3種粒徑納米氧化鋅與常規(guī)氧化鋅對(duì)大鼠的亞慢性毒性

洪麗玲，張?zhí)鞂?

（1．上?；ぱ芯吭河邢薰緳z測(cè)中心，上海200062；2．中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)系衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，上海200433）

納米材料的生物學(xué)反應(yīng)與其表面效應(yīng)、體積效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)有關(guān)。現(xiàn)有資料表明，金屬氧化物等納米材料能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和自由基的生成，造成多種毒性損傷，且納米粒徑越小毒性越大[1-2]。目前，納米氧化鋅(ZnO)已應(yīng)用于工業(yè)和化妝品產(chǎn)品，在橡膠制品、油漆涂料、化纖紡織、醫(yī)學(xué)診斷和治療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，因此其安全性越來(lái)越受到關(guān)注。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)對(duì)納米ZnO的毒性開展了很多研究。有報(bào)道指出，納米ZnO可能表現(xiàn)出細(xì)胞毒性、遺傳毒性、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和凋亡、神經(jīng)毒性以及炎癥反應(yīng)[4-6]；另有一些體內(nèi)的短期毒性研究指出納米ZnO的靶器官可能是肝臟、脾臟、肺、腎臟和心臟[7-9]。但目前尚缺乏對(duì)納米ZnO和常規(guī)ZnO慢性或亞慢性毒性和毒作用的比較資料。因此，本研究以3種粒徑納米ZnO和常規(guī)ZnO為對(duì)象，通過腹腔注射方式觀察其對(duì)SD大鼠的亞慢性毒性，比較兩者的毒作用特征，擬為納米ZnO及其他納米物質(zhì)的安全性評(píng)價(jià)積累資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

納米ZnO(粒徑30、50和100 nm)，白色粉末，平均粒徑約10 nm，比表面積＞10～60 m2/g，表面電阻1×105～1×1010Ω，水懸浮液pH值6.0～8.0，純度≥99.9%，購(gòu)自杭州萬(wàn)景新材料有限公司；常規(guī)ZnO(顆粒直徑≤1 μm，購(gòu)自Sigma)。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)測(cè)定試劑盒購(gòu)自日本W(wǎng)AKO公司；尿素氮(urea n itrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司。ADVIA2120 血液細(xì)胞分析儀(拜耳，德國(guó))、7080全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI，日本)、BX43 光學(xué)系統(tǒng)顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 動(dòng)物分組及染毒

SPF級(jí)SD大鼠40只購(gòu)自上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[合格證號(hào)SCXK(滬)2013-0016]，體質(zhì)量120～140 g，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分為分5組，分別為3種粒徑的納米ZnO(30、50、100 nm)和常規(guī)ZnO(≤1 μm)染毒組及陰性對(duì)照組(注射等體積生理鹽水)，每組8只，雌雄各半。大鼠在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。溫度為17～26 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，明暗周期為12 h/12 h。動(dòng)物檢疫1周后開始試驗(yàn)。

將納米ZnO和常規(guī)ZnO分別用生理鹽水制成混懸液，使用前超聲30 min，并用漩渦攪拌器不斷攪拌，無(wú)菌操作下，以10 mg/kg連續(xù)腹腔注射42 d[10]，給藥體積按10 μL/g。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般狀況及體質(zhì)量觀察 試驗(yàn)期間對(duì)動(dòng)物的一般狀況進(jìn)行觀察并記錄體質(zhì)量變化情況。

1.3.2 血象及血清生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 停藥后第2天進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，取2 mL全血EDTA-K2抗凝后進(jìn)行紅細(xì)胞數(shù)目(red blood cell，RBC)、血紅蛋白(hemoglobin， HGB)、 白 細(xì) 胞 數(shù) 目 (white blood cell count，WBC)、中性粒細(xì)胞比例(neutrophil ratio，NEUT)、血小板數(shù)目(blood platelet，PLT)、淋巴細(xì)胞比例(lymphocyte ratio， LYMPH)和 單 核 細(xì) 胞 計(jì) 數(shù) (monocyte count，MONO)血象檢查。另取5 mL全血待自然凝固后取血清進(jìn)行ALT、AST、BUN、CRE等生化指標(biāo)檢測(cè)，分析肝腎功能的變化。

1.3.3 臟器系數(shù)計(jì)算 解剖動(dòng)物，取肝、腎、脾、肺、睪丸臟器，生理鹽水沖洗血污，濾紙輕輕拭干，稱取質(zhì)量，按下式計(jì)算臟器系數(shù)。

臟器系數(shù)=臟器濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100

1.3.4 組織病理學(xué)檢查 10%福爾馬林固定主要器官(肝臟、腎臟、脾臟、肺臟及睪丸)，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.5 精子涂片制作 剖開腹腔，暴露睪丸，分離兩側(cè)附睪，用眼科剪剖開附睪組織，與適量生理鹽水混勻、涂片、固定、染色和觀察。

精子畸形率(%)=畸形精子數(shù)/受檢精子總數(shù)×100%

1.3.6 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 用TUNEL法進(jìn)行大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)，二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)顯色后，光學(xué)顯微鏡下觀察。每例切片計(jì)數(shù)5個(gè)400倍視野，以平均每100個(gè)細(xì)胞中含凋亡細(xì)胞的個(gè)數(shù)作為凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及體質(zhì)量變化

試驗(yàn)期間，各組動(dòng)物的一般活動(dòng)表現(xiàn)、攝食、飲水、分泌物和糞便性狀正常，外觀均無(wú)明顯異常，無(wú)動(dòng)物死亡。體質(zhì)量是反應(yīng)中毒后綜合性變化的指標(biāo)。由表1可見，各染毒組與對(duì)照組相比，大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。

表1 不同種類ZnO染毒不同時(shí)間大鼠體質(zhì)量的變化(-x±s，n=8)

2.2 臟器系數(shù)

由表2可見，與對(duì)照組比較，30 nm ZnO組的肝、脾、腎的臟器系數(shù)升高；50 nm ZnO組脾的臟器系數(shù)升高；100 nm ZnO組肝的臟器系數(shù)升高；常規(guī)ZnO組肺、腎的臟器系數(shù)升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。與常規(guī)ZnO組比較，30和50 nm ZnO組脾的臟器系數(shù)均升高；30、50和100 nm ZnO組肺的臟器系數(shù)均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。

表2 不同種類ZnO染毒大鼠臟器系數(shù)的變化(，n=8)

表2 不同種類ZnO染毒大鼠臟器系數(shù)的變化(，n=8)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與常規(guī)ZnO組相比，#P＜0.05.

組別 肝 脾 肺 腎 睪丸納米ZnO 30 nm 10.01±2.06* ，#1.06±0.20* #1.70±0.17 2.44±0.40* 3.02±0.21 50 nm 9.54±1.96 ，#0.95±0.18* #1.64±0.19 2.34±0.52 3.02±0.09 100 nm 10.77±2.32* 0.90±0.22 #1.83±0.21 2.49±0.52 2.96±0.33常規(guī)ZnO 9.61±2.26 0.78±0.12 1.96±0.22* 2.39±0.55* 3.34±1.23對(duì)照組 9.06±1.55 0.77±0.11 1.76±0.28 2.28±0.45 3.02±0.09

2.3 血象指標(biāo)

由表3可見，與對(duì)照組相比，3種粒徑納米ZnO組和常規(guī)ZnO組的RBC、NEUT比例和PLT均明顯升高(P＜0.05)，而LYMPH下降(P＜0.05)；30、50 nm ZnO組的HGB均明顯下降(P＜0.05)；僅30 nm ZnO的WBC增加(P＜0.05)。與常規(guī)ZnO組比較，30、50 nm ZnO組的HGB下降，而PLT明顯升高(P＜0.05)，30 nm ZnO組的WBC顯著升高(P＜0.05)。

表3 不同種類ZnO染毒對(duì)大鼠血象指標(biāo)的影響(，n=8)

表3 不同種類ZnO染毒對(duì)大鼠血象指標(biāo)的影響(，n=8)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與常規(guī)ZnO組相比，#P＜0.05.

組別 -6 RBC(10/μL) HGB(g/dL) -3 WBC(10/μL) NEUT(%) LYMPH(%) MONO(%) PLT(μL/L)納米ZnO 30 nm 9.48±0.63* ，#139.00±4.28* ，#10.37±2.61* 27.40±7.57* 68.24±7.52* 3.05±1.09 ，#1.82±0.23*50 nm 9.50±0.76* ，#133.88±6.66* 9.62±3.29 35.21±9.58* 59.81±9.73* 3.54±0.94 ，#1.88±0.16*100 nm 9.36±0.40* 149.25±4.56 9.67±4.32 27.80±8.12* 67.18±7.60* 3.50±0.62 1.62±0.15*常規(guī)ZnO 9.14±0.73* 148.50±5.10 6.30±2.29 30.38±9.56* 65.19±10.20* 3.41±1.14 1.57±0.08*對(duì)照組 8.59±0.57 145.88±4.42 6.26±1.85 14.43±2.55 80.40±3.56 4.09±1.42 1.35±0.13

2.4 血清生化指標(biāo)

由表4可見，與對(duì)照組比較，3種粒徑納米ZnO組和常規(guī)ZnO組的ALT均下降(P＜0.05)，AST/ALT值升高(P＜0.05)；30 nm ZnO組的BUN升高(P＜0.05)。與常規(guī)ZnO組比較，3種粒徑納米ZnO組的BUN均上升(P＜0.05)；30和50 nm ZnO組的AST均下降(P＜0.05)。各組間血清CRE含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。

表4 不同種類ZnO染毒對(duì)大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響(，n=8)

表4 不同種類ZnO染毒對(duì)大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響(，n=8)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與常規(guī)ZnO組相比，P＜0.05.

組別 ALT(U/L) AST(U/L) AST/ALT BUN(mmol/L) CRE(μmol/L)納米ZnO 30 nm 468.86±140.21* #1 187.57±91.79 2.69±0.70*7.40±0.93* 30.83±3.31 50 nm 484.38±60.04* #，#1 153.75±138.68 2.40±0.26* #7.01±1.16 30.01±2.95 100 nm 511.75±50.71* 1 284.12±95.93 2.52±0.22* #7.11±1.10 29.28±4.38常規(guī)ZnO 520.63±93.05* 1 338.13±105.10 2.67±0.57* 6.15±1.25 30.28±10.55對(duì)照組 662.63±80.46 1 276.13±76.36 1.94±0.18 6.38±0.97 28.08±3.50

2.5 精子畸形情況

由表5可見，僅30及50 nm ZnO組誘發(fā)的精子畸形率高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。納米ZnO引起的精子形態(tài)改變有：無(wú)定形、無(wú)鉤、香蕉形、胖頭、尾折疊等。

表5 不同種類ZnO染毒對(duì)雄性大鼠精子畸形的影響(，n=4)

表5 不同種類ZnO染毒對(duì)雄性大鼠精子畸形的影響(，n=4)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05.

組別 受檢精子總數(shù)(個(gè)) 畸形精子數(shù)(個(gè)) 畸形率(%)納米ZnO 30 nm 4 200 44 1.05±0.29*50 nm 4 458 26 0.81±0.27*100 nm 4 128 30 0.73±0.23常規(guī)ZnO 4 094 26 0.63±0.20對(duì)照組 4 462 11 0.24±0.20

2.6 大鼠臟器的組織病理學(xué)觀察

睪丸組織除對(duì)照組和常規(guī)ZnO組各級(jí)生精細(xì)胞層次清晰外(圖1A和1B)，3種納米ZnO均對(duì)大鼠睪丸組織有明顯影響。100 nm ZnO組管壁上生精細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組，層次稍微減少，排列稍紊亂(圖1C)；50 nm ZnO組睪丸組織管壁上生精細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，層次亦明顯減少，排列紊亂，分層不明顯，形成不規(guī)則空隙，但睪丸間質(zhì)未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1D)；30 nm ZnO組睪丸組織管壁上生精細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，管腔內(nèi)精子極少，個(gè)別曲細(xì)精管內(nèi)僅見緊靠基膜的支持細(xì)胞及精原細(xì)胞，而其余各級(jí)生精細(xì)胞及精子消失，表現(xiàn)為生精阻滯，曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞部分脫落，阻塞于管腔內(nèi)，或生精細(xì)胞排列紊亂，但睪丸間質(zhì)未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1E)。其余各染毒組的肝臟、腎臟、脾臟、肺臟均未見明顯組織病理學(xué)改變。

2.7 大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡情況

TUNEL檢測(cè)顯示，正常大鼠生精小管偶見生精細(xì)胞凋亡(圖2A)，納米ZnO組細(xì)胞凋亡明顯，凋亡細(xì)胞核呈棕褐色，核呈固縮狀、或染色質(zhì)向周邊聚集、或呈核碎片狀，大多數(shù)凋亡為初級(jí)精母細(xì)胞(圖2B～2E)。由圖2F可見，納米ZnO各組凋亡指數(shù)與對(duì)照組比較均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且凋亡指數(shù)隨著納米ZnO粒徑的下降而上升(P＜0.05)。而常規(guī)ZnO組與對(duì)照組的細(xì)胞凋亡指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

現(xiàn)有的短期體內(nèi)或體外毒性研究資料表明，納米ZnO的作用靶器官是肝臟[11-12]， Li等[8]的研究結(jié)果表明采用口服或者腹腔注射的方式可導(dǎo)致納米ZnO在肝、肺、脾和腎中積累，納米ZnO還可能引起炎癥，肝細(xì)胞壞死和脫落[13]。本研究結(jié)果顯示，納米ZnO可導(dǎo)致肝、脾、腎多個(gè)臟器系數(shù)改變，且粒徑越小的納米ZnO受影響的臟器越多，如30 nm ZnO組肝、脾、腎的臟器系數(shù)均升高，而50和100 nm ZnO組均只有一個(gè)臟器系數(shù)改變。另外，納米ZnO導(dǎo)致的臟器系數(shù)的臟器與常規(guī)ZnO有差異。推測(cè)與納米ZnO的表面效應(yīng)、體積效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)有關(guān)[11]。

本研究的血象指標(biāo)顯示，納米ZnO和常規(guī)ZnO均可引起骨髓紅細(xì)胞增生活躍的增生性貧血現(xiàn)象，但納米ZnO明顯比常規(guī)ZnO嚴(yán)重，并且納米ZnO的作用有隨粒徑下降而增強(qiáng)的趨勢(shì)。以往研究表明，過量的常規(guī)鋅和鋅化合物會(huì)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生貧血[14-15]。推測(cè)動(dòng)物過量攝入鋅會(huì)阻礙機(jī)體吸收銅和鐵，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)障礙和貧血。本研究還發(fā)現(xiàn)，納米ZnO和常規(guī)ZnO組的LYMPH及NEUT比例較對(duì)照組均顯著變化(P＜0.05)，30 nm ZnO組的WBC數(shù)與對(duì)照組和常規(guī)ZnO組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。研究還觀察到納米ZnO和常規(guī)ZnO組均能誘導(dǎo)PLT顯著升高(P＜0.05)，血小板數(shù)有隨著粒徑下降而增高的趨勢(shì)。對(duì)于血小板數(shù)的改變可能是由于大鼠出現(xiàn)增生性貧血、骨髓造血活躍，導(dǎo)致血小板增生所致，但對(duì)于上述白細(xì)胞的改變，因無(wú)其他證據(jù)，原因尚不清楚。

血清生化學(xué)指標(biāo)顯示，與對(duì)照組比較，30 nm ZnO組的肝、腎功能均有明顯改變，其他粒徑納米ZnO和常規(guī)ZnO僅有肝功能的輕度改變。Wang等[14]在一次灌胃給予5 g/kg納米ZnO和常規(guī)ZnO對(duì)小鼠的急性毒性作用的比較中觀察到納米和常規(guī)ZnO均可能導(dǎo)致肝、腎功能改變，常規(guī)ZnO對(duì)肝功能的影響比納米ZnO嚴(yán)重，而對(duì)腎功能的影響兩者無(wú)明顯差別。這是由于大小鼠的種間差異還是由于劑量和作用時(shí)間的差異所致有待進(jìn)一步研究。但研究結(jié)果均提示肝、腎可能是納米ZnO的作用靶器官。

圖1 不同種類ZnO染毒后睪丸的組織病理學(xué)改變(HE，×400)

圖2 不同ZnO染毒組大鼠睪丸生精細(xì)胞的凋亡情況(DAB，×400)

本研究還觀察到，3種粒徑納米ZnO組導(dǎo)致睪丸組織細(xì)胞排列紊亂，分層不明顯，形成不規(guī)則空隙，TUNEL法檢測(cè)可見生精細(xì)胞的凋亡，而對(duì)照組和常規(guī)ZnO組無(wú)明顯病理改變和生精細(xì)胞凋亡。30 nm和50 nm ZnO組還可導(dǎo)致精子畸形率增高。郭利利等[10]采用隔天腹腔注射200和500 mg/kg的納米ZnO(直徑30 nm)共5次，停藥1周后，觀察其對(duì)雄性ICR小鼠的急性毒性。結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，活精子率降低、精子畸形率升高(P＜0.05)；500 mg/kg組上述指標(biāo)變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TUNEL檢測(cè)顯示，納米ZnO處理后睪丸生精細(xì)胞凋亡率增加(P＜0.05)。研究結(jié)果表明睪丸是腹腔注射暴露條件下納米ZnO較為敏感的靶器官。

綜上所述，納米ZnO的亞慢性毒性明顯高于常規(guī)ZnO；納米ZnO的作用靶器官可能是睪丸、肝、骨髓和腎；且有隨著粒徑的降低，受影響的器官數(shù)和損傷程度加重的趨勢(shì)。而常規(guī)ZnO的作用靶器官是骨髓，另外肝、腎和肺也有可能，但還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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