硒對(duì)慢性鎘暴露致大鼠腎損傷的保護(hù)作用與機(jī)制

周慶彪，劉 穎，孔德欽，張佳欣，于衛(wèi)華，柏 樺* ， 海春旭*

（空軍軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西 安 710032）

鎘(cadmium，Cd)作為重金屬毒性元素，進(jìn)入機(jī)體主要蓄積在腎臟，引起腎臟氧化應(yīng)激損傷[1]，破壞細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬、凋亡和壞死[2-4]，最終發(fā)展為腎功能障礙甚至是腎衰竭。國(guó)內(nèi)外學(xué)者[5-7]試圖找到能有效拮抗鎘腎毒性的藥物和干預(yù)措施，但效果一直不理想，如何有效預(yù)防和解決鎘暴露導(dǎo)致的腎損傷仍是十分棘手的科學(xué)難題。維持細(xì)胞氧化還原(redox)穩(wěn)態(tài)是生命活動(dòng)中最基本的反應(yīng)體系，許多因素影響該平衡體系。因此，為了探究硒在鎘暴露導(dǎo)致的腎臟組織損傷中是否發(fā)揮保護(hù)作用及其可能機(jī)制，本研究以氯化鎘誘導(dǎo)大鼠腎臟慢性損傷，并給予人體必需微量元素硒干預(yù)，通過觀察腎臟結(jié)構(gòu)改變，測(cè)定腎功能、氧化應(yīng)激和分子生物學(xué)等指標(biāo)，評(píng)估硒是否發(fā)揮保護(hù)作用。同時(shí)，對(duì)SETD6、DJ-1和Nrf2等氧化和抗氧化系統(tǒng)調(diào)控分子進(jìn)行了檢測(cè)，探討了硒拮抗鎘腎毒性的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號(hào)F20100208)；亞硒酸鈉(Na2S eO3· 5H2O)，分析純，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)S5261)；DHE和Hoechst 33528熒光探針購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；尿素氮(urea nitrogen，UN)、肌酐(creatinine，CREA)苦味酸法測(cè)定試劑盒購(gòu)于北京利德曼生化股份有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)(TBA法)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(羥胺法)及 N-乙 酰 -β-D-葡 萄 糖 苷 酶 (N-acetyl-beta-dglucosidase，NAG)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物技術(shù)研究所；鼠抗β-actin抗體(1∶5 000稀釋)購(gòu)自Sigma公司；鼠抗Nrf2抗體(1∶500稀釋)購(gòu)自Novus公司；兔抗SETD6和DJ-1抗體(均1∶500稀釋)購(gòu)自Bioworld公司。主要儀器有：日立7020全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(日立公司，日本)；全波段酶標(biāo)儀(Infinite M200 PRO，Austria)；正置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品；高通量組織研磨器(Scientz-48，寧波新芝生物科技股份有限公司)；Mini-Protein電泳系統(tǒng)、蛋白半干轉(zhuǎn)裝置及凝膠成像系統(tǒng)均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物與飼養(yǎng) 48只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量100～150 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，食物與飲水自由攝取，相對(duì)濕度50%±10%，溫度(24±2) ℃，12 h/12 h交替照明和避光，每日觀察動(dòng)物情況。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將48只SD大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對(duì)照組、鎘暴露組、硒對(duì)照組、硒干預(yù)組，每組12只?？瞻讓?duì)照組每天按10 mL/kg灌胃去離子水，鎘暴露組按3 mg/kg灌胃CdCl2，硒對(duì)照組按0.01 mg/kg灌胃Na2S eO3， 硒干預(yù)組按3 mg/kg灌胃CdCl2同時(shí)按0.01 mg/kg灌胃Na2S eO3，每天1次，每周連續(xù)灌胃 6 d，共計(jì)12周。造模成功后，禁食12 h，處死動(dòng)物取血、尿和腎臟組織，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 未經(jīng)抗凝的全血經(jīng)3 500 r/min離心10 min后，取上部血清，用日立7020全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清中尿素氮和肌酐含量。各組大鼠置于代謝籠中，自由飲水，禁食，收集夜間12 h(晚20時(shí)至次日早8時(shí))尿液，2 000 r/min離心10 min后，取上清液，用日立7020全自動(dòng)生化儀測(cè)定尿液中尿素氮、肌酐和NAG，用BCA蛋白定量法測(cè)定尿液中總蛋白含量。

1.2.4 腎臟HE染色 腎組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片、脫蠟、HE染色、脫水、封片后于正置熒光顯微鏡下觀察腎小球和腎小管病理改變。

1.2.5 腎皮質(zhì)ROS水平檢測(cè) 采用DHE熒光探針檢測(cè)腎皮質(zhì)ROS水平，具體步驟如下：制備厚度為10 μm的腎組織冰凍切片，置于濕盒中，將10 μmol/L 的DHE和Hoechst 33528均按1∶1 000的比例用1×PBS稀釋，并將兩種染料混勻，向每張切片上的腎組織滴加混合液150 μL，37 ℃避光孵育15 min，1×PBS洗3次，每次2 min，封片劑封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.6 腎組織MDA、總SOD及NAG水平的測(cè)定用眼科剪將50 mg腎皮質(zhì)部分剪碎，置于1.5 mL EP管中，加入450 μL預(yù)冷的生理鹽水，低溫機(jī)器勻漿(30 Hz頻率，運(yùn)行10 s，停止30 s，重復(fù)5次)，制備成10%腎組織勻漿。勻漿液于4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清，留取30 μL用作BCA蛋白定量，余分裝保存于-80 ℃，用于MDA、總SOD及NAG水平的測(cè)定。

1.2.7 腎組織SETD6、DJ-1和Nrf2蛋白表達(dá)的測(cè)定稱取100 mg腎皮質(zhì)部分剪碎，置于2 mL EP管中，加入1 mL裂解緩沖液(1 mL RIPA裂解液+20 μL 礬酸鈉+5 μL Cocktail)，低溫機(jī)器勻漿(50 Hz頻率，運(yùn)行10 s，停止30 s，重復(fù)5次)，冰上裂解30 min，勻漿液于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，留取30 μL用作BCA蛋白定量，余下部分加入等體積2×Loading Buffer和35 μ L 二 硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，100 ℃ 煮沸5 min，置于冰中使其降到室溫后，12 000 r/min離心5 min，分裝保存于-80 ℃ ，用于Western b lotting測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量和腎臟質(zhì)量的變化

實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量的變化如圖1A所示，可見隨動(dòng)物飼養(yǎng)與染毒時(shí)間增加，各組大鼠體質(zhì)量均逐漸增加，與對(duì)照組比較，鎘暴露組、硒對(duì)照組和硒干預(yù)組的大鼠體質(zhì)量均略有升高，但各組大鼠腎臟的臟器系數(shù)無(wú)明顯差異(圖1B)。

圖1 大鼠體質(zhì)量和腎臟的臟器系數(shù)(n=12)

2.2 腎功能變化

血清中尿素氮和肌酐水平是臨床上常用的判斷腎功能的指標(biāo)。如圖2A和2B所示，鎘染毒12周后，與對(duì)照組相比，鎘暴露組大鼠血清尿素氮水平顯著升高(P＜0.05)；硒干預(yù)組大鼠與鎘暴露組比較，血清中尿素氮和肌酐水平顯著降低(P＜0.05)。尿液中尿素氮與肌酐比值和總蛋白含量均能夠反映腎損傷程度，如圖2C和2D所示，與對(duì)照組相比，鎘暴露組大鼠尿液中尿素氮與肌酐比值和總蛋白含量均顯著升高(P＜0.05)；而硒對(duì)照組和硒干預(yù)組大鼠與鎘暴露組比較，尿素氮與肌酐比值和總蛋白含量均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 腎組織病理學(xué)變化

He染色見圖3?？梢妼?duì)照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，腎小球形狀規(guī)則，毛細(xì)血管網(wǎng)輪廓清晰。腎小管輪廓清楚，游離面刷狀緣清晰，上皮細(xì)胞排列整齊，管腔干凈。鎘暴露組大鼠腎臟病理?yè)p傷較對(duì)照組加重，可見腎小球腫脹，細(xì)胞數(shù)目增多，毛細(xì)血管網(wǎng)出現(xiàn)裂隙；腎小管廣泛性病變，排列紊亂、腫脹、管腔狹窄幾乎不見，上皮細(xì)胞壞死、結(jié)構(gòu)消失，脫落細(xì)胞堆積于管腔，伊紅染色陽(yáng)性；腎間質(zhì)充血嚴(yán)重，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯增加。硒對(duì)照組大鼠與對(duì)照組相比，腎臟組織未見明顯改變。而硒干預(yù)組腎臟病理?yè)p傷較鎘暴露組減輕，腎小球腫脹程度減小，細(xì)胞數(shù)目減少，毛細(xì)血管網(wǎng)裂隙減少；腎小管雖有病變，但排列紊亂、腫脹、管腔狹窄程度均減輕，壞死、脫落的上皮細(xì)胞也減少；腎間質(zhì)充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減少。

圖2 大鼠腎功能變化(n=12)

圖3 腎臟病理變化(×400)

2.4 腎臟ROS水平變化

DHE染色結(jié)果如圖4A所示，與對(duì)照組相比，鎘暴露組腎組織紅色熒光強(qiáng)度顯著升高，硒對(duì)照組紅色熒光強(qiáng)度略高；而硒干預(yù)組紅色熒光強(qiáng)度比鎘暴露組顯著降低。使用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行灰度分析，結(jié)果如圖4B所示：與對(duì)照組相比，鎘暴露組ROS水平顯著上升(P＜0.05)；而硒對(duì)照組和硒干預(yù)組與鎘暴露組相比ROS水平均明顯下降(P＜0.05)。

2.5 腎臟損傷檢測(cè)指標(biāo)變化

如圖5A和C所示，與對(duì)照組相比，鎘暴露組MDA和NAG水平顯著升高(P＜0.05)，硒對(duì)照組無(wú)明顯變化；而硒干預(yù)組與鎘暴露組相比，MDA水平明顯降低(P＜0.05)。圖5B中所示，與對(duì)照相比，鎘暴露組總SOD活性較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，硒對(duì)照組無(wú)明顯變化；而硒干預(yù)組與鎘暴露組相比總SOD活性升高(P＜0.05)。

2.6 腎臟組織蛋白表達(dá)

如圖6所示，鎘暴露組與對(duì)照組相比，DJ-1和Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)；硒對(duì)照組與對(duì)照組相比，SETD6和DJ-1蛋白表達(dá)水平均較低(P＜0.05)；而與鎘暴露組相比，硒對(duì)照組和硒干預(yù)組SETD6蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)，硒對(duì)照組DJ-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，而硒干預(yù)組DJ-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)，硒干預(yù)組Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。

圖5 腎組織損傷監(jiān)測(cè)指標(biāo)變化(n=6)

3 討論

盡管鎘進(jìn)入機(jī)體后，能夠通過氧化應(yīng)激、自噬、凋亡、壞死等多種途徑引起急性或慢性損傷，但越來(lái)越多的研究[8-10]認(rèn)為其毒性作用主要是破壞細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)氧化損傷，具體機(jī)制尚不清楚。研究表明，游離的鎘離子一方面具有高度的巰基親和性，主要通過攻擊細(xì)胞內(nèi)的巰基，導(dǎo)致局部氧化還原失衡，引起氧化應(yīng)激[11]；另一方面鎘離子能夠替代各種蛋白質(zhì)中的氧化還原活性元素[12]，通過Fenton反應(yīng)直接促進(jìn)羥基自由基(·OH)的產(chǎn)生，加劇機(jī)體的氧化損傷[13]。但是，尚缺乏有效的藥物和手段來(lái)應(yīng)對(duì)鎘毒性。因此，本研究通過CdCl2連續(xù)給予大鼠灌胃12周，建立慢性鎘暴露動(dòng)物模型，并給予硒干預(yù)，探討硒對(duì)鎘暴露致腎功能損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

正常情況下，腎小球和腎小管發(fā)揮濾過和重吸收作用。鎘暴露后大鼠血液和尿液中尿素氮、肌酐及總蛋白含量升高，腎組織NAG活性升高，均提示腎小球和腎小管功能障礙。而腎臟組織病理結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了腎小球和腎小管的結(jié)構(gòu)損傷。腎臟組織冰凍切片DHE染色結(jié)果(圖4A)提示，鎘暴露后ROS水平顯著升高，且MDA水平顯著升高(圖6A)與總SOD活性被抑制(圖6B)提示腎臟組織遭受氧化應(yīng)激，自身清除ROS的能力受到影響，不能及時(shí)清除過量的ROS，使機(jī)體對(duì)鎘更為敏感[14]，如此惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致腎臟組織脂質(zhì)過氧化損傷程度加重。而給予硒干預(yù)(0.01 mg/kg)后，腎臟損傷指標(biāo)如尿素氮、肌酐、尿液總蛋白、早期腎臟損傷標(biāo)志物NAG[15]及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA等均得到了一定程度的改善，且硒干預(yù)組大鼠腎臟組織病理改變較鎘暴露組明顯減輕，表明硒對(duì)鎘暴露致腎功能損傷具有保護(hù)作用。為了研究硒發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制，本研究通過Western blotting實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)蛋白在各組中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，以期發(fā)現(xiàn)其中的差異。

圖6 腎組織蛋白表達(dá)水平(n=3)

Nrf2作為調(diào)控抗氧化系統(tǒng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，被國(guó)內(nèi)外許多研究[6，16-17]認(rèn)為在維持機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘暴露能顯著抑制腎組織中Nrf2蛋白表達(dá)，減弱機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能；而硒干預(yù)后，減弱了鎘對(duì)Nrf2的抑制作用，Nrf2蛋白表達(dá)量顯著升高，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能得到恢復(fù)，氧化應(yīng)激損傷減輕。但是，我們前期的研究[18]發(fā)現(xiàn)單一使用或聯(lián)合使用抗氧化劑，仍不能有效應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激和自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，這提示想要有效解決鎘毒性，僅僅考慮抗氧化系統(tǒng)可能是不夠的。因此本研究對(duì)氧化應(yīng)激傳感器DJ-1進(jìn)行了檢測(cè)。DJ-1是DJ-1/PARK7基因的產(chǎn)物，廣泛地表達(dá)并參與多種細(xì)胞過程的調(diào)控，能夠調(diào)節(jié)NF-κB[19]、 Nrf2[20]等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性。DJ-1可以減弱Keap1對(duì)Nrf2的封閉作用，抑制Nrf2的泛素化，進(jìn)而促進(jìn)Nrf2穩(wěn)定發(fā)揮抗氧化作用[20]。鎘暴露后DJ-1蛋白表達(dá)被顯著抑制，硒干預(yù)后DJ-1蛋白表達(dá)量升高。這些變化提示硒可能通過增強(qiáng)DJ-1的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)了其正向調(diào)控Nrf2的作用。硒對(duì)照組與對(duì)照組比較，DJ-1表達(dá)量低，提示DJ-1可能在氧化應(yīng)激條件下才能發(fā)揮其作用，硒可能通過某未知途徑抑制了DJ-1的 表 達(dá) 量 。 而Chen等[21-24]在HEL-K562細(xì) 胞 、HEK-293T細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞增殖和炎癥進(jìn)程中發(fā)揮重要作用的蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SETD6(SET domain containing protein 6，SETD6)，在正常生理?xiàng)l件下與DJ-1以物理形式結(jié)合在染色質(zhì)上，抑制其功能，從而負(fù)調(diào)控抗氧化關(guān)鍵分子Nrf2的作用，可能是氧化還原平衡失調(diào)的關(guān)鍵因子。因此，我們又檢測(cè)了SETD6的變化。圖6B中，硒對(duì)照組與對(duì)照組和鎘暴露組相比，SETD6蛋白表達(dá)量較低，表明硒抑制了SETD6表達(dá)；而硒干預(yù)組與鎘暴露組相比，SETD6蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，DJ-1和Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著升高，表明硒干預(yù)通過抑制SETD6表達(dá)促進(jìn)了DJ-1和Nrf2的表達(dá)，但具體機(jī)制，仍有待繼續(xù)研究挖掘。

綜上所述，硒能有效拮抗慢性鎘暴露導(dǎo)致的大鼠腎臟毒性，其作用機(jī)制可能是氧化應(yīng)激條件下，硒通過抑制SETD6，促進(jìn)DJ-1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減輕鎘暴露誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。這一發(fā)現(xiàn)為尋找有效防治鎘中毒的藥物和干預(yù)措施及其相關(guān)機(jī)制提供了新的研究思路，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

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