最高值為60 °T，與Zhang Heping等[29]報道的市售酸奶滴定酸度一致。與王則臻等[30]和賈磊[31]的研究所得結(jié)果類似，使用乳酸菌進行發(fā)酵在前幾個小時內(nèi)酸度值會明顯增加，而用酵母菌發(fā)酵時滴定酸度值變化不大，說明在發(fā)酵前期，乳酸菌迅速生長，分解乳糖產(chǎn)生乳酸等一系列酸性物質(zhì)，使酸乳滴定酸度急劇升高，但環(huán)境酸度過低會抑制乳酸自身生長[32]，所以到發(fā)酵后期，酸乳的滴定酸度保持相對穩(wěn)定，可見乳酸菌是提高酸乳酸度的主要微生物。Cheirsilp等[33]研究也發(fā)現(xiàn)，乳糖陽性酵母菌和乳糖陰性酵母菌的存在會促進乳糖繼續(xù)代謝，能使產(chǎn)品的pH值有所上升，這也能夠解釋在抑制乳酸菌的發(fā)酵酸乳中酵母菌能夠增加滴定酸度的原因。

藏靈菇發(fā)酵酸乳中含有的酵母菌在進行無氧呼吸產(chǎn)生乙醇的同時可以為產(chǎn)品帶來特殊的香氣和風(fēng)味[34]，在抑制乳酸菌生長的樣品中，酵母菌有更充足的生長環(huán)境，活性更高，產(chǎn)生乙醇的速率增加，到發(fā)酵后期，高含量的乙醇會抑制酵母菌的活性，因此前10 h乙醇含量增加迅速到后期乙醇含量相對穩(wěn)定，相反，在抑制酵母菌生長的樣品中乙醇含量明顯減少，因此在藏靈菇發(fā)酵酸乳中所產(chǎn)生的醇香物質(zhì)來源為酵母菌。此結(jié)果與賈磊[31]前4 h快速產(chǎn)乙醇存在一些差別，分析原因可能為本實驗中發(fā)酵酸乳環(huán)境中含氧量較低，酵母菌從最開始便進行無氧呼吸產(chǎn)生乙醇，而沒有進行有氧呼吸大量繁殖。雖然酵母菌是乙醇的主要來源，但抑制酵母菌發(fā)酵的酸乳乙醇含量略低于正常發(fā)酵酸乳的乙醇含量，可能原因是放線菌酮的添加對酵母菌也有部分抑制。

氨基酸態(tài)氮含量為判斷發(fā)酵程度的一項指標，實驗中發(fā)現(xiàn)抑制乳酸菌發(fā)酵后酸乳中的氨基酸態(tài)氮明顯減少，可能因為乳酸菌能產(chǎn)生更多分解蛋白質(zhì)的酶類，這些酶能將蛋白質(zhì)分解為肽和氨基酸，氨基酸態(tài)氮的含量就會增加。3 種條件的發(fā)酵酸乳10 h后氨基酸態(tài)氮含量都略有下降，可能原因是菌株自身增殖又利用了生成的氨基酸作為氮源所致[35]。

乳酸菌對酸乳的質(zhì)構(gòu)起到至關(guān)重要的作用，因為抑制乳酸菌發(fā)酵酸乳產(chǎn)酸不夠，無法達到蛋白質(zhì)的等電點，無法形成凝乳狀態(tài)。但也能發(fā)現(xiàn)酵母菌對發(fā)酵酸乳的質(zhì)構(gòu)起到一定的作用，可能原因是酵母菌會影響乳酸菌和明串珠菌胞外多糖的產(chǎn)生來影響發(fā)酵酸乳的質(zhì)構(gòu)[36-37]。與祝靜[38]測定的羊酸奶發(fā)酵酸乳相比，藏靈菇發(fā)酵酸乳在質(zhì)構(gòu)指標上有明顯的優(yōu)勢，說明藏靈菇中蘊含的乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的物質(zhì)對質(zhì)構(gòu)的貢獻優(yōu)于其他發(fā)酵劑。Soukoulis等[39]的研究表示，較高的pH值能使酸乳質(zhì)構(gòu)更加穩(wěn)定，這與本實驗有類似的結(jié)果，在發(fā)酵酸乳達到10 h，滴定酸度不斷積累，pH值不斷降低的情況下，質(zhì)構(gòu)的穩(wěn)定性出現(xiàn)波動，尤其是硬度和稠度出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)折。

游離氨基酸通過脫羧、脫氨、氨基轉(zhuǎn)移和硫酸化等代謝途徑形成短鏈脂肪酸、酯類、醛類及其他成分。本研究中抑制乳酸菌發(fā)酵后7 種必需氨基酸含量下降，可能原因是乳酸菌所生成的酶對必需氨基酸的影響較大，抑制乳酸菌發(fā)酵后這些酶類無法產(chǎn)生，因此無法形成相對應(yīng)的氨基酸。

有機酸影響著酸乳酸爽的口感，乳酸菌通過HMP途徑產(chǎn)生乳酸和乙酸，因此抑制乳酸菌生長后酸乳中乙酸與乳酸明顯降低。抑制酵母菌活性后乙酸含量略微高于正常發(fā)酵組，可能原因是酵母菌生長過程中會消耗乙酸。田輝等[40]利用高效液相色譜法測定酸奶中的有機酸，乳酸的含量顯著多于乙酸、檸檬酸且乳酸含量與滴定酸度呈明顯的正相關(guān)與本實驗結(jié)果相同。發(fā)酵酸乳的乙酸含量在整個發(fā)酵過程中是呈下降趨勢的，這是由于乙酸是乙酸乙酯等各類風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，在發(fā)酵過程中，乙酸被不斷利用以合成各類風(fēng)味物質(zhì)，因此在整個發(fā)酵過程中乙酸的含量顯示為下降狀態(tài)。檸檬酸的含量也有所下降，這是由于檸檬酸是很多風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)[41]，在酸乳后發(fā)酵時期檸檬酸轉(zhuǎn)化形成其他風(fēng)味物質(zhì)，使得檸檬酸的含量有所下降。

B族維生素是許多活性酶的輔酶，VB1、VB2可以調(diào)節(jié)糖類和蛋白質(zhì)的代謝。從本研究的結(jié)果可以看出，抑制乳酸菌后VB1損失較大，抑制酵母菌后VB2損失較大，特別是發(fā)酵后期，這與陸婧[42]的研究類似。乳酸菌影響VB1可能的原因為VB1是乳酸菌活動所產(chǎn)生的，雖然VB1會因為陽光和乳酸菌的消耗有一定量的損失，但是某些乳酸菌也會合成和促進B族維生素的合成，如乳酸乳球菌和雙歧桿菌[43-44]。而酵母菌的各種生理代謝與VB2的產(chǎn)生有關(guān)，特別是在發(fā)酵后期，VB2明顯減少，一方面是因為酵母菌是影響VB2的主要微生物，另一方面是缺乏酵母菌的競爭性生長，乳酸菌消耗掉一部分VB2。

國內(nèi)外大量的研究以發(fā)酵酸乳的發(fā)酵特性作為研究基礎(chǔ)，例如酸度、質(zhì)構(gòu)特性、香氣物質(zhì)等，結(jié)合感官評價綜合評價酸乳的品質(zhì)。特別是Han Xue等[45]研究中發(fā)酵酸乳的酸度、硬度、黏度、黏聚性均與本實驗中酸乳相似。趙欣[46]和陳潔[47]等研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸態(tài)氮和游離氨基酸的含量直接影響發(fā)酵產(chǎn)品感官評價中的香氣評分。

綜上，在藏靈菇發(fā)酵酸乳過程中，酵母菌對酸乳中乙醇和VB2的生成起到關(guān)鍵作用，乳酸菌對酸乳酸度、氨基酸態(tài)氮含量、質(zhì)構(gòu)、游離氨基酸、乳酸和乙酸含量、VB1含量起到關(guān)鍵作用。酵母菌和乳酸菌可以互相促進生長，酵母菌可以促進乳酸菌產(chǎn)生乳酸，乳酸菌能促進酵母菌產(chǎn)生乙醇。

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