氧化苦參堿對(duì)糖尿病大鼠腎組織TLR4及炎癥因子表達(dá)的影響*

肖瑛，曾令萍，張瑩瑩，王圓圓，石明雋，郭兵

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省婦幼保健院 病理科，貴 州 貴陽(yáng) 550003）

隨著研究的深入，確立了炎癥反應(yīng)在糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）中的作用，認(rèn)為DN是一種自然免疫和慢性低度炎癥性疾病[1]。基于此，探討炎癥反應(yīng)如何促進(jìn)DM腎臟纖維化的作用逐漸受到重視。Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）是一種跨膜蛋白，與腎臟 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)高度相關(guān)[2]。有研究表明，PKC信號(hào)通路參與TLR4致炎癥因子的分泌[3]。OM具有對(duì)抗炎癥、抗臟器纖維化的作用，但機(jī)制還不清楚。本研究旨在觀察OM對(duì)糖尿病（diabetes mellitus，DM）腎組織TLR4表達(dá)及炎癥反應(yīng)的影響，探討OM抗炎、抗纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)SD大鼠24只，雄性，體重（180±20）g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0004。

1.1.2 主要試劑鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）、anti-膠原蛋白Ⅳ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，氧化苦參堿（Oxymatrine，OM）（牡丹江蓮花湖制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：100701），免疫組織化學(xué)兩步法檢測(cè)試劑、DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、一抗稀釋液、ECL、DMSO、牛血清白蛋白購(gòu)自北京碧云天生物研究所，RIPA裂解液和PMSF購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，PVDF膜、3 mm Whatman濾紙購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，anti-TLR4、anti-蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PKCα）及anti-β-actin購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（北京科盈美科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 DM大鼠 模型的復(fù)制及分組將購(gòu)買(mǎi)的大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正 常對(duì)照組（NC組）和糖尿病組（DM組）。DM組大鼠一次性尾靜脈注射溶于pH 4.5，0.01 mol/L無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的STZ，劑量為55 mg/kg。注射后72 h尾靜脈采血測(cè)血糖，以血糖值≤16.7 mm mol/L為模型復(fù)制成功。氧化苦參堿組（OM組）大鼠從DM模型復(fù)制成功次日起OM 75 mg/（kg·d）灌胃，連續(xù)16周。劑量的選擇[4]：在高、中劑量（100和50 mg/kg）均有效的前提下，選擇兩者的中間劑量（75 mg/kg），該劑量相當(dāng)于11.9 mg/（kg·d）。NC組尾靜脈注射STZ溶媒（pH 4.5，0.01 mol/L無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液）。每組8只大鼠，給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2.2 標(biāo)本的收集各組大鼠飼養(yǎng)至16周，處死前代謝籠收集24 h尿，記錄尿量。禁食6 h，采用乙醚吸入麻醉，股動(dòng)脈取血，4℃離心10min收集血清，-20℃保存供生化檢測(cè)；生理鹽水灌洗雙側(cè)腎臟，部分腎臟固定于4%多聚甲醛，制作石蠟切片，其余腎臟于-80℃保存供分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)采用氧化酶法測(cè)血清葡萄糖濃度，雙縮脲法測(cè)尿蛋白濃度，24 h尿蛋白量=尿蛋白濃度×24 h尿量，由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生化科全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.2.4 腎組織形態(tài)學(xué)觀察將多聚甲醛固定的腎組織制成3μm厚的石蠟切片，予以蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）和Masson染色，普通光鏡下觀察腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及纖維化病變。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色法采用SP法檢測(cè)TLR4（1∶50）、PKCα（1∶50）及膠原蛋白Ⅳ，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。

1.2.6 ELISA檢測(cè)按白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6） 和 腫 瘤 壞 死 因 子（tumor necrosis factor，TNF-α）ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.7 Western blot檢測(cè)Western blot檢測(cè) TLR4、PKCα及膠原蛋白Ⅳ表達(dá)。取-80℃保存的腎皮質(zhì)，在勻漿器中加入組織蛋白裂解液進(jìn)行勻漿，12 000 r/min離心20min后取上清測(cè)蛋白含量。經(jīng)SDS-PAGE分離，300 mA轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜，分別加入TLR4（1∶100）、PKCα（1∶100）及膠原蛋白Ⅳ（1∶1 000）的Ⅰ抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜后加入相應(yīng)Ⅱ抗室溫孵育1 h，用ECL顯影曝光，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)曝光，Image Lab 5.1軟件分析圖像，以β-actin蛋白條帶作內(nèi)參照，結(jié)果用靶蛋白/β-actin比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析，若方差齊，則兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及相關(guān)生化指標(biāo)

DM大鼠模型復(fù)制成功后，逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象，而OM組大鼠多飲、多食、多尿現(xiàn)象得到改善。16周處死前取血測(cè)血糖，并收集處死前1天24 h尿檢測(cè)尿蛋白。3組大鼠血糖和尿蛋白水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=44.122和7.963，P=0.000和0.004）。進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，DM組血糖和24 h尿蛋白高于NC組（P＜0.05）；OM組血糖和24 h尿蛋白較DM組減少（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 腎組織病理學(xué)變化

圖1 各組大鼠16周血糖和24 h尿蛋白變化

HE染色顯示，NC組腎臟結(jié)構(gòu)清晰完整，DM組腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞萎縮和脫落，間質(zhì)區(qū)增寬，而OM組病變明顯減輕。Masson染色顯示，NC組腎小球和腎小管完整清晰，而DM組腎臟結(jié)構(gòu)排列不清，Masson染色陽(yáng)性物質(zhì)（深藍(lán)色）明顯增多，OM組大鼠腎臟病變有不同程度減輕。見(jiàn)圖2。

2.3 大鼠腎組織中TLR4、PKCα及膠原蛋白Ⅳ的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，TLR4和PKCα主要表達(dá)于大鼠腎小管上皮細(xì)胞，在NC組大鼠腎皮質(zhì)中TLR4和PKCα表達(dá)極少，DM組可見(jiàn)大量陽(yáng)性染色（棕黃色），而OM組腎組織中TLR4和PKCα蛋白表達(dá)較DM組減少。3組大鼠腎組織中TLR4和PKCα表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.647和15.119，P=0.003和0.000）。進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，DM組TLR4和PKCα蛋白表達(dá)高于NC組（P＜0.05）；OM組腎組織中TLR4和PKCα蛋白的表達(dá)較DM組減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖3～5。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在NC組大鼠腎組織中膠原蛋白Ⅳ的棕黃陽(yáng)性染色僅少量存在于細(xì)胞間質(zhì)；DM組細(xì)胞間質(zhì)中膠原蛋白Ⅳ表達(dá)增高；OM組大鼠腎組織膠原蛋白Ⅳ表達(dá)較DM組減少。3組大鼠腎組織中膠原蛋白Ⅳ表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.758，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，DM組膠原蛋白Ⅳ表達(dá)高于NC組（P＜0.05）；OM組膠原蛋白Ⅳ表達(dá)較DM組減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖 6。

2.4 各組大鼠腎組織勻漿中IL-6和TNF-α的表達(dá)

各組大鼠腎組織勻漿上清中IL-6和TNF-α含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.368和68.423，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)， DM組IL-6和TNF-α含量高于NC組（P＜0.05）；OM組IL-6和TNF-α含量較DM組減少（P＜0.05），見(jiàn)附表。

圖2 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué) （×200）

圖3 各組大鼠腎組織中TLR4的分布及表達(dá)

圖4 各組大鼠腎組織中PKCα的表達(dá)

圖5 各組大鼠腎組織中PKCα表達(dá)比較

圖6 各組大鼠腎組織中的膠原蛋白Ⅳ分布及表達(dá)

附表 各組大鼠腎組織勻漿中IL-6和TNF-α表達(dá)水平比較（n =8，pg/μg，±s）

附表 各組大鼠腎組織勻漿中IL-6和TNF-α表達(dá)水平比較（n =8，pg/μg，±s）

注：1）與NC組比較，P ＜0.05；2）與DM組比較，P ＜0.05

NC組 2.5±0.8 9.3±1.6 DM組 4.4±0.41） 23.0±2.81）

3 討論

來(lái)自臨床和實(shí)驗(yàn)室的許多證據(jù)表明，發(fā)生在代謝紊亂與血流動(dòng)力學(xué)異?；A(chǔ)上的炎癥反應(yīng)與DN的進(jìn)行性發(fā)展關(guān)系密切[5-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，DM大鼠血糖升高的同時(shí)，出現(xiàn)大量蛋白尿，膠原蛋白Ⅳ表達(dá)增多，提示DM大鼠出現(xiàn)腎纖維化病理改變。DM大鼠腎組織中炎癥因子IL-6、TNF-α也增多，表明炎癥因子參與DN的發(fā)生、發(fā)展。

TLRs是一組參與傳遞細(xì)胞膜跨膜信號(hào)的的受體蛋白，TLR4是TLRs中關(guān)注度最高的一種。TANG等[5]研究發(fā)現(xiàn)，DN患者腎組織中TLR4高表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，且與間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度和糖化血紅蛋白呈正相關(guān)。另外在DM大鼠的研究中也發(fā)現(xiàn)，TLR4和炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白和mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組上調(diào)[8]。相反，單側(cè)腎切除后，STZ誘導(dǎo)的TLR4-/-小鼠較野生型蛋白尿減少，腎功能損害減輕，腎皮質(zhì)NF-κB活化、小管C-C趨化因子配體2的表達(dá)，以及間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少[2]。以上研究表明，TLR4與腎臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度相關(guān)，TLR4通路可能介導(dǎo)DM時(shí)腎臟的炎癥浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)中，DM組TLR4高表達(dá)，TLR4信號(hào)通路激活，促進(jìn)IL-6、TNF-α炎癥因子的釋放，提示DM大鼠腎組織中IL-6、TNF-α的產(chǎn)生與TLR4信號(hào)通路有關(guān)，并因此促進(jìn)腎間質(zhì)炎癥的發(fā)生、發(fā)展。

另有研究顯示，TLR4的配體LPS可通過(guò)對(duì)PKC的活化，最終啟動(dòng)NF-κB的轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，而且PKCα能夠加強(qiáng)中性粒細(xì)胞中TLR4介導(dǎo)的NF-κB活化[9]，利用siRNA干擾技術(shù)抑制腎小管上皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)，可減弱高糖誘導(dǎo)的IκB/NF-κB激活，提示PKC/TLR4通過(guò)抑制IκB/NF-κB信號(hào)通路，介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)腎小管炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展[10]。因此，提示PKCα可能參與TLR4依賴(lài)的信號(hào)途徑的激活。本實(shí)驗(yàn)中，免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，TLR4和PKCα主要表達(dá)于大鼠腎小管上皮細(xì)胞，在NC組大鼠腎皮質(zhì)中TLR4和PKCα表達(dá)極少；DM大鼠腎小管上皮細(xì)胞中可見(jiàn)大量陽(yáng)性染色；與NC組相比，DM組腎組織中TLR4和PKCα的表達(dá)增多，兩者的表達(dá)呈平行關(guān)系，考慮高糖可能通過(guò)激活PKCα信號(hào)通路，促進(jìn)TLR4及其下游炎癥因子的大量表達(dá)，發(fā)揮致炎、致纖維化的作用，但兩者確切的關(guān)系還需進(jìn)一步證實(shí)。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，OM干預(yù)高糖培養(yǎng)的NRK52E細(xì)胞后，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，E-鈣粘素mRNA和蛋白的表達(dá)增高，提示OM可抑制腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的發(fā)生，改善纖維化程度[11]。GUO等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，OM可以改善DN狀態(tài)下的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少糖基化終末產(chǎn)物及炎癥因子的產(chǎn)生。但OM的抗炎、抗纖維化機(jī)制還不甚清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OM組腎組織中TLR4和PKCα的表達(dá)較DM組減少，膠原蛋白Ⅳ表達(dá)下調(diào)，大鼠腎組織勻漿上清中IL-6和TNF-α含量減少，提示OM可抑制DM大鼠腎組織PKCα、TLR4的表達(dá)及炎癥反應(yīng)，減輕高糖致炎、致纖維化作用。但是PKCα是直接還是間接地促進(jìn)TLR4及其下游炎癥因子的表達(dá)增加，進(jìn)而發(fā)揮促炎、促纖維化的作用機(jī)制，還需一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)，OM可以降低DM大鼠的血糖，表明OM具有降低血糖的作用。其機(jī)制可能為：①OM可能可以刺激胰島素釋放或再生胰島β細(xì)胞，并且與OM可增加血清胰高血糖素樣肽-1有關(guān)[13]；②OM可以提高靶組織對(duì)胰島素的敏感性，可能與OM可增加骨骼肌中肌肉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4有關(guān)[14]。但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，OM可抑制高糖介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和致纖維化作用，其機(jī)制可能與OM降低血糖，抑制PKCα的信號(hào)激活，減少TLR4蛋白表達(dá)，進(jìn)而使腎組織局部炎癥因子的分泌減少，從而緩解DN纖維化病變的發(fā)生、發(fā)展。

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