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    食品中蠟樣芽胞桿菌實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

    2018-02-01 00:52:32劉立兵南匯珠孫曉霞姜彥芬王金鳳王建昌
    關(guān)鍵詞:蠟樣靈敏性芽胞

    劉立兵, 南匯珠, 孫曉霞, 姜彥芬, 王金鳳, 王建昌,*

    (1.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心, 河北 石家莊 050051; 2.河北省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院, 河北 石家莊 050051)

    *王建昌,男,高級(jí)獸醫(yī)師,博士,主要從事食源性微生物、動(dòng)物疫病分子生物學(xué)方面的研究,通信作者。

    蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)是革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌,是食品污染常見的致病菌之一[1],具有代謝通路多樣化、營(yíng)養(yǎng)需求低的特點(diǎn)[2-3]。人體感染后臨床癥狀有惡心、嘔吐、腹痛以及腹瀉等[4],食物中毒的發(fā)病率高達(dá)60%~100%[5]。探索簡(jiǎn)便、快速、高靈敏性的檢測(cè)方法是該菌研究的重點(diǎn)。

    蠟樣芽胞桿菌傳統(tǒng)的檢測(cè)方法操作過程繁瑣,檢測(cè)周期長(zhǎng),需要經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員。張志鴻等[6]建立real-time PCR方法檢測(cè)食品中的產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌,周巍等[7]通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)對(duì)酸乳中的蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行檢測(cè),賈雅菁等[8]在LAMP反應(yīng)體系中加入熒光染料,實(shí)現(xiàn)了對(duì)蠟樣芽胞桿菌的定性熒光監(jiān)測(cè);但上述方法都不能滿足簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)特點(diǎn)。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amp-lification, RPA)因其操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、不需要昂貴的設(shè)備等優(yōu)勢(shì),在醫(yī)療診斷、轉(zhuǎn)基因食品和動(dòng)物疫病檢測(cè)中受到廣泛關(guān)注[9]。RPA技術(shù)主要依賴于重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和具有鏈置換活性的DNA聚合酶在恒溫條件下(25~42 ℃)進(jìn)行,而實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)技術(shù)將RPA基礎(chǔ)反應(yīng)與熒光探針結(jié)合,具備了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增進(jìn)程的優(yōu)勢(shì),靈敏度和特異性也進(jìn)一步提高,已被廣泛運(yùn)用于細(xì)菌、病毒及寄生蟲的檢測(cè)[10]。但截至目前利用該方法檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌的研究未見報(bào)道。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與設(shè)備

    甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂(MYP)、營(yíng)養(yǎng)肉湯,購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;Premix Ex Taq,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;RAA試劑盒(熒光型),購(gòu)自浙江泰晶生物科技有限公司。

    Genie Ⅲ型等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng),英國(guó)OptiGene公司;ABI7500型實(shí)時(shí)熒光PCR儀,美國(guó)ABI公司;NanoDrop 2000C型超微量分光光度計(jì),美國(guó)Thermo Scientific公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

    實(shí)驗(yàn)所用的菌株見表1。

    表1 實(shí)驗(yàn)菌株

    +,陽(yáng)性;-,陰性。

    1.3 細(xì)菌基因組DNA的提取

    將蠟樣芽胞桿菌(CICC63301)純培養(yǎng)菌接種于10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中,37 ℃培養(yǎng)16 h。取1 mL菌液10 000 r/min離心1 min,棄上清液,將菌體沉淀按照細(xì)菌DNA提取試劑盒方法提取細(xì)菌基因組DNA,立即使用或-20 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)使用NanoDrop 2000C型超微量分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度。

    1.4 引物探針設(shè)計(jì)

    參考GenBank中蠟樣芽胞桿菌16S RNA基因序列(登錄號(hào):KY224970.1),選擇保守區(qū)域,設(shè)計(jì)real-time RPA引物及exo探針,目的片段大小為297 bp。用于蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)的real-time PCR引物及探針參照文獻(xiàn)[11]中相關(guān)序列(表2),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    表2 實(shí)驗(yàn)所用引物及探針

    1.5 Real-time RPA方法的建立

    使用RAA試劑盒(熒光型)配制單個(gè)反應(yīng)體系,其中10 μmol/L的RPA-F和RPA-R各2 μL(終濃度0.4 μmol/L),10 μmol/L exo probe 0.6 μL(終濃度0.12 μmol/L),A buffer 12.5 μL,模板1 μL,ddH2O 29.4 μL。將上述47.5 μL溶液混勻后加入到裝有凍干酶制劑的反應(yīng)管中,用移液器上下吹打至完全溶解,向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer(280 mmol/L MgAc),瞬時(shí)離心并渦旋后放入Genie III中39 ℃反應(yīng)20 min。

    1.6 Real-time PCR方法

    用于蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)的real-time PCR反應(yīng)按照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行,反應(yīng)體系為25 μL。其中Premix Ex Taq 12.5 μL,10 μmol/L PCR-F和PCR-R各1.5 μL(終濃度0.6 μmol/L),5 μmol/L PCR-probe 1 μL(終濃度0.2 μmol/L),模板1 μL,ddH2O 7.5 μL。將上述體系充分混勻后放入ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光PCR儀中,反應(yīng)程序設(shè)置為95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 變性5 s,60 ℃延伸 35 s,35個(gè)循環(huán),60 ℃收集熒光信號(hào)。

    1.7 特異性和靈敏性實(shí)驗(yàn)

    以表1中所示菌株的基因組DNA作為模板進(jìn)行real-time RPA反應(yīng),確定是否出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線。將蠟樣芽胞桿菌基因組DNA使用ddH2O進(jìn)行10倍梯度稀釋,以不同稀釋度的DNA作為模板進(jìn)行real-time RPA反應(yīng),確定該方法的靈敏性。同時(shí)與已建立的real-time PCR方法的靈敏性進(jìn)行比較。

    1.8 人工污染樣品檢測(cè)

    蠟樣芽胞桿菌(CICC63301)經(jīng)過純培養(yǎng)后,用生理鹽水稀釋至濃度約為1.1麥?zhǔn)蠞岫?,進(jìn)行10倍梯度稀釋。將不同稀釋度的菌液1 mL分別添加到25 g大米飯樣品中(樣品預(yù)先按照GB 4789.14—2014檢測(cè),未檢出蠟樣芽胞桿菌),再添加到225 mL PBS中,用拍擊式均質(zhì)器連續(xù)均質(zhì)1~2 min,分別取1 mL模擬樣品,采用稀釋平板法,測(cè)定其活菌添加范圍為1.5×102~1.5×107CFU/g,同時(shí)從中各取1 mL模擬樣品參照1.3進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取,取1 μL作為模板進(jìn)行檢測(cè)。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 特異性實(shí)驗(yàn)分析

    對(duì)蠟樣芽胞桿菌和其他細(xì)菌基因組DNA(濃度均為100 ng/μL)作為模板進(jìn)行real-time RPA檢測(cè),結(jié)果表明僅蠟樣芽胞桿菌呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,為陽(yáng)性結(jié)果,而其他芽胞桿菌和非芽胞桿菌細(xì)菌均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(表1)。表明該方法具有良好的特異性。

    2.2 靈敏性實(shí)驗(yàn)分析

    將濃度為100 ng/μL的蠟樣芽胞桿菌基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋,連續(xù)稀釋8個(gè)梯度后,取每個(gè)梯度的核酸進(jìn)行real-time RPA和real-time PCR檢測(cè),結(jié)果表明,real-time RPA的檢測(cè)限為1.0×10-3ng/μL(圖1a),同real-time PCR方法檢測(cè)限一致(圖1b)。

    1) 1.0×102, 2) 1.0×101, 3) 1.0×100, 4) 1.0×10-1, 5) 1.0×10-2, 6) 1.0×10-3, 7) 1.0×10-4, 8) 1.0×10-5;單位ng/μL。圖1 蠟樣芽胞桿菌靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Sensitivity of real-time RPA and real-time PCR for Bacillus cereus

    2.3 人工污染樣品的檢測(cè)分析

    人工污染蠟樣芽胞桿菌的大米飯的檢測(cè)結(jié)果表明,當(dāng)污染量≥1.5×104CFU/g時(shí),real-time RPA即可檢出大米飯中蠟樣芽胞桿菌,所需要時(shí)間僅為6~13 min;當(dāng)污染量≥1.5×105CFU/g,real-time PCR方可檢出大米飯中蠟樣芽胞桿菌,所需時(shí)間在30 min以上(Ct值為20~31)。結(jié)果說明,在檢測(cè)人工污染樣品時(shí)real-time RPA的靈敏性高于real-time PCR,同時(shí)前者所需時(shí)間明顯少于后者(表3)。

    表3 蠟樣芽胞桿菌人工污染樣品檢測(cè)結(jié)果

    —:未檢出。

    3 討論與結(jié)論

    研究選取蠟樣芽胞桿菌的16S RNA基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針,建立了食品中蠟樣芽胞桿菌的real-time RPA快速檢測(cè)方法,即39 ℃恒溫反應(yīng)20 min實(shí)現(xiàn)對(duì)蠟樣芽胞桿菌的有效擴(kuò)增。方法特異性良好,靈敏性可達(dá)到1.0×10-3ng/μL,與real-time PCR檢測(cè)方法一致。對(duì)人工污染的大米飯,real-time RPA在反應(yīng)時(shí)間上明顯少于real-time PCR方法。該方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速,為食品中蠟樣芽胞桿菌污染的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了一種新的檢測(cè)方法。

    目前已報(bào)道的蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)方法有分離培養(yǎng)法、普通PCR、多重PCR、熒光PCR、LAMP及基因芯片等[12-14],但是分離培養(yǎng)法和基因芯片技術(shù)操作繁瑣,檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng);PCR技術(shù)不僅對(duì)環(huán)境要求高,而且需要昂貴的PCR儀器和熟練的技術(shù)人員。上述方法在突發(fā)食物中毒等公共衛(wèi)生事件中的應(yīng)用有諸多不便[15-16]。研究建立的real-time RPA方法與real-time PCR相比,具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)使用的OptiGene Ⅲ等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)緊湊小巧,輕便耐用,僅為1.75 kg左右,觸摸屏操作,無需連接電腦,其內(nèi)置長(zhǎng)航時(shí)鋰電池,可在無電源環(huán)境中全天戶外工作,可實(shí)現(xiàn)便攜式的致病菌現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。雖然LAMP和real-time RPA均屬于等溫檢測(cè)方法,但LAMP反應(yīng)溫度較高(>60 ℃),反應(yīng)時(shí)間一般在45~60 min[7],并且實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜,需要設(shè)計(jì)4~6條引物;而real-time RPA擴(kuò)增在常溫下(25~42 ℃)即可實(shí)現(xiàn),且一般在20 min內(nèi)即可完成,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單,僅需要2條引物和1條探針,并且RPA試劑為凍干粉形式,可實(shí)現(xiàn)常溫下運(yùn)輸,從而為蠟樣芽胞桿菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了有價(jià)值的參考方法。

    研究中real-time RPA方法的建立,結(jié)合細(xì)菌核酸的快速提取,可以達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的目的,為食品加工質(zhì)量控制及食源性疫病等公共衛(wèi)生事件中蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)提供了可借鑒的技術(shù)手段。

    [1] 程池. 食源性致病菌快速分子學(xué)檢測(cè)方法探討[J]. 食品安全導(dǎo)刊,2011(9):28-29.

    CHENG C. Discuss rapid molecular detection of foodborne pathogenicBacteria[J]. China Food Safety Magazine, 2011(9):28-29.

    [3] JENSEN G B. The hidden lifestyles ofBacilluscereusand relatives[J]. Environmental Microbiology,2003,5(8):631-640.

    [4] MA Z, LI C, SU H. Dark bio-hydrogen fermentation by an immobilized mixed culture ofBacilluscereusandBrevumdimonasnaejangsanensis[J]. Renewable Energy,2017,105:458-464.

    [5] 謝來球, 瞿麗開. 136例蠟樣芽胞桿菌食物中毒案例分析[J]. 食品安全導(dǎo)刊,2017(6):31.

    XIE L Q, QU L K.Analysis of food poisoning of 136 cases ofBacillus[J].China Food Safety Magazine, 2017(6):31.

    [6] 張志鴻, 王力均, 甘蓓,等. 基于QPCR快速檢測(cè)米飯中產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2014, 29(2):100-104.

    ZHANG Z H, WANG L J, GAN B, et al. Study on rapid detection of emeticBacilluscereusby QPCR[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2014, 29(2):100-104.

    [7] 周巍, 張薇, 劉亮,等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)酸乳中蠟樣芽胞桿菌[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù), 2013, 36(5):29-31.

    ZHOU W, ZHANG W, LIU L, et al. Detection ofBacilluscereusin yogurt by loop-mediated isothermal amplification assay[J].Journal of Dairy Science and Technology,2013, 36(5):29-31.

    [8] 賈雅菁, 付博宇, 王羽, 等. 實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)牛乳中的蠟樣芽胞桿菌[J]. 食品科學(xué),2016,37(6):184-189.

    JIA Y J, FU B Y, WANG Y, et al. Detection ofBacilluscereusin milk by real-time fluorsecence loop-mediated isothermal amplification method[J]. Food Science, 2016,37(6):184-189.

    [9] PIEPENBURG O, WILLIAMS C H, STEMPLE D L, et al. DNA detection using recombination proteins[J]. Plos Biology,2006,4(7):204.

    [10] 景志剛, 董浩, 狄棟棟, 等. 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2016,32(6):47-53.

    JING Z G, DONG H, DI D D, et al.Research progress on recombinase polymerase amplification[J]. Biotechnology bulletin, 2016,32(6):47-53.

    [11] REEKMANS R, STEVENS P, VERVUST T, et al. An alternative real-time PCR method to detect theBacilluscereusgroup in naturally contaminated food gelatine: a comparison study[J]. Letters in Applied Microbiology,2009,48(1):97.

    [12] PEDRERO M, CAMPUZANO S, PINGARRN J M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms[J]. Sensors, 2009(7):5503-5520.

    [13] 季秀玲, 魏云林, 楊琳琳,等. 熒光原位雜交檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌的方法:CN 102605084 B[P]. 2014-07-02.

    [14] 王煒, 江曉, 金萍, 等. PCR快速檢測(cè)在細(xì)菌質(zhì)控考核盲樣鑒定中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2017(4):44-48.

    WANG W, JIANG X, JIN P, et al. Application of PCR in the multi-blind quality control projects[J]. The Manuscript Editing Center, 2017(4):44-48.

    [15] DAHER R K, STEWART G, BOISSINOT M, et al. Influence of sequence mismatches on the specificity of recombinase polymerase amplification technology[J]. Molecular and Cellular Probes,2015,29(2):116.

    [16] KERSTING S, RAUSCH V, BIER F F, et al. Multiplex isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens[J]. Microchimica Acta,2014,181(13):1715-1723.

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