輻射誘發(fā)大鼠體內(nèi)旁效應(yīng)中肺及腎組織凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)變化

張朝寧 李金田* 劉永琦 藺興遙

（1．甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床基礎(chǔ)教研室，甘肅 蘭 州 730000；2．敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭 州 730000）

惡性腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，放療是治療惡性腫瘤的重要手段之一，但在放療過程中射線可損傷腫瘤周圍健康組織，產(chǎn)生輻射旁效應(yīng)，影響治療效果和患者對(duì)治療的依從性，因而輻射旁效應(yīng)是輻射生物學(xué)及臨床腫瘤放療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。輻射旁效應(yīng)是指受輻射的細(xì)胞除自身產(chǎn)生變化之外，還將損傷信號(hào)傳遞至周圍未受輻射的細(xì)胞，誘導(dǎo)未受輻射的細(xì)胞產(chǎn)生與受輻射的細(xì)胞相同或相似生物學(xué)反應(yīng)的現(xiàn)象[1]。其生物學(xué)效應(yīng)主要包括DNA損傷、基因表達(dá)異常、細(xì)胞增殖與凋亡、炎癥反應(yīng)、致瘤性轉(zhuǎn)化及癌癥形成[2-5]等。輻射旁效應(yīng)的發(fā)生機(jī)制及時(shí)間效應(yīng)目前尚未完全清楚，且主要集中在體外研究中，對(duì)于更能模擬腫瘤放療過程的體內(nèi)研究尤顯不足。因此，本實(shí)驗(yàn)用不同劑量的X射線(2、4和8 Gy)照射大鼠右肺部(鉛皮屏蔽身體其余部位)建立輻射損傷模型，在照射后的不同時(shí)間點(diǎn)(6、24和48 h)檢測(cè)線粒體凋亡通路中關(guān)鍵基因Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2在直接照射右肺組織及未受照射左肺及左腎組織中的mRNA表 達(dá)變化，為輻射誘發(fā)體內(nèi)旁效應(yīng)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠70只，2～3月齡，體質(zhì)量(200±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)SCXK(甘)2015-0002]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Trizol試 劑 (美 國(guó) Invitrogen公 司 ， 批 號(hào) 94206)；DEPC處理水(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)R1600)；SYBR Fast qPCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司，批號(hào)R820)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司，批號(hào)RR036A-2)；異丙醇、無水乙醇、氯仿(天津富于精細(xì)化工有限公司)；苦味酸(北京鑫鼎鵬飛科技發(fā)展有限公司)。

1.3 主要儀器及設(shè)備

組織勻漿器(美國(guó)Bio-Gen，型號(hào)PRO200)；熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)C1000)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Kendro公司，型號(hào)D37520)；旋渦振蕩器(美國(guó)Coleparmer Votex-Genie)；Airtech超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)公司)；Bicmate 3S超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；X射線輻射儀(美國(guó)Faxitron公司，型號(hào)RX650)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大鼠分組 70只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，觀察無異常者納入實(shí)驗(yàn)組。用5%苦味酸溶液涂染動(dòng)物背部做標(biāo)記，查隨機(jī)數(shù)字表將其隨機(jī)分為10組，1個(gè)正常對(duì)照組和9個(gè)不同劑量，照射后不同時(shí)間檢測(cè)的輻射組，分別為2 Gy輻射后6 h組、2 Gy輻射后24 h組、2 Gy輻射后48 h組、4 Gy輻射后6 h組、4 Gy輻射后24 h組、4 Gy輻射后48 h組、8 Gy輻射后6 h組、8 Gy輻射后24 h組、8 Gy輻射后48 h組，每組7只。

1.4.2 大鼠飼養(yǎng)條件 大鼠在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)[SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證號(hào)為SYXK(甘)2015-0005]。動(dòng)物飼養(yǎng)室環(huán)境：溫度20～25℃、相對(duì)濕度40%～70%。

1.4.3 大鼠照射條件 在中國(guó)科學(xué)院蘭州近代物理研究所X射線輻射儀下進(jìn)行照射，照射前打開X射線輻射儀并預(yù)熱30 min，調(diào)試X射線的劑量率。同時(shí)將輻射各組大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg)，固定于屏蔽模具內(nèi)，X射線單次照射右肺部。劑量率為0.8 Gy/min，各組吸收劑量分別為2、4、8 Gy。正常對(duì)照組的大鼠同步進(jìn)行相同麻醉，但不予照射。

1.4.4 大鼠肺及腎組織取材 分別于照射后6、24、48 h處死大鼠，取出右肺、左肺、左腎，冰生理鹽水沖洗、剪切，分別放入相應(yīng)的凍存管，-80 ℃凍存，備用。

1.4.5 大鼠肺及腎組織目的基因mRNA的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測(cè)肺和腎組織中Cytc，Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)。各目的基因及內(nèi)參引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，并在GenBank上核對(duì)證實(shí)(見表1)。按照Trizol說明書從肺、腎組織中提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度D(260)和D(280)值，取RNA 2 μg加入逆轉(zhuǎn)錄體系，逆轉(zhuǎn)錄條件為 37 ℃ 、 5 min， 85 ℃ 、 5 s， 4 ℃ 、 10 min。 以cDNA為模板，上PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為SYBR Fast Real-time PCR Mix (2×) 12.5 μL，引物2 μL，cDNA 2 μL，并加滅菌蒸餾水至25 μL。反應(yīng)條件為95℃、5 s，60 ℃、10 s，循環(huán)40次。用2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 各目的基因及內(nèi)參引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，服從正態(tài)-或近似正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行處理，兩兩比較時(shí)采用SNK法，重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的計(jì)量資料用方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺和腎組織中Cytc mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

右肺、左肺、左腎中，2、4、8 Gy輻射各組Cytc mRNA相對(duì)表達(dá)量在照射后均明顯升高，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。見表2。

表2 各組大鼠肺腎組織中Cytc mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(-x±s，n=7)

2.2 各組大鼠肺腎組織中Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

右肺、左肺、左腎中，2、4、8 Gy輻射各組Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量在照射后均明顯升高，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。見表3。

表3 各組大鼠肺腎組織中Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較，n=7)

表3 各組大鼠肺腎組織中Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較，n=7)

與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01.

組別 右肺 左肺 左腎正常對(duì)照組 1.00±0.07 1.00±0.06 1.00±0.07 2 Gy輻射后6 h組 3.91±0.73** 2.46±0.50** 2.38±0.76**24 h組 2.41±0.03** 2.39±0.29** 2.50±0.58**48 h組 3.12±0.28** 2.68±0.17** 2.73±0.37**4 Gy輻射后6 h組 3.49±0.06** 2.50±0.59** 2.39±0.49**24 h組 2.60±0.25** 2.59±0.58** 2.53±0.42**48 h組 2.68±0.32** 2.42±0.42** 2.34±0.49**8 Gy輻射后6 h組 2.83± 0.21** 2.36±0.53** 2.36±0.39**24 h組 2.35±0.17** 2.88±0.06** 2.59±0.12**48 h組 4.13±0.50** 2.57±0.60** 3.11±0.37**

2.3 各組大鼠肺腎組織中Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

右肺、左肺、左腎中，2、4、8 Gy輻射各組Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量在照射后均明顯升高，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表4。

表4 各組大鼠肺腎組織中Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(，n=7)

表4 各組大鼠肺腎組織中Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(，n=7)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.

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2.4 各組大鼠肺腎組織中Bax m RNA相對(duì)表達(dá)量的比較

右肺中，除8 Gy輻射后48 h組之外，其余各組Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量在照射后均明顯升高，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。左肺中，輻射各組Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量在照射后均明顯升高，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。左腎中，除2 Gy輻射后6 h組之外，其余各組Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量在照射后均明顯升高，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表5。

表5 各組大鼠肺腎組織中Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(，n=7)

表5 各組大鼠肺腎組織中Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(，n=7)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別 右肺 左肺 左腎正常對(duì)照組 1.00±0.05 1.00±0.32 1.00±0.12 2 Gy輻射后6 h組 12.14±0.21** 6.37±0.72** 2.04±0.50 24 h組 7.86±0.64** 8.38±0.55** 4.33±1.03**48 h組 7.57±0.48** 7.06±0.82** 4.16±0.58**4 Gy輻射后6 h組 14.72±1.22** 6.25±0.78** 5.70±0.24**24 h組 6.07±0.68** 6.31±1.18** 7.71±2.08**48 h組 9.26±0.91** 7.35±1.31** 7.04±1.67**8 Gy輻射后6 h組 2.44±0.23* 7.41±1.06** 10.03±2.32**24 h組 6.87±0.69** 10.98±1.90** 16.25±0.67**48 h組 1.35±0.45 5.81±0.61** 7.83±0.54**

2.5 各組大鼠肺腎組織中Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

右肺、左肺中，2、4、8 Gy輻射各組Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在照射后均明顯降低，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。左腎中，除8 Gy輻射后6 h組之外，其余各組Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在照射后均明顯降低，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表6。

表6 各組大鼠肺腎組織中Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(，n=7)

表6 各組大鼠肺腎組織中Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(，n=7)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別 右肺 左肺 左腎正常對(duì)照組 1.00±0.10 1.00±0.09 1.00±0.09 2 Gy輻射后6 h組 0.50±0.06** 0.62±0.09* 0.61±0.06*24 h組 0.46±0.05** 0.72±0.02* 0.55±0.14*48 h組 0.68±0.02* 0.60±0.09* 0.65±0.09*4 Gy輻射后6 h組 0.58±0.08* 0.75±0.10* 0.56±0.05*24 h組 0.59±0.04* 0.65±0.05* 0.52±0.16*48 h組 0.48±0.05** 0.64±0.09* 0.65±0.08*8 Gy輻射后6 h組 0.55±0.06* 0.58±0.11* 0.81±0.13 24 h組 0.45±0.02** 0.48±0.08** 0.49±0.07**48 h組 0.48±0.09** 0.76±0.08* 0.67±0.05*

3 討論

研究已經(jīng)證實(shí)輻射誘發(fā)的體內(nèi)旁效應(yīng)不僅能在相鄰組織或同一器官的不同部位產(chǎn)生，還可在被屏蔽的某些遠(yuǎn)源器官中發(fā)生，即同一機(jī)體不同器官之間的旁效應(yīng)現(xiàn)象[6-7]。也有研究表明，細(xì)胞凋亡是輻射旁效應(yīng)早期的生物學(xué)效應(yīng)[8]，線粒體參與了輻射旁效應(yīng)的早期過程，Cytc在輻射旁效應(yīng)信號(hào)響應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[9-11]。線粒體是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起主要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞器，線粒體接受輻射誘導(dǎo)的信號(hào)刺激后，對(duì)凋亡信號(hào)進(jìn)行整合、處理并釋放內(nèi)外膜間隙的促凋亡因子如Cytc等，激活下游通路中的Caspase家族，使凋亡進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的階段[12-13]。Bcl-2家族在此過程中發(fā)揮了重要作用，促凋亡基因Bax可以引起線粒體釋放Cytc，抑凋亡基因Bcl-2可以中和Bax的表達(dá)，還可抑制Cytc的釋放，使Cytc無法達(dá)到激活下游Caspase的表達(dá)閾值，從而保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生凋亡[14-15]。

輻射旁效應(yīng)依賴的參數(shù)包括輻射劑量、劑量率、劑量分級(jí)、輻射質(zhì)量、細(xì)胞或組織類及所研究的生物學(xué)終點(diǎn)。其中輻射劑量與旁效應(yīng)水平的研究顯示旁效應(yīng)損傷的程度存在劑量響應(yīng)曲線的飽和效應(yīng)，輻射劑量越高，旁效應(yīng)損傷不會(huì)加重，可能還會(huì)因?yàn)樨?fù)反饋調(diào)節(jié)等機(jī)制而減輕。但是對(duì)放射治療技術(shù)如近距離放射治療、立體定向放射外科手術(shù)、術(shù)中放療及網(wǎng)格療法等應(yīng)用高劑量的輻射而言，研究旁效應(yīng)的劑量是非常重要的[16-17]。旁效應(yīng)的時(shí)間效應(yīng)也未完全清楚，因此，本實(shí)驗(yàn)基于凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化探討體內(nèi)旁效應(yīng)與輻射劑量及輻射后時(shí)間的關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量的X射線(2、4、8 Gy)照射大鼠右肺后不同時(shí)間點(diǎn)(6、24和48 h)，大鼠右肺組織中Cytc、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)，除8 Gy輻射后48 h組之外，右肺中Bax的表達(dá)也明顯上調(diào)，Bcl-2在照射后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均下調(diào)，表明線粒體響應(yīng)了輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激，對(duì)信號(hào)刺激整合判斷后釋放Cytc，Cytc表達(dá)增加激活了下游通路中的Caspase-9，進(jìn)一步激活效應(yīng)子Caspase-3的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-3激活表達(dá)后可以酶解滅活Bcl-2，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，不能中和Bax的表達(dá)，Bax表達(dá)上調(diào)，促使凋亡發(fā)生。

在左肺組織中，Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax m RNA表達(dá)在照射后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯上調(diào)，Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。在左腎組織中，Cytc、Caspase-9 mRNA表達(dá)在照射后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯上調(diào)，除8 Gy輻射后6 h組之外，Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)。除2 Gy輻射后6 h組之外，左腎中Bax mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)，且在照射后24 h達(dá)到峰值，48 h有所下降，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，分析認(rèn)為可能是受照射后腎臟啟動(dòng)自我修復(fù)機(jī)制，對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù)的原因；8 Gy輻射后的各組Bax表達(dá)量最高，與已經(jīng)報(bào)道的旁效應(yīng)的飽和效應(yīng)存在矛盾，分析認(rèn)為體內(nèi)旁效應(yīng)的影響因素非常復(fù)雜，與所檢測(cè)的生物學(xué)終點(diǎn)密切相關(guān)。左腎中不同輻射劑量組Caspase-3 mRNA表達(dá)量在照射后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于正常對(duì)照組、右肺及左肺的表達(dá)量，分析認(rèn)為可能是Caspase-3的表達(dá)水平與組織類型有關(guān)，但是在同樣的組織中，檢測(cè)指標(biāo)不同，旁效應(yīng)水平又有所變化。

總之，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明未直接照射的左肺和左腎組織也對(duì)輻射產(chǎn)生了響應(yīng)，輻射誘導(dǎo)了體內(nèi)旁效應(yīng)的產(chǎn)生。不同輻射劑量之間尚未發(fā)現(xiàn)明顯的效應(yīng)差異，研究中的最低輻射劑量和最高輻射劑量均可誘導(dǎo)旁效應(yīng)的發(fā)生，這與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道類似，無論何種射線照射，旁效應(yīng)存在劑量響應(yīng)曲線的飽和效應(yīng)[18-19]。右肺、左肺、左腎組織中，Cytc、Caspase-9、Bcl-2未發(fā)現(xiàn)一致的表達(dá)規(guī)律和動(dòng)態(tài)變化的特點(diǎn)，我們分析認(rèn)為輻射旁效應(yīng)的時(shí)間效應(yīng)受多種因素的影響，也因檢測(cè)指標(biāo)的不同而不同，故照射后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間未發(fā)現(xiàn)明顯的效應(yīng)差異。但是Bax在旁器官腎臟中的表達(dá)不符合飽和效應(yīng)，且出現(xiàn)了動(dòng)態(tài)變化的特點(diǎn)；Caspase-3在腎臟中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組、右肺、左肺的表達(dá)量，因而在體內(nèi)旁效應(yīng)中，輻射劑量、組織類型和所檢測(cè)的指標(biāo)是不可忽略的影響因素，在臨床放療時(shí)，要綜合各種影響因素評(píng)判射線對(duì)正常組織的損傷。

綜上所述，不同劑量X射線照射大鼠右肺后誘導(dǎo)出現(xiàn)了線粒體凋亡通路中相關(guān)基因的異常表達(dá)，未照射左肺及左腎組織也呈現(xiàn)相似的基因表達(dá)變化，表明未直接照射組織也對(duì)輻射產(chǎn)生了響應(yīng)，輻射誘導(dǎo)了體內(nèi)旁效應(yīng)的發(fā)生，但其具體的發(fā)生機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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