HIF-1α高表達對苯代謝物誘導(dǎo)K562細胞毒性的影響

孫鳳霞，孟 醒，孫蓉麗，張 娟，尹立紅，浦躍樸*

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室，江蘇 南 京 210009）

苯是常見的環(huán)境污染物，是化學(xué)工業(yè)中常見的原料和試劑，用于制造橡膠、染料、殺蟲劑等。在日常生活中，苯主要來源于家庭裝修材料、汽車尾氣、汽油蒸汽等。苯具有較高毒性，通過呼吸道進入人體，是確認致癌物[1]。長期接觸低濃度苯可導(dǎo)致慢性苯中毒，影響人體骨髓的造血功能，臨床表現(xiàn)為血小板數(shù)量和白細胞計數(shù)顯著減少，嚴重者可導(dǎo)致再生障礙性貧血、骨髓增生不良綜合征甚至白血病[2]。苯主要通過代謝物來發(fā)揮毒性作用[3]，在細胞色素氧化酶P4502E1 作用下生成氫醌、苯酚、1,4-苯醌、兒茶酚胺等，苯酚及其他酚類化合物與葡萄糖醛酸或硫酸鹽形成共軛化合物，可以隨尿液排出體外[4]。

骨髓是苯代謝物導(dǎo)致造血抑制的主要靶器官[5]。苯進入人體，在肝內(nèi)代謝產(chǎn)生的氫醌被運輸進入骨髓后，在髓過氧化物酶的作用下生成苯醌，此氧化過程中產(chǎn)生ROS，致氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，影響骨髓細胞的遷移、發(fā)育和自我更新以及細胞周期狀態(tài)，最終導(dǎo)致骨髓衰竭[4，6-7]。苯及其代謝物導(dǎo)致骨髓造血毒性的機制目前尚未闡明，可能與誘導(dǎo)凋亡、DNA損傷、骨髓池的損耗有關(guān)[2，7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，苯染毒的小鼠骨髓細胞內(nèi)活性氧上升，而缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α表達降低，推測HIF-1α可能參與苯毒性的調(diào)節(jié)過程[8]。骨髓微環(huán)境氧濃度低，HIF-1α在缺氧環(huán)境中高表達，在常氧狀態(tài)下很快被降解[9-10]。骨髓細胞可能通過HIF-1α通路表達與血管生成、移動性和葡萄糖代謝相關(guān)的基因來應(yīng)對缺氧[11-12]。K562細胞是慢性髓性白血病細胞，本研究通過構(gòu)建HIF-1α高表達的K562細胞模型，研究苯代謝物1,4-苯醌、氫醌、苯酚對對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞毒性的影響，進而探討HIF-1α 在苯的代謝物致造血毒性發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

伊思柯夫改良培養(yǎng)液(Iscove’s modified Dulbecco’s medium，IMDM)購于Gibco公司；胎牛血清購于Gibco公司；1,4-苯醌(1,4-benzoquine，1,4-BQ)，溶于甲醇，購于Sigma公司；氫醌(hydroquinone，HQ)，溶于超純水，購于Sigma公司；苯酚(phenol，PH)，溶于甲醇，購于Sigma公司；四甲基偶氮噻唑鹽(diphenyltetrazolium bromide， MTT)購于Sigma公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于泰坦公司；PBS購于Gibco公司；青霉素和鏈霉素購于Hyclone公司；遺傳霉素(geneticin，G418)購于VWR公司；殺稻瘟菌素購于翊圣生物公司；Quick Change試劑盒購于Stratagene公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和PI細胞周期試劑盒購于BD公司；低溫高速離心機購于Eppendorf 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購于Heraeus公司；Mithras LB941多功能酶標(biāo)儀購于Berthold公司；BD FACS Calibur流式細胞儀購于BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞株的構(gòu)建及培養(yǎng) K562細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的IMDM中，培養(yǎng)條件為37℃、CO2體積分數(shù)5%。采用Quick Change試劑盒定點突變HIF-1α的脯氨酸402、564(VHL結(jié)合位點)和天冬氨酸803位點(FIH結(jié)合位點)，抑制HIF-1α泛素化降解，得到蛋白穩(wěn)定表達的P1P2N-HIF-1α質(zhì)粒。通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染進入慢性髓性白血病細胞系K562細胞，構(gòu)建HIF-1α穩(wěn)定高表達的K562 細胞，同時構(gòu)建對照組K562細胞。高表達HIF-1α的K562細胞的HIF-1α蛋白水平顯著高于對照組K562細胞。高表達HIF-1α的K562細胞具有殺稻瘟菌素抗性，所以為穩(wěn)定篩選細胞并維持其抗性，在細胞培養(yǎng)時加入終體積分數(shù)為1∶5 000的殺稻瘟菌素。對照組K562細胞具有遺傳霉素抗性，在完全培養(yǎng)基中加入1∶1 000的遺傳霉素以穩(wěn)定篩選細胞并維持其抗性。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖率 取對數(shù)生長期細胞，800 r/min離心5 min，加入完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按每孔10 000個細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中。用完全培養(yǎng)基稀釋1,4-苯醌及氫醌溶液至終濃度為0、10、20、40、80 μmol/L，苯酚終濃度為0、1、1.5、2、2.5、5 mmol/L，每個劑量組設(shè)5個復(fù)孔。每個劑量陰性對照組不加毒物，空白對照組不加細胞及毒物。染毒24 h結(jié)束后每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，后將96 孔板1 000 r/min離心10 min，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶解藍紫色結(jié)晶物，混勻后，在酶標(biāo)儀上選擇490 nm波長測定吸光度D(490)值。按公式計算各組細胞相對增殖率。

1.2.3 PI/FITC雙染色法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測苯代謝物誘導(dǎo)K562細胞凋亡的作用 采用的苯代謝物濃度：1,4-苯醌及氫醌溶液終濃度為0、10、20 μmol/L，苯酚終濃度為0、1、2 mmol/L。染毒24 h后1 500 r/min離心5 min，收集細胞，用PBS洗滌細胞1次后，1 500 r/min離心5 min，收集5×105個細胞，加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞。在細胞懸液中加入5 μL異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)混勻后，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻。室溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.2.4 碘化丙啶(PI)染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布 細胞分組處理同1.2.3，染毒24 h后1 500 r/min離心5 min，收集細胞，用PBS洗滌細胞1次后，1 500 r/min離心5 min，收集1×106個細胞，加入500 μL 70%冷乙醇固定2 h至過夜，4 ℃保存。固定結(jié)束后，用PBS洗滌細胞3次，1 500 r/min離心5 min，加入400 μL PI染色混勻，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，計量資料組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗法，兩組細胞間比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 苯代謝物對K562細胞的增殖抑制作用

3種苯代謝物染毒對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞24 h后對其增殖率的影響見圖1，可見1,4-苯醌染毒后，兩株細胞在20～80 μmol/L濃度均出現(xiàn)增殖率降低且呈劑量效應(yīng)關(guān)系(與未處理組比較，P＜0.05)；1,4-苯醌濃度為80 μmol/L時，高表達HIF-1α的K562細胞相對增殖率高于對照組K562細胞(P＜0.05，圖1A)。氫醌染毒后，對照組K562細胞在20～80 μmol/L濃度均出現(xiàn)細胞增殖率降低(與未染毒組比較，P＜0.05)，而高表達HIF-1α的K562細胞僅在80 μmol/L 濃度時增殖率降低，且在20和40 μmol/L時，高表達HIF-1α的K652細胞較對照組K562細胞增殖率高(P＜0.05，圖1B)。苯酚染毒后，對照組K562細胞在2.5 和5 mmol/L濃度時增殖率降低(與未染毒組比較，P＜0.05)，而高表達HIF-1α的K562細胞在1～5 mmol/L濃度染毒時增殖率與未處理組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1C)。

圖1 苯代謝物染毒對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞24 h后的增殖率

2.2 苯代謝物對K562細胞的凋亡誘導(dǎo)作用

3種苯代謝物染毒對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞24 h后，流式細胞術(shù)檢測對其凋亡率的影響，結(jié)果見圖2?？梢?,4-苯醌染毒后，兩株細胞的細胞凋亡率增加且呈劑量效應(yīng)關(guān)系(與未染毒組比較，P＜0.05)，在20 μmol/L濃度時高表達HIF-1α的K562細胞較對照組K562細胞凋亡率降低(P＜0.05，圖2A)。不同濃度的氫醌和苯酚染毒24 h后，兩株細胞的凋亡率與未染毒組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，高表達HIF-1α的K562細胞的凋亡率較對照組K562細胞差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖2B、2C)。

2.3 苯代謝物對K562細胞周期的影響

3種苯代謝物染毒對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞24 h后的細胞周期分布見表1。可見1，4-苯醌染毒后，相對于未染毒組，兩株細胞均出現(xiàn)S期比例上升，G2/M期比例下降(P＜0.05)，細胞阻滯在S期。在20 μmol/L濃度時，與對照組K562細胞相比，高表達HIF-1α的K562細胞S期、G2/M期比例上升(P＜0.05)。氫醌染毒后，與未染毒細胞比較，對照組K562細胞G0/G1期比例上升，G2/M期比例下降(P＜ 0.05)；高表達HIF-1α的K562細胞G0/G1期比例上升，S期比例下降(P＜0.05)。與對照組K562細胞相比，未染毒時高表達HIF-1α的K562細胞的G0/G1期和S期比例上升(P＜0.05)；10 μmol/L濃度染毒時高表達HIF-1α的K562細胞G0/G1期比例上升(P＜0.05)。苯酚染毒后，相對于未染毒組，對照組K562細胞G0/G1期比例上升；高表達HIF-1α的K562細胞G0/G1期比例下降，S期和G2/M期上升(P＜0.05)。與對照組K562細胞相比未染毒時高表達HIF-1α的K562細胞G0/G1期比例下降，G2/M期上升(P＜0.05)；1、2 mmol/L濃度苯酚染毒時高表達HIF-1α的K562細胞G0/G1期比例下降，S期和G2/M期上升(P＜ 0.05)。

圖2 苯代謝物染毒對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞24 h后的凋亡率

表1 3種苯代謝物染毒對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞24 h后的細胞周期分布(%，-x±s)

3 討論

苯是一種確認的致癌物，不僅在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，還普遍存在日常生活中，如加油站及汽車尾氣、家庭裝修材料等。我國存在大量苯接觸人群，如何更好地保護該人群健康是職業(yè)衛(wèi)生領(lǐng)域的重要問題之一。目前職業(yè)苯暴露的特點是低濃度長期暴露，主要引起造血系統(tǒng)損害。研究認為苯的血液毒性主要是其在體內(nèi)代謝過程中形成的代謝產(chǎn)物所引起。苯通過呼吸道進入機體后，在肝內(nèi)細胞色素酶P4502E1的催化下，氧化生成苯氧化環(huán)等，苯氧化環(huán)可以自發(fā)轉(zhuǎn)化為苯酚，也可以經(jīng)環(huán)氧化物酶催化生成兒茶酚，苯氧化環(huán)也可打開進一步氧化形成粘糠醛、黏糠酸；苯酚可以羥基化形成兒茶酚、氫醌、1,2,4-苯三醇等，氫醌進入骨髓，在髓過氧化物酶(MPO)的作用下進一步氧化生成1,4-苯醌[4]。苯酚及其酚類代謝物均可與谷胱甘肽、硫酸鹽或葡萄糖苷酸形成鹽類，通過尿液排出體外。上述代謝物在苯的骨髓造血毒性中發(fā)揮不同程度的作用。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α，在常氧狀態(tài)下很快被泛素化降解，而在缺氧狀態(tài)下高表達。HIF-1α是調(diào)節(jié)代謝適應(yīng)和細胞對缺氧反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，對造血干細胞的增殖、自我更新、骨髓歸巢有重要作用[13-14]。

本研究中，構(gòu)建HIF-1α穩(wěn)定高表達的細胞模型，采用3種苯代謝物染毒高表達HIF-1α的K562細胞及對照組K562細胞24 h后，分別檢測其增殖率、凋亡率和細胞周期分布。結(jié)果顯示，1,4-苯醌染毒后，兩株細胞均呈現(xiàn)增殖抑制且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，1,4-苯醌濃度為80 μmol/L時，高表達HIF-1α的K562細胞較對照組K562細胞增殖抑制減弱。氫醌和苯酚在較高濃度染毒后，對照組K562細胞亦出現(xiàn)增殖抑制，而高表達HIF-1α的K562細胞增殖抑制不明顯。實驗結(jié)果表明高表達HIF-1α后，可削弱3種苯代謝物對K562細胞的增殖抑制效應(yīng)。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，1,4-苯醌染毒后，兩株細胞的細胞凋亡率增加且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。高濃度1,4-苯醌染毒時，高表達HIF-1α的K562細胞較對照組K562細胞凋亡減弱。氫醌和苯酚染毒后，兩株細胞的凋亡率與未染毒組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，高表達HIF-1α 的K562細胞的凋亡率較對照組K562細胞亦無顯著差異。以上結(jié)果表明HIF-1α高表達后，較高濃度苯的代謝物對K562細胞的凋亡誘導(dǎo)作用減弱。細胞周期的檢測結(jié)果顯示，3種苯代謝物均可引起K562細胞周期阻滯在G0/G1期或S期。綜上結(jié)果，提示HIF-1α可在一定程度上降低苯代謝物引起的細胞毒性作用，其作用的發(fā)揮可能是通過調(diào)節(jié)細胞周期參與調(diào)節(jié)細胞增殖及凋亡。通過對3種苯代謝物細胞毒性的比較，發(fā)現(xiàn)1,4-苯醌引起的細胞毒性大于氫醌和苯酚。

既往研究使用苯的代謝物處理K562細胞后的細胞毒性結(jié)果和本研究結(jié)果基本一致[15-17]。 Jiang等[18]人通過腺病毒感染SCN-cells使HIF-1α高表達，使細胞增殖能力增強2倍、細胞遷移能力增強1.4倍。而Chen等[19]通過siRNA 降低K562細胞中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α低表達的K562細胞的增殖能力、集落形成能力降低。Zhang等[20]通過構(gòu)建HIF-1α敲除的CML小鼠模型，發(fā)現(xiàn)HIF-1α敲除的CML小鼠通過誘導(dǎo)白血病干細胞的凋亡、損害細胞周期進程進而削弱其增殖及自我更新能力。Meng等[8]發(fā)現(xiàn)苯染毒的小鼠骨髓細胞中，HIF-1α表達降低，提示HIF-1α參與到小鼠骨髓增殖抑制過程中。

因此，HIF-1α高表達對于苯代謝物誘導(dǎo)的細胞毒性具有保護作用，但具體的調(diào)控機制仍有待研究，本研究可為進一步探討HIF-1α在苯代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)造血毒性中的作用提供線索。

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