明膠—甲基丙烯?；z作為生物材料在組織修復方面的應用進展

林歡歡　劉肇興　吳興等

[摘要]最近十年對細胞生物材料的研究已經轉向三維研究。通過3D細胞培養(yǎng)模擬天然細胞外環(huán)境，水凝膠提供了良好的3D生物材料組織支架。因此，明膠甲基丙烯酰（Gelat in methacryloyl，GelMA）水凝膠最近受到越來越多的關注。這主要由明膠的固有生物活性和可光交聯(lián)水凝膠的優(yōu)點。各種研究表明GelMA是一種多功能基質，可用于從血管系統(tǒng)到軟骨和骨工程組織的類似物。生物支架和生物培養(yǎng)方法的結合對于證明細胞功能或構建形狀保持至再生組織的發(fā)展是很必要的。GelMA在該過程中具有關鍵的指導作用，并且有利于加快臨床相關應用的發(fā)展。

[關鍵詞]明膠甲基丙烯酰；細胞培養(yǎng)；生物材料；組織工程

[中圖分類號]R318.08 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）08-0130-04

在過去的十年中，細胞培養(yǎng)研究已經見證了二維向三維的轉變。3D培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)更接近于天然組織中的細胞。這種轉變主要體現(xiàn)在水凝膠應用在組織工程中的生物材料方面的研究。在組織工程中，使用這種理想的類似于天然細胞外基質（ECM）的水凝膠刺激細胞形成具有機械整合性的功能組織，以確保移植物在植入后能繼續(xù)存活。普通的生物材料通常達不到強度和機械可調性的要求，因此在當今的生物材料研究中，迫切需要一種兼有生物活性和理化性能的水凝膠。而GelMA與其他可用的水凝膠生物材料相比，能滿足這些要求。這種3D細胞培養(yǎng)平臺，不僅非常接近天然的細胞外環(huán)境，而且它為保持組織3D結構提供了可能性。3D組織類似物的這種發(fā)展反映了從單層細胞培養(yǎng)到盤狀水凝膠中的3D培養(yǎng)，到經歷生物成熟的生物制造3D構建體，最終可應用于修復體內組織缺陷和美容整形。

本文對GelMA用作細胞包封水凝膠作一概述，其可用作多種組織工程的基礎材料。重點描述了在最先進的生物制造方法中獲得復雜組織類似物中GelMA的應用和其在功能方面的發(fā)展，以及這種載細胞水凝膠基于工程構造的再生醫(yī)學方面的用途。

1細胞包封

新興的生物制品領域的研究目的是使用活細胞、生物活性分子、生物材料、細胞聚集體或雜交細胞材料制作生物功能性分層的3D構建體。

1.1明膠基水凝膠的細胞包封：明膠廣泛應用于食品工業(yè)及醫(yī)藥加工行業(yè)。在組織工程和再生醫(yī)學中，明膠是用于藥物遞送工程“智能”水凝膠的基礎材料。明膠使用領域的增加源于它擁有的生物材料特征，包括生物相容性，生物降解性，低成本和易于操作。此外，它在臨床上，常規(guī)作為血漿擴張劑和一些蛋白質制劑，也用作疫苗中的穩(wěn)定劑。與膠原蛋白相比，由于熱變性，明膠顯示出很弱的抗原性。重要的是，用于細胞附著和基質金屬蛋白酶（MMP）敏感性降解位點的膠原蛋白的生物活性序列保留在明膠骨架中。因此，通過整合素介導的細胞粘附和細胞介導的酶降解可促進細胞的遷移，增殖和分化。將明膠用作生物材料，可通過共價交聯(lián)方法克服其在體溫下不穩(wěn)定的缺點。未修飾的明膠可用其他方式交聯(lián)，以形成共價網絡，例如化學交聯(lián)或酶交聯(lián)?；瘜W改性后的共價交聯(lián)與直接交聯(lián)技術相比，向明膠主鏈中添加官能團是一種具有高度控制水凝膠設計和性能的交聯(lián)策略。然而，只有少數(shù)方法適合同時交聯(lián)和細胞包封。與間接酶交聯(lián)相反，光交聯(lián)能對交聯(lián)過程的時間和空間進行控制，這對于創(chuàng)建空間復雜的組織類似物至關重要。因此，人們通常使用紫外光（UV）和可見光（VIS）進行光交聯(lián)。此外，一些雙重修飾可被用來改善細胞行為或增強組織成型性能。大多數(shù)報道的文獻使用光引發(fā)劑Irgacure2959，與其他光引發(fā)劑相比其細胞毒性相對較低。

1.2明膠甲基丙烯酰水凝膠的細胞包封：GelMA由Van den Bulcke和同事于2000年首次引入。隨后，由于其固有的生物活性和物理化學的可控性，使它在組織工程領域中引起相當大的熱度。GelMA的水凝膠設計中的第一步是選擇適當程度的明膠的官能化（Do F）。這可以通過控制用于合成GelMA大分子單體的甲基丙烯酸酐的量來調控，以此在（光）引發(fā)劑和能量源的條件下制造水凝膠。生物材料可以依據(jù)設計所需的物理化學性質進一步調控以形成特定結構。比如，可以通過增加聚合物的濃度（常規(guī)為10%）或使用接近80%的Do F的高度功能化的凝膠來阻止細胞擴散，這歸功于整個水凝膠的廣泛交聯(lián)。通常，具有20%～80%的Do F的GelMA大分子單體可產生性能穩(wěn)定的水凝膠，且隨著甲基丙烯?；〈陌俜直仍黾樱缮捎捕雀?、孔徑更小的水凝膠。在批量合成GelMA時，光交聯(lián)的光強度，曝光時間和引發(fā)劑濃度都會影響所得水凝膠的性質。GelMA網絡結構易受酶降解，特別是易受由（嵌入的）細胞分泌的MMP局部降解。所有的設計參數(shù)都需要對每個特定用途進行仔細的調控，包括硬度，降解概況和所得水凝膠中的預期細胞行為。由于GelMA性質的這種可調性，因此適用于組織工程中的許多領域。實際上，GelMA已經應用于再生神經組織、血管、軟骨、骨、皮膚、骨骼肌、心臟、肝和腎等多個方面，通過各種生物加工相關技術能夠得到理想的生物材料模型。

1.3通過微流體策略制造細胞包封模型：現(xiàn)在已經開發(fā)了微流體方法，以將細胞封裝在GelMA液滴中，用于組織工程的各個方面。此外，引入微流控技術可制造具有包封細胞功能的光交聯(lián)GelMA，它表明能通過凝膠電泳法在電極表面誘導細胞排列的辦法是可行的。纖維中的這種3D模型可以用作創(chuàng)建組織，以直接和高通量的方式創(chuàng)建高度可行的含細胞的微量元件。在拉伸包封細胞的纖維后，實現(xiàn)與構建體中細胞的接洽。

1.4使用軟立體光刻技術進行細胞包封：GelMA也用于各種軟光刻技術中以制造能進行細胞包封的微組織模型。成功構建了以mm為尺度單位，低至100mm的分辨率，能進行細胞封裝的GelMA微組織模型。通過使用光掩膜，以GelMA的微通道網絡為基礎構建出骨樣水凝膠模型。這些方法證明細胞的局部沉積可促進骨組織的血管生成和成骨。與微流體相反，立體光刻法能夠直接構建3D結構的無掩模光圖案化技術。設計由軟件處理并分層，通過動態(tài)立體光刻技術，可以制備具有各種形狀的100～250mm薄切片，在細胞包封8小時后細胞存活率能高達80%。然而，立體光刻僅限于含有一種生物材料（混合物）和均勻分布的細胞成型。endprint

1.5以含細胞的GelMA為組織油墨的生物打?。撼斯饪谭椒ㄖ猓M織類似物也可以進行生物打印。以GelMA為油墨的3D細胞來打印組織結構，最近已經成為組織工程中非常有前景的一種方法。研究人員表明，有可能通過生物打印方法直寫出不同架構的GelMA結構模型。有的研究將粘度增強成分混入生物材料中可以改善用于印刷GelMA的流變學特性。例如，將吉蘭糖膠或透明質酸添加到GelMA前體溶液中優(yōu)化了油墨的流變性能以更好維持印刷成品的形狀?；蛘呤褂迷鰪娚锊牧线M行共沉積。熱塑性塑料如聚己內酯（PCL）在可以同時發(fā)揮這兩種功效，即限定GelMA模體邊界的同時增強構建體的機械性能。第三種提高細胞負載GelMA水凝膠的印刷性的方法取決于明膠固有的溫度依賴性溶膠-凝膠轉變。將收集板上的印刷纖維在沉積后立即冷卻至5℃，以此來增強GelMA的物理交聯(lián)和提供足夠的機械完整性來完成逐層打印。為了制作復雜的解剖形狀的構建體，可將聚乙烯醇（PVA）和藻酸鹽的混合成分已經與GelMA和PCL共同打印。在制成后，除去在水溶液中被用作支撐懸垂幾何形狀的臨時結構的混合材料，可獲得臨床相關尺寸的多孔結構，且在制造過程不影響細胞活力。

2 GelMA特性的改良

除了GelMA的自身性質，也可以進行生物刺激來改進細胞行為或增強機械性質。GelMA的機械性能可以是可定制的，所以可以制成一定強度和硬度的凝膠。

2.1可增強組織特異性功能的GelMA復合結構：在復合材料中，可以實現(xiàn)增強GelMA水凝膠生物材料功能的協(xié)同作用。例如，GelMA復合材料是用磷酸鈣、多糖、透明質酸和ECM顆粒等物質開發(fā)的。此外，合成聚合物，如PCL、聚乙二醇（PEG）和納米粒子也已經有與GelMA結合的研究。

2.2機械加固：然而，某些生物應用需要維持其生物功能性而選擇低硬度時，這類水凝膠的使用就顯示出它的局限性。在這些情況下，可以將GelMA與增強生物材料共混（混合打印），即將GelMA結合到3D打印支架原料上，然后凝膠和支架材料之間的共價結合，用于3Dfp刷微細纖維增強細胞的凝膠，與單獨的水凝膠或纖維網相比，硬度增加了54倍。

3 Gel MA水凝膠的應用進展

GelMA對于許多組織工程策略的廣泛應用強調其多功能性。然而，需要確定哪種GelMA組合類似物最適合。這可能在很大程度上取決于復合結構中GelMA的作用，其可以給予明膠的組織特異性功能。

3.1 GelMA在工程血管網絡的應用：組織工程主要需要克服的難題是生物材料制作組織支架中，氧和營養(yǎng)物質的供應不足。通過引入微小血管網絡組織工程材料可以解決這個問題。首先，通過使用支架，在構建體構建之后，創(chuàng)建一個相對直徑較大的血管床，用來接種內皮細胞。第二，較小的毛細血管樣結構通過內皮細胞在大塊材料中的封裝而產生。后一種方法是基于內皮細胞自我組裝去毛細血管樣結構的內在能力。

3.2 GelMA在組織分化領域的應用：除了用于血管化載有細胞構建體的這種普通用途之外，GelMA已經廣泛用于組織特異性領域。對于心臟斑塊的工程領域，將GelMA與碳納米管和氧化石墨烯微球結合，使之具有導電性。與純GelMA上的培養(yǎng)物相比，在2D復合貼片上新生大鼠心肌細胞的功能評估顯示出了更高的同步跳動速率和較低的激發(fā)閾值。在肝組織工程中，肝細胞微團聚體以高通量方式增值并包封在GelMA中，含有包封肝細胞的GelMA可以作為3D肝印刷的生物源。在骨組織工程中，GelMA與磷酸鈣和人類成骨細胞樣細胞（MG63）結合能增加機械強度，但目前沒有研究顯示其對成骨性有顯著影響。軟骨是另一種承重組織，透明質酸直接以濃度依賴性方式影響軟骨細胞分化。

3.3組織結構與應用：組織類似物的結構主要由（生物）功能和機械方面決定。目前，所面臨的主要挑戰(zhàn)在于將微組織模型擴大到臨床相關尺寸。制作生物組織的復雜性在增加，所需要的數(shù)量也是挑戰(zhàn)。例如，構建體的技術難點在于整個構建體的營養(yǎng)物質轉移和保持所需的機械穩(wěn)定性。此外，組織結構的一個重要方面是包含工程模擬組織的復雜性。例如，Kolesky和同事在不同的生物群中分離了不同的組織成分（脈管系統(tǒng)，ECM和特異性細胞）。生物制品組織的這種長期行為對于確定需要施加以獲得功能性人體組織類似物的建筑復雜性的水平將是非常有價值的。

3.4從前臨床角度看GelMA：在臨床研究中獲得了有希望的結果，證明了GelMA用于臨床應用的潛力。軟骨再生是生物材料降解和新組織替代之間平衡的一個例子，這是組織工程中的關鍵和最具挑戰(zhàn)性的目標之一。GelMA降解性可以對靶組織的重塑速率進行限制。增加Do F將提高機械性能并延長所需的降解周期。對于臨床應用，作為基礎材料的GelMA必須滿足幾個要求：首先，必須考慮GelMA及其降解產物，特別是寡聚甲基丙烯酸酯的體外和體內生物相容性。臨床應用中的其他挑戰(zhàn)是不同批次的變化及與動物衍生材料相關的可能的疾病傳播。盡管如此，臨床級明膠現(xiàn)在在臨床上常規(guī)使用，這表明其益處超過了風險。

4 Ge l MA水凝膠的未來方向

目前，將組織構建體應用到臨床所面臨的主要挑戰(zhàn)是將再生方法轉變?yōu)橐欢ǖ囊?guī)范程序，同時保留預期的再生能力。該轉化從GelMA合成和生物打印延伸到細胞培養(yǎng)方案。例如，GelMA交聯(lián)的金標準現(xiàn)在是Irgacure 2959和UV光。然而，為了避免UV光的相關缺點，可以選擇可替代的交聯(lián)體系，例如通過VIS，可以提高GelMA的交聯(lián)度。細胞的封包進一步使GelMA的應用復雜化，因為組織工程產品需要符合高級治療藥物產品（ATMP）的立法，這種藥物產品仍然是一個技術不成熟的領域。因此，GelMA不僅是將半合成生物材料轉化為ATMPs的先驅，而且還可以作為一種“過渡技術”，這樣可以進一步加速技術從實驗室到臨床的應用。在此過程中，GelMA可作為下一代組織類似物設計的基石。

5結論

GelMA作為一種組織工程生物材料近年來已經吸引人們越來越多的注意力，這歸功于明膠骨架為細胞提供生物學支撐并且維持特定的物理化學性質。目前，對此類復合水凝膠的研究主要集中在3D構建體的生成或者非生物構建體的長期細胞性能研究。

目前所面臨的最大難題是如何將構建體尺寸匹配成臨床相關大小。因此，GelMA的未來研究應集中于生物制造與組織工程的互相配合，在技術成熟的前提做出尺寸合適的功能性組織等價物。智能幾何形狀的設計、各種材料和組織類型的組合、復雜組織的維持以及推出能參考的指南將是下一步的研究重點。

總之，GelMA是一種有價值、開創(chuàng)性的能用作生物材料以加速組織修復及各種整形美容方面的臨床解決辦法。endprint