貝伐單抗動(dòng)脈介入超選化療對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤的影響

高 飛，王英濱

（1．中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，遼寧沈陽110032；2． 沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院，遼寧沈陽 110024）

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，在所有顱內(nèi)腫瘤中約占44.69%。膠質(zhì)瘤由于浸潤(rùn)性生長(zhǎng)方式及侵襲性強(qiáng)的特性，目前單純用任何一種方法均不能徹底根治，極易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差[1]。由于腦膠質(zhì)瘤患者生存期和生存質(zhì)量較差，因此給患者及其家庭造成沉重的負(fù)擔(dān)。近年來，醫(yī)護(hù)工作者逐漸重視膠質(zhì)瘤的綜合治療，包括化療、放療、生物治療及其他治療等。

化療是膠質(zhì)瘤治療中重要的一環(huán)，由于人體大腦具有血腦/瘤屏障，藥物很難通過；膠質(zhì)瘤中藥物有效濃度較低，腫瘤對(duì)藥物的敏感性不夠以及藥物對(duì)全身的毒副作用等因素影響了臨床療效。研究[2]發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈內(nèi)注射化療藥物可以增加膠質(zhì)瘤內(nèi)部的藥物含量。目前超選擇性動(dòng)脈化療藥物較多，其中順鉑(cisplatin，CDDP)是無機(jī)重金屬化合物，為細(xì)胞周期非特異性藥物，主要干涉DNA與RNA相關(guān)蛋白質(zhì)的合成。貝伐單抗(bevacizumab，BVZ)是一種重組的人類單克隆IgG1抗體，通過抑制人類血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生物學(xué)活性而起作用。目前研究顯示BVZ與其他化療藥物聯(lián)用可很大程度上改善腦膠質(zhì)瘤的治療[3]。但是，BVZ是否能夠單藥治療復(fù)發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤方面的研究尚無報(bào)道。因此，本研究對(duì)C6膠質(zhì)瘤大鼠模型進(jìn)行動(dòng)脈介入超選化療，分別應(yīng)用CDDP和BVZ作為化療藥物，探討動(dòng)脈介入超選化療應(yīng)用BVZ對(duì)膠質(zhì)瘤的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞[美國菌種保藏中心(ATCC)]；Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g(中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；貝伐單抗(瑞士Roche公司)。RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；VEGF、P21蛋白(P21)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、金屬基質(zhì)蛋白-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2) 抗體均購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG二抗均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；VEGF、P21、Bcl-2 和MMP-2引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Real time-PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

腦立體定向儀(美國Stoelting公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，-80 ℃超低溫冰箱(日本SANYO公司)，臺(tái)式低溫超速離心機(jī)(德國Sigma公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備集團(tuán))，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)，聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置(美國Bio-Rad公司)，轉(zhuǎn)印儀(北京市六一儀器廠)，Las3000成像系統(tǒng)(日本FUJIFILM公司)，凝膠成像分析軟件(江蘇捷達(dá)科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 C6細(xì)胞培養(yǎng) C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞復(fù)蘇成功后，重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.3.2 建立腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型 60只SPF級(jí)SD大鼠(合格證號(hào)211002300016826)，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雄性，體質(zhì)量180～200 g。大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，頭部固定在腦立體定位儀上。常規(guī)消毒后，沿中線縱向切開頭皮約1 cm，暴露顱骨。根據(jù)大鼠頭部立體定向解剖圖譜確定對(duì)應(yīng)于右腦尾狀核的鉆孔位置：冠狀縫與矢狀中線交點(diǎn)處前1 mm，矢狀縫右3 mm。微量進(jìn)樣器抽取C6細(xì)胞懸液10 μL(含1×105個(gè)細(xì)胞)，注射速度為1 μL/min，緩慢拔針。骨孔用牙托粉迅速封閉?？p合切口后，肌注青霉素0.1 mL，繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及治療 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞種植后第7天開始，將建模成功的55只大鼠隨機(jī)分為5組，每組11只：對(duì)照組(經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水)、靜脈注射順鉑組(V+CDDP，經(jīng)尾靜脈注射5 mg/kg CDDP[4])、靜脈注射貝伐單抗(V+BVZ，經(jīng)尾靜脈注射5 mg/kg BVZ[5])、動(dòng)脈注射順鉑組(A+CDDP，經(jīng)頸動(dòng)脈注入5 mg/kg CDDP)和動(dòng)脈注射貝伐單抗組(A+BVZ，經(jīng)頸動(dòng)脈注入5 mg/kg BVZ)。隔天注射1次，持續(xù)7 d。

1.3.4 各組大鼠腫瘤體積的測(cè)量 給藥治療7 d后，稱體質(zhì)量，10%水合氯醛將大鼠麻醉，生理鹽水灌流，后經(jīng)4%的多聚甲醛灌流。斷頭取腦膠質(zhì)瘤組織，放入30%蔗糖中脫水2 d，4%多聚甲醛固定24 h，液氮速凍后在-25 ℃的恒冷冰凍切片機(jī)上切片，厚度為8 μm，行HE染色。應(yīng)用MCID圖像分析軟件測(cè)量計(jì)算腦膠質(zhì)瘤的病灶區(qū)面積，按下式計(jì)算腦腫瘤的體積：

腦腫瘤的體積=面積總和×組織間隔厚度

1.3.5 Real time-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 給藥治療7 d后，取50 mg大鼠腦膠質(zhì)瘤組織，提取RNA，檢測(cè)濃度及D(260)/D(280)。按試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物如下：VEGF，上游引物5'-GGTGAGAGGTCTAGTTC CCGA-3'，下游引物5'-CCATGAACTTTCTGCTCTTC-3'；p21，上游引物5'-AGTAGACACGAAACAGGC-3'，下 游 引 物5'-TTCCCATCTTTGCTCATC-3'； Bcl-2， 上游引物5'-CGGGAGAACAGGGTATGA-3'，下游引物5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGAT-3'； MMP-2： 上 游 引 物5'-GGAAGCATCAAATCGGACTG-3'，下游引物5'-GG GCGGGAGAAAGTAGCA-3'。反應(yīng)條件：94 ℃、3 min，94 ℃、30 s，60 ℃、1 min，72 ℃、1 min(30個(gè)循環(huán))，72 ℃、2 min。mRNA相對(duì)表達(dá)差異采用2-ΔΔCT法計(jì)算，進(jìn)行比較。

1.3.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 給藥治療7 d后，取50 mg大鼠腦膠質(zhì)瘤組織，提取蛋白。腦組織在預(yù)冷的組織裂解液中剪碎，勻漿約1 min，冰浴30 min，17 000 r/min、4 ℃離心1 h，收集上清。加入樣品緩沖液，然后將樣品置于沸水浴中加熱5 min使蛋白質(zhì)變性。8% SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，第2天加入稀釋的一抗(1∶200)，室溫2 h，漂洗3次后，加入稀釋的相應(yīng)二抗(1∶5 000)，室溫2 h。漂洗3次，發(fā)光顯色，Quantity One軟件對(duì)各組蛋白條帶光密度進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS for Windows18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)-學(xué)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同治療方法對(duì)大鼠腫瘤體積的影響

對(duì)照組大鼠腦膠質(zhì)瘤體積為(9.02±0.74) mm3，V+CDDP組的腫瘤體積為(7.67±0.70) mm3、V+BVZ組為(6.57±0.69) mm3、A+CDDP組為(5.58±0.37) mm3、A+BVZ組為(4.81±0.20) mm3，均較對(duì)照組明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；且A+CDDP組腫瘤體積較V+CDDP組相明顯縮小(P＜0.01)，A+BVZ組腫瘤體積較V+BVZ組明顯較小(P＜0.01)，結(jié)果顯示，動(dòng)脈注射具有較強(qiáng)的抑制膠質(zhì)瘤體積的作用。同時(shí)，V+BVZ組腫瘤體積顯著小于V+CDDP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，A+BVZ組腫瘤體積顯著小于A+CDDP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示BVZ對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制作用較CDDP更強(qiáng)，見圖1。

圖1 不同治療方法對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤體積的影響(n=11)

2.2 不同治療方法對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤VEGF、P21、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達(dá)水平的影響

利用Real time-PCR方法測(cè)定各組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織中相關(guān)基因的表達(dá)(見圖2)。結(jié)果顯示，V+CDDP組、V+BVZ組、A+CDDP組和A+BVZ組的VEGF、Bcl-2及MMP-2的mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)；同時(shí)，P21的mRNA表達(dá)明顯增多，差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。與V+CDDP組相比，A+CDDP組的VEGF、Bcl-2及MMP-2的mRNA表達(dá)均顯著降低(P＜0.05)，A+BVZ組上述各mRNA表達(dá)也顯著低于V+BVZ組(P＜0.05)。另外，A+CDDP組P21的mRNA表達(dá)較V+CDDP組顯著升高(P＜0.01)， A+BVZ組 P21的 mRNA表 達(dá) 也 顯 著 高 于V+BVZ組(P＜ 0.01)，結(jié)果顯示，動(dòng)脈注射降低VEGF、Bcl-2以及MMP-2的作用以及提高P21蛋白的作用更顯著。此外，V+BVZ組VEGF、Bcl-2和MMP-2的mRNA表達(dá)顯著低于V+CDDP組(P＜0.05)，A+BVZ組上述各mRNA表達(dá)也顯著低于A+CDDP組(P＜0.05)。而V+BVZ組P21的mRNA表達(dá)較V+CDDP組顯著升高(P＜0.05)。

圖2 不同治療方法對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤VEGF、P21、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達(dá)的影響(n=5)

2.3 不同治療方法對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤VEGF、P21、Bcl-2和MMP-2蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)的各組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況見圖3。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，V+CDDP組、V+BVZ組、A+CDDP組和A+BVZ組的VEGF、Bcl-2、MMP-2表達(dá)與對(duì)照組相比均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)；同時(shí)，P21蛋白表達(dá)明顯增多，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。A+CDDP組VEGF、Bcl-2和MMP-2蛋白表達(dá)與V+CDDP組相比均顯著降低(P均＜0.05)，A+BVZ組上述蛋白表達(dá)也均顯著低于V+BVZ組(P均＜0.05)。A+CDDP組P21表達(dá)較V+CDDP組顯著升高(P＜0.05)，A+BVZ組P21表達(dá)也顯著高于V+BVZ組(P＜0.01)，結(jié)果顯示，動(dòng)脈注射降低VEGF、Bcl-2及MMP-2的表達(dá)與升高P21蛋白表達(dá)的作用較靜脈注射更顯著。此外，V+BVZ組VEGF、Bcl-2和MMP-2蛋白的表達(dá)顯著低于V+CDDP組(P＜0.05)，A+BVZ組上述蛋白表達(dá)也顯著低于A+CDDP組(P＜0.05)。V+BVZ組P21蛋白表達(dá)較V+CDDP組顯著升高(P＜0.05)，A+BVZ組P21蛋白表達(dá)也顯著高于A+CDDP組(P＜0.05)。結(jié)果顯示，BVZ降低VEGF、Bcl-2和MMP-2蛋白的表達(dá)與升高P21蛋白的作用較CDDP更顯著。

圖3 不同治療方法對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤VEGF、P21、Bcl-2及MMP-2蛋白表達(dá)的影響(n=5)

3 討論

膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)的靜脈化療因血腦屏障和血瘤屏障的制約，療效明顯受限。隨著神經(jīng)介入技術(shù)的飛速發(fā)展，經(jīng)動(dòng)脈超選化療，由于其可能克服經(jīng)靜脈化療的局限正受到越來越多的關(guān)注[6]。 Tomokatsu等[7]發(fā)現(xiàn)經(jīng)動(dòng)脈灌注可以使嘧啶亞硝脲(nimustine，ACNU)更易進(jìn)入腫瘤及瘤周組織，而灌注前10 min輸入20%甘露醇可使腫瘤及瘤周組織中的ACNU濃度達(dá)到最高。Levin 等[8]研究表明，灌注側(cè)的藥物濃度比同劑量靜脈用藥高4倍。在灌注時(shí)用定量輸液泵快速輸入化療藥物，可避免藥物在血流中形成層流，促進(jìn)藥物在遠(yuǎn)端各血管分支內(nèi)均勻分布，達(dá)到最大療效。劉灃等[9]發(fā)現(xiàn)單次經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈灌注ACNU較單次經(jīng)靜脈灌注能更有效地抑制腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。還有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[10]，經(jīng)動(dòng)脈灌注途徑對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行化療，增加化療藥物的療效，能更有效控制腫瘤的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，動(dòng)脈注射CDDP和BVZ后，大鼠腦膠質(zhì)瘤體積較對(duì)照組明顯縮小，并且與靜脈注射相比均具有較強(qiáng)的抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的作用。膠質(zhì)細(xì)胞瘤一般有一條或兩條主要?jiǎng)用}供血，研究認(rèn)為腫瘤組織動(dòng)脈的血流率低，動(dòng)脈灌注化療藥物可以直接將藥物送到腫瘤位置，減少體內(nèi)循環(huán)，提高腫瘤內(nèi)藥物的作用濃度[11-12]，藥物的半衰期短，而對(duì)周圍腦組織及全身各系統(tǒng)的毒副作用減少，故動(dòng)脈超選化療是治療腦膠質(zhì)瘤的最佳途徑。

腦膠質(zhì)瘤通常存在異常過度的血管生成，而促血管形成因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)的高表達(dá)與此過程密切相關(guān)[13]。BVZ是人工合成的VEGF單克隆抗體，以VEGF為靶點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合VEGF受體，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和血管生成，達(dá)到阻斷腫瘤的血液供應(yīng)的效果，最后抑制腫瘤在體內(nèi)擴(kuò)散。有報(bào)道顯示，BVZ可作為單一用藥及聯(lián)合其他化療藥物用來治療如轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、肺癌等其他實(shí)體性惡性腫瘤[14]。Hacibekiroglu等[15]使用BVZ單藥治療復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20%達(dá)到部分緩解，38%病情穩(wěn)定。日本一項(xiàng)研究結(jié)果顯示[16]使用BVZ單藥治療復(fù)發(fā)性高級(jí)別膠質(zhì)瘤 患者，疾病緩解率為27.6%。本研究結(jié)果將BVZ應(yīng)用治療腦膠質(zhì)瘤大鼠，也發(fā)現(xiàn)BVZ對(duì)膠質(zhì)瘤具有較強(qiáng)的抑制作用。

另外VEGF與膠質(zhì)瘤異常過度的血管生成有關(guān)[17]，P21是細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族中的重要成員，它通過抑制周期素依賴激酶復(fù)合物活性，將腫瘤抑制作用與細(xì)胞周期控制過程緊密相連[18]。Bcl-2在細(xì)胞凋亡過程中起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[19-20]?；|(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)，幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈注射降低VEGF、Bcl-2、MMP-2蛋白表達(dá)及升高P21蛋白表達(dá)的作用較靜脈注射更顯著。同時(shí)，BVZ較CDDP的作用更顯著。

綜上所述，應(yīng)用BVZ動(dòng)脈超選化療，能有效控制腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，并且對(duì)腦膠質(zhì)瘤異常的血管生成、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及侵襲遷移等過程都可能產(chǎn)生影響，從而達(dá)到較好的治療效果。目前膠質(zhì)瘤的治療仍是世界公認(rèn)的難題，為了延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤患者的生存期以及生活質(zhì)量，醫(yī)務(wù)工作者在不斷的探索新療法。動(dòng)脈超選化療能有效控制腦膠質(zhì)瘤的大小，對(duì)其深入探討和完善將可為臨床應(yīng)用提供一個(gè)有效的治療手段。

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