血清1，25-（OH）2D3和MMP-9對(duì)哮喘患兒病情發(fā)生發(fā)展的影響

楊云，焦德清，周利

（1.四川省廣元市第三人民醫(yī)院 兒科，四川 廣元 628001；2.四川省廣元市中心醫(yī)院兒科，四川 廣元 628000；3. 四川省廣元市第四人民醫(yī)院 兒科，四川 廣元 6280 01）

哮喘是一種常見(jiàn)的慢性氣道炎癥性疾病，多個(gè)細(xì)胞及細(xì)胞組分參與其中，常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、胸悶、氣急或咳嗽等癥狀，氣道炎癥及呼吸道重塑是哮喘主要的病理生理機(jī)制。維生素D（Vitamin D，VD）是一種固醇類(lèi)衍生物，1，25-二羥基維生素D3[1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25-（OH）2D3]是其主要生物作用形式，可與受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，1，25-（OH）2D3除了可調(diào)節(jié)體內(nèi)的鈣磷平衡，還能起 到影響呼吸道重塑、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等多個(gè)功能，參與到哮喘的發(fā)病中?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）屬于蛋白水解酶家族，主要調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的代謝，可降解大部分ECM，在該家族中，MMP-9是降解ECM的最主要的成員，而呼吸道重塑過(guò)程屬于ECM的重塑，故MMP-9在氣道重塑中同樣起到了重要作用。本研究分析哮喘患兒的血清1，25-（OH）2D3及血清、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中MMP-9的水平，旨在探討兩者在哮喘的發(fā)病中的作用與意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月-2016年3月期間廣元市第三人民醫(yī)院收治的62例支氣管哮喘患兒為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組制定的兒童支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；②處于緩解期，近1個(gè)月內(nèi)未出現(xiàn)哮喘發(fā)作；③能配合完成纖支鏡檢查及支氣管肺泡灌洗術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3個(gè)月服用鈣劑或維生素D片；②合并嚴(yán)重的肝、腎、心功能不全或甲狀腺疾病或骨質(zhì)疏松；③近1個(gè)月內(nèi)服用免疫調(diào)節(jié)劑或糖皮質(zhì)激素。對(duì)所有哮喘患兒按照相關(guān)指南[1]進(jìn)行嚴(yán)重程度分級(jí)，分為輕度組（n=17）和中重度組（n=45）。并選取同期因呼吸道異物或先天畸形住院的30例患兒作為對(duì)照組，均無(wú)免疫系統(tǒng)疾病或過(guò)敏性疾病或肝腎功能不全，近1個(gè)月均未出現(xiàn)感染。觀(guān)察組患兒男41例，女21例，平均年齡（5.52±3.12）歲，平均體重（14.25±8.31）kg；對(duì)照組患兒男23例，女7例，平均年齡（4.83±3.29）歲，平均體重（12.93±8.51）kg。兩組的性別、年齡、體質(zhì)量等基線(xiàn)資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患兒及其家屬均自愿參加本研究，已簽署知情同意書(shū)，本研究已通過(guò)該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 血清與BALF的采集 所有患兒均采集5 ml靜脈血，靜置2 h后離心（2 000 r/min×15 min），留取血清，-80℃待測(cè)。觀(guān)察組患兒在進(jìn)行纖支鏡檢查后行右側(cè)肺葉的支氣管肺泡灌洗術(shù)，對(duì)照組患兒僅進(jìn)行右肺中葉或非異物側(cè)肺葉的支氣管肺泡灌洗術(shù)，具體方法為：通過(guò)支氣管鏡吸引孔注入無(wú)菌鹽水（9 g/L、37℃），灌洗2次，若體重≥20 kg，則每次灌洗量為10 ml；若體重＜ 20 kg，則每次灌洗量為5 ml，灌洗后均立即以100～150 mmHg進(jìn)行負(fù)壓吸引。

1.2.2 血清與BALF的檢測(cè) 將第1次BALF進(jìn)行病原學(xué)檢查，第2次BALF進(jìn)行離心（1 500 r/min×10 min、4℃），取上清液置于-80℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定所有患兒的血清1，25-（OH）2D3水平，以及血清、BALF的MMP-9水平。并根據(jù)血清1，25-（OH）2D3水平將所有哮喘患兒分為VD正常組（＞30μg/L，n=9）、VD不足組（20～30μg/L，n=15）及 VD 缺乏組（＜20μg/L，n=38）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若呈正態(tài)分布，則以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，多組比較用方差分析，然后用SNK q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，否則以中位數(shù)及四分位數(shù)間距表示，用非參數(shù)檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析來(lái)探討哮喘患兒血清1，25-（OH）2D3水平與血清、BALF的MMP-9水平的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀(guān)察組與對(duì)照組患兒的血清及BALF的檢測(cè)結(jié)果比較

觀(guān)察組患兒的血清1，25-（OH）2D3水平與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀(guān)察組低于對(duì)照組。觀(guān)察組血清及BALF的MMP-9水平與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀(guān)察組高于對(duì)照組。見(jiàn)表1。

2.2 不同嚴(yán)重程度哮喘患兒血清及BALF的檢測(cè)結(jié)果比較

中重度組患兒的血清1，25-（OH）2D3水平與輕度組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中重度組低于輕度組。血清及BALF的MMP-9水平與輕度組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中重度組高于輕度組。見(jiàn)表2。

2.3 不同血清VD水平患者的血清與BALF的MMP-9水平比較

如表3所示，VD正常組的血清與BALF的MMP-9水平與另外兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），VD正常組低于另外兩組，VD不足組的血清與BALF的MMP-9水平與VD缺乏組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），VD不足組低于VD缺乏組。

表1 觀(guān)察組與對(duì)照組患兒的血清及BALF的檢測(cè)結(jié)果比較 （±s）

表1 觀(guān)察組與對(duì)照組患兒的血清及BALF的檢測(cè)結(jié)果比較 （±s）

組別 血清1，25-（OH）2D3水平 血清MMP-9水平 BALF的MMP-9水平觀(guān)察組（n =62） 20.13±6.57 138.63±25.79 8.29±1.67對(duì)照組（n =30） 40.16±6.92 58.06±11.27 5.58±0.92 t值 13.473 16.337 8.285 P值 0.000 0.000 0.000

表2 中重度組與輕度組的哮喘患兒血清及BALF的檢測(cè)結(jié)果比較 （±s）

表2 中重度組與輕度組的哮喘患兒血清及BALF的檢測(cè)結(jié)果比較 （±s）

組別 血清1，25-（OH）2D3水平 血清MMP-9水平 BALF的MMP-9水平輕度組（n =17） 27.16±4.13 101.66±16.89 9.56±0.85中重度組（n =45） 17.47±5.06 152.60±20.30 7.81±1.17 t值 7.045 9.199 5.619 P值 0.000 0.000 0.000

表3 不同血清VD水平患者的血清與BALF的MMP-9水平比較 （±s）

表3 不同血清VD水平患者的血清與BALF的MMP-9水平比較 （±s）

注：1）與VD正常組比較，P ＜0.05；2）與VD不足組比較，P ＜0.05.

血清MMP-9水平 BALF的MMP-9水平VD正常組（n =9） 101.15±8.50 5.87±1.09 VD不足組（n =15） 125.37±15.871） 7.66±1.011）VD 缺乏組（n =38） 152.74±20.691）2） 9.11±1.251）2）F值 45.893 40.269 P值 0.000 0.000組別

2.4 Pearson相關(guān)分析結(jié)果

結(jié)果表明，所有哮喘患兒的血清1，25-（OH）2D3水平與血清MMP-9水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.752，P=0.000），與BALF的MMP-9水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.698，P=0.000）。

3 討論

以往多個(gè)研究提示，血VD水平的缺乏與支氣管哮喘、活動(dòng)性肺結(jié)核[2]、急性呼吸窘迫綜合征[3]、慢性阻塞性肺疾病[4]等多個(gè)呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)。本研究結(jié)果表明支氣管哮喘患兒的血清1，25-（OH）2D3水平低于支氣管畸形或異物者，并且中重度哮喘患兒的血清1，25-（OH）2D3水平低于輕度者，與國(guó)外以往研究[5]結(jié)果類(lèi)似，提示哮喘患兒容易出現(xiàn)VD缺乏或不足，且哮喘嚴(yán)重程度與VD水平有關(guān)，提高VD水平可能有助于緩解哮喘發(fā)作癥狀。GUPTA等[6]研究表明絕大部分存在激素抵抗性的支氣管哮喘患兒存在血清VD水平降低的表現(xiàn)，且其水平與哮喘嚴(yán)重程度、第1秒用力呼氣量呈正相關(guān)，與呼出氣一氧化氮量、激素使用量呈負(fù)相關(guān)。TIAN等[7]研究表明對(duì)哮喘患兒補(bǔ)充1，25-（OH）2D3可減輕炎癥反應(yīng)、降低氣道高反應(yīng)性，影響呼吸道重構(gòu)過(guò)程，從而有效緩解哮喘發(fā)作癥狀的嚴(yán)重程度，故1，25-（OH）2D3可應(yīng)用于臨床。這可能與1，25-（OH）2D3對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用、血管重塑等有關(guān)。有動(dòng)物研究[8]結(jié)果表明對(duì)哮喘大鼠模型給予1，25-（OH）2D3能降低血清IgE水平及BALF中嗜酸性粒細(xì)胞的量，促進(jìn)白細(xì)胞介素10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的分泌，抑制炎癥反應(yīng)。MOLINARI等對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外研究，發(fā)現(xiàn)VD不僅能與受體結(jié)合，通過(guò)對(duì)蛋白激酶B、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、p38等信號(hào)通路引起內(nèi)皮型一氧化氮合酶的活化，引起血管重塑，還可直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的生成，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移與增殖，維持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性。GE等[9]研究表明與VD結(jié)合蛋白基因敲除的大鼠相比，野生型大鼠更容易出現(xiàn)肺微血管滲漏及出血，提示VD可能通過(guò)與VD結(jié)合蛋白結(jié)合進(jìn)而影響肺的微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

本研究還發(fā)現(xiàn)觀(guān)察組患兒血清、BALF的MMP-9水平均高于對(duì)照組，且中重度組患兒的血清、BALF的MMP-9水平高于輕度組，提示MMP-9可能同樣參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。ECM的沉積與降解失衡是哮喘氣道結(jié)構(gòu)異常重建的重要原因，在這個(gè)過(guò)程中，MMP-9發(fā)揮了重要作用，其可降解多糖以外的大部分ECM成分。基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1（TIMP-1）是MMP-9的特異性抑制劑，在生理情況下TIMP-1與MMP-9以1︰1的比例結(jié)合，從而抑制MMP-9的活性。朱艷等[10]研究表明哮喘患兒急性發(fā)作期血MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1的比例均高于穩(wěn)定期哮喘患兒及健康者，哮喘患兒的MMP-9表達(dá)強(qiáng)度大于TIMP-1，提示MMP-9與TIMP-1的失衡與呼吸道重塑有關(guān)，參與了哮喘的發(fā)病。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)哮喘患兒的血清1，25-（OH）2D3水平與血清、BALF的MMP-9水平均呈負(fù)相關(guān)，VD缺乏越嚴(yán)重，患兒的MMP-9表達(dá)水平越高，提示VD與MMP-9共同參與了哮喘的呼吸道重塑過(guò)程，提高VD水平可能抑制其重塑。BRITT等[11]對(duì)胎兒呼吸道平滑肌細(xì)胞加用1，25-（OH）2D3，結(jié)果顯示1，25-（OH）2D3可通過(guò)減少腫瘤壞死因子-α（TNF-α）來(lái)抑制MMP-9 的表達(dá)和活性，且1，25-（OH）2D3能通過(guò)減少TGF-β與TNF-α來(lái)抑制的Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)，抑制呼吸道平滑肌細(xì)胞的增殖。LI等[12]研究顯示對(duì)大鼠給予VD缺乏的飲食并行卵巢切除術(shù)，發(fā)現(xiàn)此類(lèi)大鼠的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌MMP-9與MMP-33的能力增強(qiáng)，相反，補(bǔ)充1，25-（OH）2D3則抑制MMP-9與MMP-33的表達(dá)。劉颯等[13]研究表明對(duì)支氣管哮喘患者而言，常規(guī)治療+VD治療組的血清IL-2、TNF-α水平低于常規(guī)治療組，且哮喘控制測(cè)試（ACT評(píng)分）顯示完全控制及部分控制患者比例高于常規(guī)治療組，提示補(bǔ)充血清VD可降低氣道反應(yīng)性，提高哮喘的療效。

綜上所述，哮喘患兒的血清1，25-（OH）2D3水平下降，而血清及BALF的MMP-9水平升高，兩者共同參與了患兒的呼吸道炎癥反應(yīng)和氣道重塑過(guò)程，提高VD水平可能有助于改善其病情。

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