三氯生的體外遺傳毒性評價

曹易懿，奚 晶，唐偉鋒，尤馨悅，劉維映，欒洋，*

（1．上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院虹橋國際醫(yī)學(xué)研究院/公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200025；2．上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，環(huán)境污染與健康研究所，上海200444）

三氯生(triclosan，TCS)因其具有廣譜高效的抗菌作用，自1968年以來被廣泛用于醫(yī)療消毒和肥皂、除臭劑、牙膏等個人護理品和家居用品中[1-3]。個人護理品中添加的TCS能夠隨生活污水的排放進入自然環(huán)境，并可在環(huán)境中蓄積[4]，TCS被認為是一類新型的環(huán)境污染物。有報道顯示在生活污水中可檢測到的TCS達100～1 000 ng/L，而且在地表水、飲用水和室內(nèi)塵土中亦檢測到一定濃度的TCS，在我國河流的水體和沉積物中TCS具有較高的檢出率，水體中最大濃度達到每升數(shù)百納克，沉積物中最大濃度達到每克數(shù)微克[5-6]。

環(huán)境中的TCS可通過直接和間接的方式進入生物體內(nèi)，已有研究報道在人體的血清/血漿、尿液、大腦、肝臟及脂肪組織內(nèi)可檢測到TCS[7]。前期的一些研究表明長期使用含TCS的產(chǎn)品不會對人類健康造成影響，但近年來研究表明TCS具有內(nèi)分泌干擾作用、生殖發(fā)育毒性和潛在的致癌風險[8-13]。因此，TCS對人類健康的影響已經(jīng)引起了全球范圍的廣泛關(guān)注。

歐美各國已經(jīng)逐步限制TCS在各類產(chǎn)品中的使用[14]，其中德國在2009年禁止TCS在食品相關(guān)材料中的使用。但我國目前對TCS尚未禁用，仍是TCS的生產(chǎn)和消耗大國。近年來僅在一些特定應(yīng)用領(lǐng)域給予了限量要求，例如，在2009年實施的牙膏用原料規(guī)范的國家標準(GB 22115-2008)中，首次規(guī)定了TCS含量不得超過0.3%[15]。 目前，TCS的致癌實驗數(shù)據(jù)不充分[16]，毒性機制尚未完全闡明，因此我們選擇采用可檢測DNA損傷的體外彗星試驗，考察染色體異常的體外微核試驗以及可檢測基因突變的Ames試驗進行有效地組合，評價TCS的體外遺傳毒性，探討毒性作用機制，為TCS毒性的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及遺傳特性鑒定

TK6細胞和鼠傷寒沙門氏菌TA98、TA100和YG7108(Ogt-/ Ada-)菌株均由日本國立衛(wèi)生研究所贈送。鼠傷寒沙門氏菌遺傳特性鑒定要求包括：組氨酸營養(yǎng)缺陷型；脂多糖屏障缺陷；紫外線修復(fù)缺損；菌株具有R因子，帶有pKM101質(zhì)粒，具有抗氨芐青霉素作用；菌株不帶有pAQ1質(zhì)粒，不具有抗四環(huán)素作用。對鑒定合格并且自發(fā)突變數(shù)符合要求的菌株進行增菌，作為實驗菌株。

1.2 受試物

三氯生，CAS號3380-34-5，購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 陽性對照品

喜樹堿(camptothecin，CPT)，CAS號7689-03-4，購自梯希愛(TCI，上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，終濃度20 μmol/L。絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)，CAS號50-07-7，購自Roche公司，終濃度0.5 μg/mL。TA98菌株陽性對照采用2-硝基芴(2-nitrofluorene，2-NF)，CAS號607-57-8，終濃度20 μg/皿；TA100和YG7108菌株陽性對照采用甲磺酸甲酯(methyl methanesulfonate，MMS)，CAS號66-27-3，終濃度分別為13 000和200 μg/皿。2-NF和MMS均購自Sigma-Aldrich公司。

1.4 細胞培養(yǎng)和給藥處理

TK6細胞用含10%馬血清(Gibco公司，貨號16050-122)的 RPMI-1640(Corning公司，貨號10-040-CVR)培養(yǎng)基于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)增殖期后使用。使用二甲亞砜(DMSO，CAS號67-68-5，購自Sigma-Aldrich公司)配制不同濃度的TCS，DMSO在細胞培養(yǎng)液中的終濃度為0.5%(V/V)。通過預(yù)試驗選擇產(chǎn)生合適的細胞毒性劑量進行實驗，選擇的毒性劑量盡量覆蓋到較高細胞毒性劑量(產(chǎn)生55%±5%的細胞毒性)到無細胞毒性或者低細胞毒性劑量。調(diào)整細胞濃度為約2.0×105/mL，加入不同濃度的TCS，使每組終濃度分別為3.5、8.8、17.5、26.3和35 μmol/L，同時設(shè)陰性對照組(加入0.5%的DMSO)和陽性對照組CPT 20 μmol/L(彗星試驗)或MMC 0.5 μg/mL(微核試驗)，每個劑量2個復(fù)孔。

每個復(fù)孔加藥處理細胞5 mL，每個濃度分別取2.5 mL加在6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，共2塊，一塊用于彗星試驗，另一塊用于微核試驗。在用于微核試驗的6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入細胞松弛素B(cytochalasin B)，終濃度為3 μg/mL，與TCS共同處理TK6細胞24 h。

1.5 體外堿性彗星試驗

給藥處理24 h后，離心除去培養(yǎng)液。然后用HBSS/EDTA緩沖液清洗1次。在載玻片上制備膠體，先用1%的常熔點瓊脂糖凝膠鋪第一層膠，待凝固后，將混合均勻的細胞懸液與0.7%的低熔點瓊脂糖凝膠鋪在第一層膠上，凝固后在4 ℃下裂解1.5 h。裂解完畢后轉(zhuǎn)移至堿性電泳緩沖液中，靜置40 min后在300 mA下電泳20 min。電泳完畢后，用0.4 mol/L Tris-HCl中和，無水乙醇脫水，干燥后用1 μg/mL的DAPI染色10 min，在熒光顯微鏡下觀察細胞形成的DNA彗星拖尾情況，用專業(yè)軟件COMET IV(Perceptive Instruments，Version 4 .3)實時圖像測定系統(tǒng)進行分析，每個劑量組分析100個細胞圖像(每個復(fù)孔分析50個，2個復(fù)孔合計分析100個)，測定彗星的尾長、尾部DNA強度和尾矩。

1.6 體外胞質(zhì)分裂阻滯微核細胞組學(xué)試驗

給藥處理24 h后，離心除去培養(yǎng)液。加入0.075 mol/L KCl低滲5 min，然后加預(yù)冷的固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)混勻，離心棄上清。加入固定液固定15 min后離心(重復(fù)1次)，棄上清(留適量液體)，重懸混勻后滴片。待自然干燥后，用PBS配制10% Giemsa染色15 min，沖洗，晾干。顯微鏡觀察標本：①每個劑量組計數(shù)500個細胞(每個復(fù)孔的標本計數(shù)250個，2個復(fù)孔合計500個)，分別計數(shù)單核、雙核、三核和四核的細胞數(shù)，用于計算各劑量產(chǎn)生的細胞毒性。根據(jù)經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD)指導(dǎo)原則[17]中的公式計算胞質(zhì)分裂阻滯增殖指數(shù)(cytokinesis-block proliferation index，CBPI)如下。②每個劑量組計數(shù)2 000個雙核細胞中(每個復(fù)孔計數(shù)1 000個，2個復(fù)孔合計2 000個)出現(xiàn)Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核質(zhì)橋及核芽的細胞數(shù)，分別計算其發(fā)生頻率。核質(zhì)橋及核芽的界定標準參照文獻[18]的方法。微核直徑小于主核的1/4為I型微核；直徑為主核的1/4～1/2為II型微核[19]。

CBPI指數(shù)=(單核細胞數(shù)+2×雙核細胞數(shù)+3×多核細胞數(shù))/總細胞數(shù)

1.7 Ames試驗

使用DMSO配制不同濃度的TCS。實驗設(shè)定0.000 5、0.001 67、0.005、0.016 7、0.05、0.167、0.5和1.67 μg/皿共8個劑量組，同時設(shè)定陰性對照組(每塊平皿加入100 μL DMSO)和陽性對照組，每個劑量3塊培養(yǎng)皿。將TA98、TA100和YG7108菌株接種在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫水浴搖床過夜進行擴增。取100 μL的TCS受試物藥液、100 μL菌液、0.5 mL PBS和2.0 m L的頂層培養(yǎng)基于試管中，振蕩混勻后鋪于底層培養(yǎng)基。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d取出培養(yǎng)皿，用肉眼觀察回復(fù)突變菌落進行計數(shù)；觀察背景菌斑，考察各劑量TCS對菌株的細菌毒性。毒性表現(xiàn)：①背景菌斑與陰性對照相比若減少或消失；②測試組的回復(fù)突變菌落數(shù)與陰性對照相比明顯下降或有劑量依賴性減少。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

彗星試驗測定的尾長、尾部DNA強度和尾矩的數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 5.0進行非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗，并用Dunn’s Multiple Comparison Test進行組間檢驗，若P＜0.05則用Spearman進行相關(guān)性分析，計算r值與P值。微核試驗采用泊松分布進行檢驗。Ames試驗結(jié)果，用Excel 2017計算回復(fù)突變菌落數(shù)的和s。并按以下標準進行判定：①所有測試組的回復(fù)突變菌落數(shù)小于陰性對照組2倍，判為陰性。②任何測試組的回復(fù)突變菌落數(shù)大于陰性對照組4倍，且結(jié)果基本具有再現(xiàn)性，則判為陽性。③若測試組最大效應(yīng)組為陰性對照2～4倍之間，則作進一步分析。供試品所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)出現(xiàn)濃度依賴性的增加或在多個濃度組上出現(xiàn)可重復(fù)性的增加，可判斷陽性。進行Dunnett’ t-t檢驗后，仍無顯著意義，則可判為陰性。

2 結(jié)果

2.1 體外堿性彗星試驗結(jié)果

見表1。結(jié)果表明：TCS的各個劑量組與陰性對照組相比，均能引起TK6細胞彗星的尾長、尾部DNA強度和尾矩的增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且尾部DNA強度呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系(r=0.943，P=0.017)，表明TCS能顯著引起TK6細胞DNA損傷，且隨著暴露劑量的增加而增強。

表1 不同劑量三氯生處理后的體外堿性彗星試驗結(jié)果(-x±s)

2.2 體外胞質(zhì)阻滯微核細胞組學(xué)試驗結(jié)果

見表2。結(jié)果表明：TCS在35.0 μmol/L劑量下對TK6細胞產(chǎn)生較高的細胞毒性(80.5%)，抑制TK6細胞生長；TCS在各劑量下均未引起TK6細胞的微核率、核質(zhì)橋率和核芽率升高(P均＞0.05)。

表2 不同劑量三氯生處理后的體外胞質(zhì)阻滯微核細胞組學(xué)試驗結(jié)果

2.3 Ames試驗結(jié)果

見表3。結(jié)果表明：TCS在≥0.167 μg/皿劑量下產(chǎn)生對TA98和YG7108菌株嚴重的細菌毒性，背景菌斑消失，且抑制菌株的生長，同時對TA100菌株產(chǎn)生一定的細菌毒性，背景菌斑明顯減少且回復(fù)突變菌落數(shù)減少約60%。TCS在各劑量下均未引起TA98、TA100和YG7108菌株的回復(fù)突變菌落數(shù)增加(P＞0.05)，且未呈現(xiàn)劑量依賴性升高趨勢。實驗結(jié)果表明TCS對3株菌株不具有致突變作用。13 000和200 μg/皿.

表3 不同劑量三氯生作用后的Ames試驗結(jié)果

3 討論

本實驗體外堿性彗星試驗結(jié)果顯示TCS能顯著引起TK6細胞DNA損傷，且隨著暴露劑量增加而增強。近年來TCS對DNA的損傷效應(yīng)逐漸引起關(guān)注，現(xiàn)有研究顯示TCS能引起人肝L02細胞的DNA損傷，與本實驗結(jié)果基本一致[20]。由于TCS能在土壤和水環(huán)境中蓄積，已有不少關(guān)于TCS在環(huán)境毒理方面的研究，如水生生物的彗星試驗結(jié)果表明TCS能引起斑馬貽貝和虹鱒魚的血細胞DNA損傷[21-22]；此外TCS還能引起蚯蚓DNA的損傷[23]，導(dǎo)致金魚的DNA損傷和外周血細胞微核率的升高[24]；以及可抑制水生植物藻類的生長并且可致DNA損傷[25]。TCS作用哺乳動物細胞(BHK-21、Vero和KB細胞)的彗星試驗顯示TCS在IC20-30的劑量下作用5 d后能觀察到顯著的DNA損傷效應(yīng)。

由于DNA損傷效應(yīng)與細胞毒性相關(guān)，較高的細胞毒性會引起假陽性結(jié)果。因此，本實驗采用組合試驗體系，用同一批細胞給藥后同時進行體外堿性彗星試驗和體外胞質(zhì)分裂阻滯微核細胞組學(xué)試驗，通過體外微核試驗中的CBPI指數(shù)測定各劑量組的細胞毒性，用以判斷是否是過高的細胞毒性導(dǎo)致實驗出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本實驗結(jié)果顯示，TCS僅在35.0 μmol/L劑量下對TK6細胞產(chǎn)生較高的細胞毒性(80.5%)，其余劑量均小于50%的細胞毒性，表明TCS在3.5、8.8、17.5和26.3 μmol/L劑量下引起的DNA損傷不是由于過高的細胞毒性導(dǎo)致的細胞死亡/凋亡所致。

本實驗選擇體外胞質(zhì)分裂阻滯微核細胞組學(xué)試驗是近年逐漸發(fā)展完善起來的可考察多個遺傳毒性終點的檢測方法，通過觀察特征性的細胞染色體損傷的類型進行判別[26]：①微核，為染色體損傷的標志，并且可根據(jù)微核的大小分為I型微核(為染色體斷裂的標志)和II型微核(為非整倍體畸變的標志)；②核質(zhì)橋，為DNA錯誤修復(fù)、染色體重組或端粒末端融合的標志；③核芽，為基因擴增和/或基因量改變的標志。本實驗結(jié)果顯示TCS在各劑量下均未引起TK6細胞的微核率、核質(zhì)橋率和核芽率升高，表明TCS未對TK6細胞染色體造成損傷，其毒性作用可能主要是引起細胞DNA損傷。

此外，我們除了使用經(jīng)典Ames試驗中的鼠傷寒沙門氏菌TA98和TA100菌株外，還采用了DNA修復(fù)酶缺陷型YG7108(Ogt-/ Ada-)菌株對TCS進行致突變作用的評價。鼠傷寒沙門氏菌有兩種烷基轉(zhuǎn)移機制，一種為組成型，表達O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(Ogt)；另一種是可誘導(dǎo)達O6-烷基鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶I(Ada)，因此DNA修復(fù)酶缺陷型的YG7108(Ogt-/ Ada-)對檢測烷化劑非常敏感，能在受試物較低的濃度下檢測出是否具有致突變作用[27]。TCS為廣譜抗菌劑，所以通常采用Ames試驗評價受試物的上限參考濃度(5 000 μg/皿)不適用于本實驗。我們根據(jù)TCS對鼠傷寒沙門氏菌的細菌毒性設(shè)定合理的劑量，發(fā)現(xiàn)TCS在較低的納克級濃度下對本實驗3株菌株仍不具有致突變作用。

目前TCS的毒性研究機制尚未完全闡明，缺乏有效的安全性評價的科學(xué)依據(jù)。由于三氯生能長期在環(huán)境中蓄積，并且它是致癌物二噁英、氯仿等形成的來源之一，2017年的佛羅倫薩申明呼吁國際社會限制生產(chǎn)和使用TCS，并建議政府職能部門、制造商和消費者采取相應(yīng)行動[14]。我們通過體外實驗組合體系考察了TCS的遺傳毒性，希望能為進一步研究TCS的毒性機制提供依據(jù)，從而進一步探討TCS致癌機制。目前有報道認為TCS的致癌性是由其內(nèi)分泌干擾作用所致，認為其是一類雌激素內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，可能影響前列腺癌的發(fā)展[28-29]。綜合本研究中的3個實驗結(jié)果，我們認為TCS主要是引起細胞DNA損傷，但對Ames試驗菌株不具致突變作用。由于TCS具有廣譜抗菌的作用，因此需要進一步在細胞水平和整體動物水平考察TCS的毒性作用，進而綜合判別TCS屬于遺傳毒性致癌物，還是屬于表觀遺傳毒性致癌物。

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