盧巖,康健
(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科,遼寧 錦州 121001)
喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一,位于頭頸部腫瘤發(fā)病率第2位,其中絕大多數(shù)組織類型是鱗狀細胞癌[1]。喉鱗癌的確切病因及發(fā)病機制尚不清楚,一般認為可能由吸煙、飲酒、空氣污染、病毒感染、癌基因激活和抑癌基因失活等多種因素綜合作用所致[2]。本研究觀察Smad4蛋白在老年患者喉鱗癌組織中的表達,探討其在喉鱗癌進展中的作用,以及與喉鱗癌臨床病理特征的關系,為臨床判斷老年喉鱗癌患者的預后提供實驗依據(jù)。
選取2002年1月-2013年12月在錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科行喉鱗狀細胞癌手術患者的手術切除組織石蠟標本(喉鱗癌/癌旁正常黏膜組織),結合病例資料完整性、隨訪情況、標本保存情況,最終納入65對患者標本作為研究對象進行免疫組織化學法檢測。所有腫瘤組織石蠟標本經(jīng)2位病理科醫(yī)師確診為喉鱗狀細胞癌,癌旁正常黏膜組織石蠟標本確診為正常黏膜。本實驗由本院醫(yī)學倫理委員會審查批準。
入選標準:①患者均為首次就診,年齡≥60歲;②術前未行放療、化療及生物治療;③除原發(fā)腫瘤外,無其他部位腫瘤;④無高血壓、糖尿病、嚴重心臟病等疾病史;⑤無肝炎、梅毒、艾滋病、結核等傳染病病史;⑥無家族遺傳疾病。
1.2.1 主要試劑鼠抗人Smad4單克隆抗體Smad4(SC-7966)(美國Santa Cruz公司),非免疫山羊血清(湖北武漢博士德生物工程有限公司),即用型快捷免疫組織化學法Maxvision試劑盒(鼠)、加強型DAB顯色試劑盒(福建福州邁新生物技術開發(fā)有限公司)。
1.2.2 免疫組織化學法石蠟組織樣本4μm連續(xù)切片,二甲苯替代物溶液脫蠟3次,100%~70%梯度酒精逐級水化,檸檬酸鹽緩沖液高壓修復,3%過氧化氫甲醇溶液室溫封閉,非免疫山羊血清封閉,滴加鼠抗人Smad4一抗(1∶100)4℃孵育 過夜,滴加即用型快捷免疫組織化學法Maxvision試劑盒(鼠)二抗室溫孵育20min,DAB顯色,蘇木精復染,鹽酸酒精分化,氨水堿化返藍,70%~100%梯度酒精逐級進行脫水,二甲苯替代物溶液透明,中性樹膠封片。
采用雙盲法閱片,由2位有經(jīng)驗者獨立完成。采用半定量方法,每張切片選擇≥5個視野(400倍)觀察分析:①每個視野陽性細胞計數(shù)2遍,取其平均值,再求5個視野的平均值,作為該切片的陽性細胞數(shù),陽性細胞數(shù)<10%計1分,11%~50%計2分,51%~80%計3分,>81%計4分。②每張切片的著色濃度:無著色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,深黃色為3分。將每張切片①②評分相加,得到該切片免疫組織化學法評分:1分為陰性(-),2、3分為弱陽性(+),4、5分為陽性(++),6、7分為強陽性(+++)。評分<3分定義為免疫組織化學法染色陰性,4~7分定義為免疫組織化學法染色陽性。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料以率(%)表示,用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
附圖 Smad 4在喉鱗癌和癌旁正常黏膜組織中的表達 (免疫組織化學染色×400)
Sma 4蛋白主要表達于細胞漿或細胞核,呈黃色或深黃色(見附圖)。65例喉鱗癌組織中,Smad 4表達陽性18例,陽性表達率為27.692%。65例癌旁正常黏膜組織中,Smad 4表達陽性43例,陽性表達率為66.154%,經(jīng)χ2檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.304,P=0.000),喉鱗癌組織中Smad 4蛋白陽性表達率低于癌旁正常黏膜組織中。
Smad 4在高分化喉鱗癌中有部分表達,在中、低分化喉鱗癌中表達減少。高分化組Smad 4陽性表達率與中、低分化組比較,經(jīng)χ2檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),中、低分化喉鱗癌組織低于高分化喉鱗癌組織。有頸淋巴結轉移的喉鱗癌組Smad 4陽性表達率與無淋巴結轉移的喉鱗癌組比較,經(jīng)χ2檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),有淋巴結轉移的喉鱗癌組低于無淋巴結轉移的喉鱗癌組。而Smad 4表達與患者的性別、原發(fā)部位、T分期及臨床分期無關(P>0.05)。見附表。
附表 不同病理臨床特征患者的Smad 4蛋白陽性率比較
喉癌是喉部最常見的惡性腫瘤,居呼吸道腫瘤的第2位,發(fā)病率近年來呈上升趨勢,同時隨著人口老齡化嚴重,老年喉癌患者比重也逐漸增加。老年喉癌患者有高發(fā)病率、高復發(fā)性、晚期比例高、術后并發(fā)癥多等特點[3],因此老年喉癌患者的治療不同于其他年齡段,應采取以手術為主的綜合治療方案。
喉鱗癌中癌基因激活與抑癌基因失活及其相互作用所致的平衡失調是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子基礎。Smad4最初是作為胰腺癌的腫瘤抑制因子被發(fā)現(xiàn),后來發(fā)現(xiàn)其表達缺失與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關[4-6]。LIU等[7]研究指出,Smad 4在乳腺導管癌中的表達低于正常乳腺組織,表達水平隨腫瘤分化程度降低而下降。呂曉紅等[8]觀察Smad 4在人乳腺癌組織內的表達,無淋巴結轉移組Smad 4陽性表達率高于有淋巴結轉移 組,陽性組淋巴管數(shù)密度低于陰性組。Smad 4可能通過調節(jié)血管內皮生長因子C蛋白的表達,而抑制乳腺癌淋巴管生成和淋巴道轉移。
本實驗中,Smad 4蛋白主要表達于細胞漿或細胞核,呈黃色或深黃色。Smad 4蛋白在喉鱗癌組織中的陽性表達率低于癌旁正常黏膜組織。Smad 4在高分化喉鱗癌中有部分表達,在中、低分化喉鱗癌中表達減少,其陽性表達率隨喉鱗癌病理分化程度的降低而下降;有頸淋巴結轉移的喉鱗癌組Smad 4陽性表達率低于無淋巴結轉移的喉鱗癌組;Smad 4表達與患者的年齡、性別、原發(fā)部位、T分期和臨床分期無關。姜晶等[9]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn),乳腺癌組織中Smad 4表達降低,其陽性表達率低于乳腺纖維腺瘤及癌周組織。李建章等[10]探討Smad 4在膀胱癌中的表達,及其與淋巴結轉移的關系,無淋巴結轉移組Smad 4陽性表達率高于有淋巴結轉移組,淋巴管數(shù)密度陽性組Smad 4陽性表達率低于陰性組,Smad 4的表達與淋巴管生成及轉移呈負相關。ZHANG等[11]結合臨床病理參數(shù)分析Smad 4的診斷和預測價值,發(fā)現(xiàn)Smad 4高表達患者生存時間長于低表達患者,且多因素分析證實,Smad 4可作為預測生存的獨立指標。由此可見,Smad 4在喉鱗癌演變中扮演了重要角色,發(fā)揮抑癌基因的作用。
綜上所述,在老年喉鱗癌患者中,Smad 4作為抑癌基因,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,將為腫瘤的早期診斷、分子靶向治療及預后評估提供新的思路和理論依據(jù)。
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