經(jīng)導(dǎo)管復(fù)制兔急性腸系膜動脈血栓栓塞模型的可行性研究

李娟，劉德斌，何尤夫，許官學(xué)，劉西平，劉漢林，沈長銀

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.診斷學(xué)實驗室，2.心內(nèi)科， 貴州 遵義 563003）

腸系膜動脈栓塞是由于栓子進入腸系膜動脈后造成動脈阻塞所致的疾病，栓子多源自于風(fēng)濕性心臟病合并心房顫動、近期心肌梗死、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及感染性心內(nèi)膜炎附壁血栓等患者[1-5]。腸系膜動脈栓塞起病急、進展迅速，如處理不及時病死率較高，因而探討其治療手段與治療時機在臨床上極為重要[6-8]。本實驗用小型動物兔經(jīng)導(dǎo)管成功復(fù)制急性腸系膜動脈血栓栓塞動物模型，期望為急性腸系膜動脈栓塞的基礎(chǔ)研究及治療提供可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

健康雄性新西蘭大白兔20只，質(zhì)量2.0～2.5 kg，由遵義醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。Artis Zee Ceiling DSA機（德國西門子公司），Merit? Manifold三接頭高壓注射器（美國麥瑞通公司），6F橈動脈鞘管（美國強生Cordis公司），BMW導(dǎo)絲（美國雅培公司），Runthrough導(dǎo)絲及超滑導(dǎo)絲（日本Terumo公司），6F人冠狀動脈右3.5指引導(dǎo)管（美國美敦力公司），凝血酶凍干粉（杭州杭康藥業(yè)有限公司），3%戊巴比妥鈉、8%硫化鈉及伊文思藍(lán)染液購自美國Sigma公司，碘海醇造影劑（泰州揚子江藥業(yè)集團）。

1.2 方法

1.2.1 麻醉及兔股動脈置管實驗兔術(shù)前禁食12 h，禁飲10 h，稱重，耳緣靜脈緩慢注射3%戊巴比妥鈉（1～2 mg/kg）麻醉后移至兔臺上，取仰臥位固定。腹股溝區(qū)用8%硫化鈉去毛，右側(cè)腹股溝區(qū)局部備皮、消毒和鋪巾，切開皮膚，依次分離皮膚、筋膜及肌肉組織，鈍性分離股動脈鞘，暴露股動脈、股靜脈和股神經(jīng)。動脈兩端予以橡皮筋拉緊阻斷血流，采用兒科頭皮穿刺針直視下穿刺，穿入動脈血管后，調(diào)整穿刺針方向，沿穿刺針內(nèi)推入Runthrough導(dǎo)絲至腹主動脈，沿Runthrough導(dǎo)絲緩慢置入經(jīng)石蠟油潤滑涂抹過的6F橈動脈鞘管，經(jīng)動脈鞘抽取動脈血10 ml，鞘管內(nèi)10 ml肝素鹽水抗凝封管。

1.2.2 兔自體血栓的制備將所抽取的兔動脈血10 ml加入凝血酶10 u，混合均勻后，37℃溫箱孵育1 h制備成大塊血栓。采用手術(shù)刀片將血栓分切為塊狀血栓，再根據(jù)腸系膜動脈直徑切成3～4 mm血栓，備用。見圖1。

1.2.3 腸系膜動脈造影兔全身充分肝素化后，在X線透視并在超滑導(dǎo)絲導(dǎo)引下，經(jīng)6F橈動脈鞘管送入人冠狀動脈右指引導(dǎo)管至降主動脈，退出超滑導(dǎo)絲，排氣，調(diào)整指引導(dǎo)管頭端，高壓手推造影劑行非選擇性降主動脈造影，腸系膜動脈顯影后，調(diào)整指引導(dǎo)管頭端至腸系膜上動脈開口造影，清晰記錄相應(yīng)腸系膜上動脈造影圖片，觀察腸系膜動脈走行，以便進行下一步動脈栓塞術(shù)。

1.2.4 兔腸系膜動脈血栓栓塞模型的復(fù)制造影結(jié)束后，先將BMW導(dǎo)絲頭端塑性，導(dǎo)絲沿指引導(dǎo)管緩慢通過腸系膜上動脈至動脈遠(yuǎn)端分支，沿導(dǎo)絲緩慢輕柔推送指引導(dǎo)管使其進入腸系膜動脈內(nèi)，退出BMW導(dǎo)絲，用5 ml注射器輕輕吸取自制血栓1枚，注入三接頭高壓注射器內(nèi)，用注射器緩慢推碘海醇造影劑，使血栓注入腸系膜動脈內(nèi)，栓塞成功后即刻行腸系膜上動脈造影，記錄腸系膜上動脈血流變化情況。動脈造影見腸系膜上動脈內(nèi)有血栓影，同時遠(yuǎn)端動脈不顯影為栓塞模型復(fù)制成功。見圖2。

1.2.5 生化檢查分別于術(shù)前、栓塞后1和2 h抽兔動脈血檢測D-2聚體、肌酸磷酸激酶（creatine phosphate kinase，CK）水平。

1.2.6 病理學(xué)檢查術(shù)后2 h剖腹探查，肉眼觀察小腸色澤、擴張及蠕動情況，快速（時間＜1min）于股動脈鞘內(nèi)注射2%伊文思藍(lán)染色5 ml，肉眼觀察栓塞效果。術(shù)畢處死動物，切取缺血腸管及正常腸管行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE），鏡下觀察腸管各層形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化。見圖3。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較做隨機區(qū)組設(shè)計的方差分析（球不對稱時校正），兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自體血栓

從兔股動脈鞘抽取10 ml動脈血與10 u凝血酶混勻，放入37℃溫箱孵育1 h，形成大塊血栓，用手術(shù)刀片切成3～4 mm大小血栓，肝素鹽水10 ml封管。見圖1。

圖1 自體血栓

2.2 模型復(fù)制情況

模型組10只兔中8只成功復(fù)制腸系膜上動脈栓塞模型，2只動脈置管失敗，模型組成功率為80.0%（8/10）；對照組10兔成功動脈動脈置管7只，失敗2只，麻醉時死亡1只，對照組股動脈置管成功率為70.0%（7/10）。見圖 2。

2.3 排便觀察

模型組復(fù)制成功的8只兔術(shù)后連續(xù)觀察2 h，其陸續(xù)出現(xiàn)排未成形稀便，未見血便。對照組兔排成形大便。

2.4 病理結(jié)果

2.4.1 大體肉眼觀模型組缺血腸段呈暗紅色，管腔略擴張，蠕動減弱或消失；對照組腸管顏色鮮紅，腸蠕動正常。

2.4.2 伊文思藍(lán)染色結(jié)果模型組缺血腸段未見著色，正常血運腸段染為藍(lán)色；對照組腸管藍(lán)染。見圖3。

2.4.3 光鏡與對照組比較，模型組腸黏膜充血、局部區(qū)域出血，腸黏膜腺上皮及固有膜內(nèi)可見固縮或碎裂的細(xì)胞核分布，部分區(qū)域腺體結(jié)構(gòu)破壞，伴中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤。見圖4。

2.5 模型組D-2聚體及CK的變化

模型組D-2聚體和CK水平在各時間點比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，D-2聚體術(shù)后1 h高于術(shù)前和術(shù)后2 h（P＜0.05），D-2聚體術(shù)前和術(shù)后2 h比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后1和2 h的CK水平高于術(shù)前（P＜0.05），術(shù)后1 h與術(shù)后2 h CK水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見附表。

圖2 股動脈置管步驟

圖3 兩組兔腸管

圖4 兩組光鏡下腸黏膜圖片 （HE）

附表 不同時間點模型組D-2聚體及CK的變化（n =8，±s）

附表 不同時間點模型組D-2聚體及CK的變化（n =8，±s）

術(shù)前 0.27±0.07 1 569.00±826.00術(shù)后1 h 0.41±0.04 2 071.50±1 024.50術(shù)后2 h 0.28±0.06 2 077.50±1 017.50 F值 6.875 13.456

3 討論

目前已有多種腸系膜動脈急性栓塞動物模型復(fù)制方法，多數(shù)實驗通過開腹線栓法或銀夾夾閉法復(fù)制腸系膜動脈栓塞模型，該類方法無法模擬臨床上栓子栓塞腸系膜上動脈的病理生理過程，不能進行后續(xù)溶栓或抽吸取栓治療研究，且需要對實驗動物進行開腹手術(shù)，損傷大，容易感染，對臨床研究幫助有限。隨著介入技術(shù)的發(fā)展，近年來，有研究以介入方法成功復(fù)制豬、狗等大型動物的模型[9-11]。KARABULUT等[4]用兔子復(fù)制急性腸系膜缺血模型，但至今國內(nèi)未見報道成功復(fù)制小型動物的經(jīng)皮介入腸系膜動脈栓塞模型。其主要原因是小型動物股動脈插管不易、介入造影中尋找腸系膜上動脈較難，以及器械技術(shù)等。

人冠狀動脈指引導(dǎo)管可進行腸系膜動脈造影及栓塞[12]。本實驗?zāi)Ｐ徒M共用10只兔，成功復(fù)制模型8只，模型成功率高，方法較簡單，容易掌握。模型復(fù)制過程中的注意事項：需要使用經(jīng)皮冠狀動脈介入導(dǎo)絲進行引導(dǎo)，指引導(dǎo)管進入腸系膜動脈內(nèi)，避免注入血栓時引起其他部位誤栓塞，操作時動作要輕柔，以免損傷血管，如有動脈痙攣時可動脈內(nèi)注入硝酸甘油解除痙攣。

本實驗選用兔為實驗對象，有以下優(yōu)點：①兔成本低，大大降低實驗費用；②體外制備自體血栓，可更好地模擬腸系膜動脈栓塞疾病發(fā)生、發(fā)展過程；③使用經(jīng)皮冠狀動脈介入治療所用指引導(dǎo)管及導(dǎo)絲，將血栓準(zhǔn)確注射至腸系膜上動脈內(nèi)，該方法創(chuàng)傷較小，簡便易行，成功率高，并可進行后續(xù)溶栓取栓治療研究。

腸系膜上動脈栓塞甚至腸梗阻后CK會劇烈上升[13-14]。本實驗研究結(jié)果示，術(shù)后1 h時CK值上升。但術(shù)后1和2 h時CK結(jié)果變化不明顯，可能與梗阻時間較短、損傷較小有關(guān)。另外，本實驗中術(shù)后1 h的D-2聚體水平較術(shù)前上升。但術(shù)后2 h的D-2聚體水平下降，考慮系手術(shù)前后肝素化及使用肝素封管所致，掩蓋D-2聚體評價動脈栓塞疾病的價值。

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