海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌二重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用*

武迪，陳世玖，王成，龍航，楊軍，劉瓏玲

[遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬（珠海）醫(yī)院 整形手外科，廣東 珠海 519100]

海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌是常見的引起手部及皮膚軟組織感染的非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）[1-3]。根據(jù)伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊及Runyon分類法，海分枝桿菌屬Ⅰ組緩慢生長型光產(chǎn)色菌，潰瘍分枝桿菌屬Ⅲ組緩慢生長型不產(chǎn)色菌[4]。海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌普遍存在水環(huán)境中及動物體上，主要通過傷口侵入人體引起病變[5-7]，所致疾病其治療有所不同[7-8]，故準(zhǔn)確診斷鑒定海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌感染很有意義。然而海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌感染臨床表現(xiàn)基本相似，通過臨床表現(xiàn)不能診斷及鑒別海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌感染，傳統(tǒng)的檢測方法耗時且難于鑒別。因此，本研究建立二重PCR方法同步檢測鑒定海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌，為早期診斷、早期治療手部及皮膚軟組織感染海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌提供一定依據(jù)，并初步應(yīng)用該方法檢測鑒定2014年1月-2015年12月遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬（珠海）醫(yī)院收集的19份臨床上考慮上肢感染NTM的標(biāo)本。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌 海分枝桿菌（ATCC927）購自美國ATCC公司，鳥分枝桿菌（ATCC25291）、胞內(nèi)分枝桿菌（ATCC13950）、堪薩斯分枝桿菌（ATCC12478）、偶然分枝桿菌（ATCC6841）、龜分枝桿菌（ATCC35752）、潰瘍分枝桿菌（ATCC19423）均購自美國MicroBioLogics公司。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 臨床考慮上肢感染NTM的患者：①患者均來自沿海地區(qū)，與海洋生物有密切接觸史；②臨床表現(xiàn)：上肢出現(xiàn)丘疹、皮下肉芽腫伴或不伴有潰瘍、滑膜炎、腱鞘炎、關(guān)節(jié)炎、骨破壞；③病理檢查示慢性肉芽腫性炎癥，可有干酪樣壞死或抗酸染色找到抗酸桿菌；④患者無低熱、盜汗、乏力等結(jié)核臨床表現(xiàn)，相關(guān)輔助檢查提示無肺結(jié)核；⑤常規(guī)抗感染治療無效。

1.1.3 一般資料 本研究共納入患者19例，其中，男性8例，女性11例；年齡29～62歲。漁民11例，海產(chǎn)品養(yǎng)殖者3例，海產(chǎn)品銷售員4例，其他1例。均有海洋生物刺傷史，病程4周～2年。手術(shù)切取病灶組織分為2份，一份送病理檢查，另一份保存于-20℃作為本研究的待測標(biāo)本，病檢結(jié)果示病灶組織病理改變均符合NTM感染。所有患者經(jīng)抗NTM治療有效。

1.1.4 儀 器 和 試 劑T100TMThermal Cycler（ BioRad PCR儀）購自深圳市宇德立生物科技有限公司，Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)購自北京賽百奧科技有限公司，THERMO Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀購自北京平利洋公司，Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司，EmeraldAmp PCR Master Mix 購自大連寶生物工程有限公司，DL600 DNA Marker購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計 通過參考文獻(xiàn)[9-10]及GeneBank查找海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌的特有基因序列，采用NCBI/Primer-BLAST軟件[11]及MFEprimer-2.0軟件[12]設(shè)計2對特異性引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.2 臨床標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取 采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取臨床標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)菌DNA。取菌液或組織勻漿液1 ml于1.5 ml EP管中，室溫離心，8 000 r/min，離心1 min，棄上清，收集菌體，加入180 ml溶菌酶（20 mg/ml）混勻，37℃電熱恒溫水浴箱水浴40 min，加入20 ml Proteinase K溶液混勻，56℃電熱恒溫水浴箱水浴30 min，加入200 ml Buffer BD，充分顛倒混勻，加入200 ml無水乙醇，充分顛倒混勻，將吸附柱放入收集管中，將溶液和半透明纖維懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2 min，室溫離心后，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中，加入500 ml PW Solution，室溫離心，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中，加入500 ml Wash Solution，室溫離心后，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中，室溫離心后，打開吸附柱蓋子，室溫徹底晾干Wash Solution，取出吸附柱放入1個新的1.5 ml EP管中，加入CE Buffer 50～100 ml，室溫離心后收集DNA溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 二重PCR引物序列

1.2.3 PCR擴增目的片段PCR反應(yīng)體系的組成：引物1.0 ml（終濃度為0.4 mmol/L），模板DNA 1.0 ml，Emerald Amp PCR Master Mix 10.0 ml， 加 入ddH2O至總體積為25 ml。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性480 s，95℃變性30 s，67.0～60.0退火20 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸60 s。反應(yīng)結(jié)束后于4℃保存。本研究設(shè)計的2對引物其Tm值在59.0～60.0℃，平均Tm值為60.0℃。故預(yù)設(shè)退火溫度在67.0～60.0℃，觀察退火溫度對PCR結(jié)果的影響，確定最佳退火溫度，并以最佳退火溫度進(jìn)行下一步實驗。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳后于Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，判讀結(jié)果。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)菌單一PCR擴增測序 用通用引物（正向引物：5'-ATAAGCCTGGGAAACTGGGT-3'，反向引物：5'-CACGCTCACAGTTAAGCCGT-3'）分別對本實驗所用到的海、鳥、胞內(nèi)、堪薩斯、偶然、龜、潰瘍分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌DNA進(jìn)行PCR擴增，電泳觀察是否出現(xiàn)相應(yīng)的目標(biāo)條帶，并對標(biāo)準(zhǔn)菌PCR擴增后的產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果與GeneBank數(shù)據(jù)庫相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌基因序列進(jìn)行比對分析，評估本研究所用的標(biāo)準(zhǔn)菌是否符合標(biāo)準(zhǔn)菌的要求。

1.2.5 驗證引物特異性 用海分枝桿菌引物分別與海、鳥、胞內(nèi)、堪薩斯、偶然、龜、潰瘍分枝桿菌（標(biāo)準(zhǔn)菌）DNA模板進(jìn)行PCR擴增，電泳觀察是否只有海分枝桿菌DNA模板反應(yīng)管出現(xiàn)429 bp的目標(biāo)條帶，驗證海分枝桿菌引物的特異性，用同樣的方法可驗證潰瘍分枝桿菌引物的特異性。

1.2.6 二重PCR的建立 海分枝桿菌引物與海分枝桿菌模板DNA進(jìn)行PCR擴增，潰瘍分枝桿菌引物與潰瘍分枝桿菌模板DNA進(jìn)行PCR擴增，建立單一PCR；海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌引物與海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌模板DNA于同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行PCR擴增，建立二重PCR。

1.2.7 二重PCR的檢測 ①特異性：二重PCR分別檢測海、鳥、胞內(nèi)、堪薩斯、偶然、龜、潰瘍分枝桿菌及海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌的混合樣品，電泳觀察是否出現(xiàn)目的條帶。②準(zhǔn)確性：二重PCR分別檢測海及潰瘍分枝桿菌，電泳觀察是否出現(xiàn)相應(yīng)的特異性條帶。③敏感性：二重PCR敏感性是指二重PCR能檢測到的最低細(xì)菌DNA濃度。先用THERMO Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀檢測已提取的海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌DNA原液中DNA的濃度，將海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌DNA原液用超凈水以10倍系列（1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8和1×10-9）稀釋后，分別取1ml進(jìn)行PCR電泳后觀察各目標(biāo)條帶的清晰程度，初步確定該多重PCR的敏感性。

1.2.8 二重PCR檢測臨床標(biāo)本 二重PCR檢測19份臨床標(biāo)本，以DL600 DNA Marker作對照，根據(jù)臨床標(biāo)本產(chǎn)生的目標(biāo)條帶與DL600 DNA Marker對應(yīng)關(guān)系，鑒定臨床標(biāo)本病原菌，并對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌單一PCR擴增測序結(jié)果

用通用引物擴增7種分枝桿菌DNA，分別獲得的目標(biāo)條帶。單一PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)菌DNA測序結(jié)果與GeneBank中相應(yīng)菌種DNA進(jìn)行比對。單一PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)菌DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)菌種DNA序列同源性＞99%，說明本研究所用的標(biāo)準(zhǔn)菌符合標(biāo)準(zhǔn)菌的要求。海分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌通用引物PCR擴增雙向測序圖及拼接后序列用BLAST與GenBanK數(shù)據(jù)庫中的AF057476.1比對，其一致性為100%。鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌通用引物PCR擴增雙向測序圖及拼接后序列用BLAST與GenBanK數(shù)據(jù)庫中的AF057457.1進(jìn)行比對，其一致性為99%?？八_斯分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌通用引物PCR擴增雙向測序圖及拼接后序列用BLAST與GenBanK數(shù)據(jù)庫中的AF057473.2進(jìn)行比對，其一致性為100%。偶發(fā)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌通用引物PCR擴增雙向測序圖及拼接后序列用BLAST與GenBanK數(shù)據(jù)庫中的AF057464.1進(jìn)行比對，其一致性為100%。龜分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌通用引物PCR擴增雙向測序圖及拼接后序列用BLAST與GenBanK數(shù)據(jù)庫中的AF057460.1進(jìn)行比對，其一致性為99%。胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌通用引物PCR擴增雙向測序圖及拼接后序列見圖7。潰瘍分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌通用引物PCR擴增雙向測序圖及拼接后序列用BLAST與GenBanK數(shù)據(jù)庫中的AF057491.1進(jìn)行比對，其一致性為100%。經(jīng)擴增后測序并對比，該研究所用海、鳥、堪薩斯、偶發(fā)、龜、胞內(nèi)、潰瘍分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌均符合研究要求。

2.2 引物特異性檢測結(jié)果

海分枝桿菌的引物與海分枝桿菌模板DNA結(jié)合出現(xiàn)429 bp的目標(biāo)條帶，與其他分枝桿菌模板DNA無條帶出現(xiàn)（見圖1和表2）。潰瘍分枝桿菌的引物與潰瘍分枝桿菌模板DNA結(jié)合出現(xiàn)240 bp的目標(biāo)條帶，與其他分枝桿菌模板DNA無條帶（見圖2和表2）。表明海、潰瘍分枝桿菌引物是特異的。

2.3 二重PCR的成功建立

海分枝桿菌引物與海分枝桿菌模板DNA進(jìn)行PCR擴增出現(xiàn)429 bp的目標(biāo)條帶，潰瘍分枝桿菌引物與潰瘍分枝桿菌模板DNA進(jìn)行PCR擴增出現(xiàn)240 bp的目標(biāo)條帶，單一PCR成功建立（見圖3）。海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌引物與海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌模板DNA于同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行PCR擴增出現(xiàn)429和240 bp的目標(biāo)條帶（見圖3）。表明二重PCR成功建立。

2.4 探索二重PCR的最佳退火溫度

二重PCR其他反應(yīng)條件不變，退火溫度從67.0～60.0℃，各目標(biāo)條帶在62.7℃都出現(xiàn)且較清晰（見圖4）。所以二重PCR的最佳退火溫度為62.7℃。

2.5 二重PCR敏感性

海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌DNA原液中所含DNA的量：海分枝桿菌1.27 ng/μl、潰瘍分枝桿菌11.2 ng/μl，將各標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌DNA原液用無菌超凈水以 10 倍系列（1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8和 1×10-9） 稀 釋后，分別取1μl進(jìn)行PCR電泳確定其敏感性（見圖5）。該多重PCR最低可檢測出0.508 pg/μl海分枝桿菌DNA，44.8 fg/μl潰瘍分枝桿菌DNA。

2.6 二重PCR檢測臨床標(biāo)本

二重PCR檢測19份臨床標(biāo)本，11份出現(xiàn)目標(biāo)條帶，檢出率為58%，海分枝桿菌占42.1%（8例），潰瘍分枝桿菌占15.8%（3例），其中以海分枝桿菌感染最多見（見圖6、7）。二重PCR從獲取臨床標(biāo)本到檢測鑒定海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌經(jīng)測算需6～7 h。

圖1 海分枝桿菌引物特異性

圖2 潰瘍分枝桿菌引物特異性

表2 標(biāo)準(zhǔn)菌DNA模板與引物進(jìn)行PCR產(chǎn)生目標(biāo)條帶的情況

圖3 二重PCR的建立

圖4 二重PCR的退火溫度

圖5 二重PCR的敏感性

圖6 二重PCR檢測臨床標(biāo)本

圖7 二重PCR檢測臨床標(biāo)本

3 討論

NTM屬分枝桿菌屬，為一群細(xì)菌的總稱，廣泛存在于水、土壤和灰塵等自然環(huán)境中，大部分為腐物寄生菌，僅少部分對人體致病，既往被認(rèn)為是條件致病菌。不同的NTM可引起不同的組織器官病變，海分枝桿菌主要引起皮膚軟組織及手部感染[13-14]，潰瘍分枝桿菌主要引起皮膚軟組織[14]，這2種分枝桿菌引起的皮膚軟組織感染其臨床表現(xiàn)、病理檢查相似，且作為檢測鑒定分枝桿菌金標(biāo)準(zhǔn)的16SrRNA區(qū)域的基因也相同[15]。因此，鑒別海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌存在困難。本研究以海分枝桿菌mel2基因序列及潰瘍分枝桿菌IS2404基因序列作為靶序列建立二重PCR同步檢測鑒定海分枝桿菌和潰瘍分桿菌，為臨床早期診斷、早期治療海分枝桿菌和潰瘍分桿菌感染提供一定依據(jù)顯得很有價值。

二重PCR是指在同一反應(yīng)管里加入兩對引物同時擴增一個模板DNA的兩個區(qū)域或兩個模板DNA的聚合酶鏈反應(yīng)。PCR引物設(shè)計影響著PCR擴增的特異性及有效性，本研究采用NCBI/Primer-BLAST軟件設(shè)計能擴增海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌靶序列的引物，并用MFEprimer-2.0軟件評估引物自身及引物間的互補性，避免引物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物二聚體影響引物擴增的效率致二重PCR建立失敗。

二重PCR的敏感性揭示二重PCR能檢測的最低目標(biāo)模板DNA的量，當(dāng)檢測的樣品中所含的目標(biāo)DNA量低于二重PCR能檢測的最低目標(biāo)DNA量時，二重PCR不會出現(xiàn)目標(biāo)條帶，得到假陰性結(jié)果。二重PCR的敏感性越高，能檢測的目標(biāo)DNA量越低，其假陰性結(jié)果越少。本研究建立的二重PCR最低可檢測出最低可檢測出0.508 pg/μl的海分枝桿菌，44.8 fg/μl的潰瘍分枝桿菌，敏感性較高。

二重PCR檢測19份考慮上肢感染NTM的臨床標(biāo)本，11份臨床標(biāo)本出現(xiàn)陽性條帶，檢出率為57.9%，8份臨床標(biāo)本未檢出病原菌，其原因：①收集標(biāo)本時未取到病原菌所在區(qū)域；②標(biāo)本中病原菌較少，所提取的DNA含量低于該二重PCR所能檢測的最低DNA量，出現(xiàn)了假陰性結(jié)果；③收集的標(biāo)本為其他NTM病原菌感染，本研究建立的二重PCR僅能檢測鑒定海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌感染，故該二重PCR方法檢測陰性的標(biāo)本不排除其他NTM感染的可能。42.1%（8份）臨床標(biāo)本被鑒定為海分枝桿菌感染，其可能的原因為本研究選取的臨床標(biāo)本均來自與海洋微生物有密切接觸史的患者，且為臨床上考慮上肢感染NTM的標(biāo)本。

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