保加利亞乳桿菌的發(fā)酵特性及其在牦牛酸乳中的應(yīng)用

王 琪， 張 哲， 劉小鳴， 趙建新， 張 灝， 陳 衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫 214122)

*劉小鳴，女，教授，博士，主要從事乳品科學(xué)與技術(shù)方面的研究，通信作者。

牦牛是生活在海拔3 000～5 000 m的古老牛種，90%以上在我國(guó)，其中四川西部- 青藏高原一帶數(shù)量最多[1]。牦牛乳富含蛋白、脂肪、乳糖，含量遠(yuǎn)高于普通牛乳，且含有對(duì)人體十分有益的共軛亞油酸、必需氨基酸、維生素等[2]。當(dāng)?shù)厥卟?、水果等物資缺乏，人們從牦牛乳中獲取營(yíng)養(yǎng)，制作出多種傳統(tǒng)牦牛乳制品，包括酸乳、酥油、曲拉等[3]，其中牦牛酸乳是牧民家中常見(jiàn)的一種牦牛乳制品。Chen等[4-6]研究顯示牦牛酸乳中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量均顯著高于普通發(fā)酵牛乳，另有研究表明，從牦牛酸乳中分離獲得的乳酸菌多具有良好的抗氧化活性[7]，且具備降低膽固醇、膽鹽高耐受性的潛力[8]。

雖然牦牛酸乳營(yíng)養(yǎng)特性?xún)?yōu)良，但目前產(chǎn)量并不高。中國(guó)年產(chǎn)牦牛乳可達(dá)4 000萬(wàn)t，但工業(yè)生產(chǎn)所消耗的原料乳不及牦牛乳年產(chǎn)量的25%[9]。一方面，目前牦牛乳制品的研發(fā)還處于初級(jí)階段，牦牛乳的凝乳特性與普通牛乳的差異顯著，牦牛乳蛋白含量高，凝乳慢[10-11]，且凝乳塊硬度大[12]，酸度高[13]，而牦牛乳加工企業(yè)的設(shè)備較為陳舊，工藝不成熟[14]；另一方面，牦牛乳本身有一定的乳膻味，導(dǎo)致其乳制品風(fēng)味欠佳[15]。因此，文章探討了分離自牦牛酸乳的保加利亞乳桿菌的發(fā)酵特性與酸乳的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成，及其在牦牛酸乳中的應(yīng)用，對(duì)能夠快速發(fā)酵牦牛乳且賦予牦牛酸乳特征風(fēng)味的發(fā)酵劑進(jìn)行了初步的理論與應(yīng)用研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

改良MRS培養(yǎng)基(胰蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、檸檬酸二銨、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、蒸餾水)、氫氧化鈉、酚酞，均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。癸酸乙酯，色譜純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。脫脂乳粉購(gòu)自光明乳業(yè)股份有限公司，全脂牦牛乳粉購(gòu)自西藏高原之寶牦牛乳業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GR60DA型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，致微(廈門(mén))儀器有限公司；SW- CJ- 1FD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Thermo- 994型超低溫冰箱、1300- ISQ型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電子轟擊電離源(EI)及單四極桿檢測(cè)器)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；AW500SG型厭氧工作站，英國(guó)依萊泰科公司；HWS- 150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DZ400/2D型真空包裝機(jī)，上海尤溪機(jī)械設(shè)備有限公司；C1000 TouchTM型基因擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio-Rad公司；DYCP- 31DN型水平電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌株分離

2016年6月采集中國(guó)四川阿壩藏族自治州藏南當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)牦牛酸乳樣品11份，加入體積分?jǐn)?shù)40%無(wú)菌甘油，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃冰箱中保藏。

提前一天從-80 ℃冰箱中取出酸乳樣品，冰上解凍，吸取0.5 mL酸乳樣品至4.5 mL無(wú)菌生理鹽水中稀釋10倍，梯度記為10-1，以此類(lèi)推將梯度稀釋至10-6。從每個(gè)稀釋梯度的菌懸液中吸取100 μL于固體改良MRS培養(yǎng)基上，均勻涂布至粗糙，倒置，于37 ℃厭氧工作站中靜置培養(yǎng)48 h左右，取出，劃線(xiàn)分離，純化并培養(yǎng)，記錄菌落形態(tài)。挑取單菌落于液體改良MRS培養(yǎng)基中，震蕩混勻，于37 ℃厭氧工作站中靜置培養(yǎng)12～24 h，取菌液離心得菌泥，重懸于等體積終濃度為30%的無(wú)菌甘油中保藏。

1.3.2菌株鑒定

提取菌株DNA與序列擴(kuò)增：參照Hunt等[16]采用酚- 氯仿法提取菌體DNA。16S rDNA序列擴(kuò)增體系(25 μL)各組分體積：模板量為1 μL，Taq酶Mix為12.5 μL，27F為0.5 μL，1492R為0.5 μL，ddH2O為10.5 μL。所用引物為上游引物27F(AGA GTT TGA TCC TGG CCT CA 20)和下游引物1492R(GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 19)。擴(kuò)增條件：預(yù)變性溫度為95 ℃保持7 min，變性溫度95 ℃保持30 s；退火溫度為55 ℃保持30 s；延伸溫度為72 ℃保持90 s;循環(huán)33次，目標(biāo)片段長(zhǎng)度1 500 bp。0.008 g/mL瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行核酸鑒定有無(wú)目標(biāo)條帶，送予華大基因進(jìn)行鑒定。

目標(biāo)序列的鑒定： 將拼接好的16S rDNA序列導(dǎo)入NCBI在線(xiàn)平臺(tái)上的BLAST功能項(xiàng)目區(qū)，與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取相似度最高的比對(duì)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)所用的9株菌株信息如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株信息

1.3.3脫脂乳發(fā)酵乳的制備

從-80 ℃冰箱中取出保菌管，置于冰上解凍，以體積分?jǐn)?shù)2%的比例接入改良MRS培養(yǎng)基中，活化2代，再在脫脂乳中活化至菌株對(duì)數(shù)末期，調(diào)整活菌數(shù)在106CFU/mL。按體積分?jǐn)?shù)2%的比例接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%的巴氏殺菌脫脂乳中，從0 h開(kāi)始每隔2 h取樣，平行取出3份樣品，冷藏待用。

1.3.4牦牛乳發(fā)酵乳的制備

配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%的全脂牦牛乳發(fā)酵液，并按體積分?jǐn)?shù)2%的比例接種發(fā)酵，待凝乳完成后從發(fā)酵培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至4 ℃冷藏待用，其余同方法1.3.3。

1.3.5生長(zhǎng)速率測(cè)定

將每隔2 h取出的發(fā)酵乳進(jìn)行10倍稀釋至10-6，涂布計(jì)數(shù)。

1.3.6產(chǎn)酸能力測(cè)定

將供試菌株在改良MRS培養(yǎng)基中活化3代至對(duì)數(shù)末期，以2%的比例接種至改良MRS培養(yǎng)基，振蕩混勻后置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱生長(zhǎng)18 h，從0 h開(kāi)始每隔2 h取出相同體積的菌液，測(cè)定pH值。

另參照GB 5009.239—2016[17]中乳及其他乳制品的酸度測(cè)定方法，取出10 mL脫脂乳發(fā)酵液，加入20 mL新煮沸冷卻至室溫的去離子水稀釋?zhuān)渭? mL酚酞，混勻后用標(biāo)定好的0.1 mol/L NaOH滴定至溶液微紅色且半小時(shí)內(nèi)不褪色，滴定終止，記錄消耗的滴定體積。

1.3.7凝乳能力測(cè)定

隨著發(fā)酵的進(jìn)行，從0 h開(kāi)始每隔2 h觀(guān)察發(fā)酵液的流動(dòng)性，至發(fā)酵液凝固且無(wú)乳清析出時(shí)，轉(zhuǎn)移發(fā)酵乳至4 ℃冷藏24 h，待用。

1.3.8GC-MS法檢測(cè)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

參照Z(yǔ)hang等[18]的方法測(cè)定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并稍有改動(dòng)。室溫下取6 g酸乳于20 mL的萃取小瓶中，同時(shí)加入1 g氯化鈉，采用固相微萃取(SPME)方法對(duì)各酸乳進(jìn)行風(fēng)味成分的提取。自動(dòng)進(jìn)樣裝置將萃取頭CAR/PDMS(涂抹厚度為85 μm)插入密封的萃取瓶中，萃取頭暴露在樣品上部的空氣中，50 ℃下萃取30 min。

氣譜條件：Rtx-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)，進(jìn)口溫度240 ℃，分流比5，柱流速1 mL/min，載氣為氦氣。程序升溫：初始溫度30 ℃，保持3 min；15 ℃/min升溫至225 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：離子化方式EI，發(fā)射能量為70 eV，發(fā)射電流為200 μA，檢測(cè)器電壓為1.4 kV，離子源溫度250 ℃，接口溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，質(zhì)荷比30～500?；衔餀z索結(jié)果與NIST和Varian 2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行匹配，相似度達(dá)到80%以上確認(rèn)為目的化合物。以2 μL的0.05 mg/mL癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算各風(fēng)味物質(zhì)的含量。

1.3.9感官品評(píng)

采用GB/T 29605—2013[19]制定了酸乳感官品評(píng)的指標(biāo)[20-21]，組成一支10人感官小組，經(jīng)培訓(xùn)后進(jìn)行感官品評(píng)與打分。表格采用九分制，1～3分代表強(qiáng)度較弱，4～6分代表強(qiáng)度適中，7～9分代表強(qiáng)度強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)間的比較采用Tukey模型進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平為p<0.05；應(yīng)用GraphPad Prism 5進(jìn)行散點(diǎn)圖的繪制；應(yīng)用XLSTAT分析軟件對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和感官數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)，相關(guān)性分析采用偏最小二乘法分析(PLS)。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于發(fā)酵特性的乳桿菌的篩選

2.1.1菌株在改良MRS中的產(chǎn)酸能力分析

對(duì)9株乳桿菌在改良MRS中的發(fā)酵液進(jìn)行了pH值測(cè)定，結(jié)果如圖1。發(fā)酵液的起始pH值為5.51，乳桿菌C1和D-8-S180-1的產(chǎn)酸能力較弱，發(fā)酵18 h后pH值在5.2至5.3，其余7株乳桿菌在發(fā)酵18 h后發(fā)酵液的pH值在4.5～4.7，并趨于穩(wěn)定。因此8株野生乳桿菌均具備一定的產(chǎn)酸能力。

圖1 乳桿菌在改良MRS中的產(chǎn)酸能力Fig.1 Acid producing ability of Lactobacillus in modified MRS broth

2.1.2菌株在脫脂乳中的生長(zhǎng)速率分析

對(duì)9株乳桿菌在脫脂乳中的生長(zhǎng)進(jìn)行了活菌量的統(tǒng)計(jì)，以便于選擇數(shù)量級(jí)高且能夠在乳體系中快速生長(zhǎng)的乳桿菌，應(yīng)用于發(fā)酵牦牛乳。9株乳桿菌均可在脫脂乳中生長(zhǎng)，其中5株保加利亞乳桿菌和2株瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳6 h時(shí)活菌數(shù)量可達(dá)1×108～3×108CFU/mL，野生菌株D-8-S180-1生長(zhǎng)最快，6 h內(nèi)活菌量增加了近200倍， 2株瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳時(shí)生長(zhǎng)緩慢，最高活菌量低于1×108CFU/mL(見(jiàn)圖2)。因此除瑞士乳桿菌D-9-A28和D- 4-A98以外，其余6株野生乳桿菌均具備發(fā)酵牦牛乳的潛力。

圖2 乳桿菌在脫脂乳中的生長(zhǎng)速率Fig.2 Growth rate of Lactobacillus in skim milk

2.1.3菌株在脫脂乳中的產(chǎn)酸能力

通過(guò)測(cè)定菌株發(fā)酵脫脂乳時(shí)的pH值和滴定酸度可知菌株利用脫脂乳的能力強(qiáng)弱(見(jiàn)圖3)。從圖3可以看出，5株保加利亞乳桿菌和2株瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳6 h時(shí)酸度可上升至50～70°T，pH值可從6.5下降至4.7～5.2。其余2株瑞士乳桿菌D-9-A28和D- 4-A98的脫脂乳發(fā)酵液酸度上升和pH值下降較慢，與2.1.2節(jié)結(jié)果一致。

圖3 乳桿菌在脫脂乳中的pH值與滴定酸度Fig.3 pH and acidity value of Lactobacillus in skim milk

2.1.4菌株在脫脂乳中的凝乳能力分析

觀(guān)察發(fā)酵液的凝乳時(shí)間可以快速判斷菌株是否具備發(fā)酵脫脂乳的能力，一般工業(yè)發(fā)酵時(shí)凝乳時(shí)間在4～6 h。除D- 4-A98以外，其余菌株均能夠在6 h時(shí)凝乳完成，達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)(見(jiàn)表2)。

2.1.5主成分分析單菌發(fā)酵脫脂乳的揮發(fā)性風(fēng)味組成差異

Cheng[22]論述了酸乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的氣味屬性，可知酮類(lèi)、醛類(lèi)物質(zhì)能夠賦予酸乳甜味、青草香、果香味、奶油味、花香味等風(fēng)味，醇類(lèi)物質(zhì)使酸乳帶有酒味，酯類(lèi)物質(zhì)可使酸乳帶有各種水果的香味例如菠蘿味、蘋(píng)果味、香蕉味等等，酸類(lèi)物質(zhì)會(huì)帶來(lái)酸味、羊膻味、腐臭味等，醚類(lèi)物質(zhì)主要會(huì)揮發(fā)出蒸煮味和硫味等。

選取發(fā)酵終點(diǎn)的單菌發(fā)酵脫脂乳測(cè)定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，酸乳樣品經(jīng)SPME法萃取后進(jìn)行GC/MS測(cè)定，結(jié)果如表3。一共檢測(cè)出24種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醛、酮、酯、醚和酸5類(lèi)化合物，其中酸類(lèi)7種，酮類(lèi)8種，醛類(lèi)5種，酯類(lèi)2種，醚類(lèi)2種。對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分是酸類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)，不同菌株發(fā)酵的酸乳樣品的風(fēng)味組成中除壬酸、癸酸外其余風(fēng)味物質(zhì)的含量均差異顯著(p<0.05)。對(duì)照菌株C1含有較高含量的酯類(lèi)、酸類(lèi)和醛類(lèi)化合物，其中w(乙酸乙酯)為223.71 μg/kg，w(酸)為86.33 μg/kg，w(醛)為44.53 μg/kg，酮類(lèi)化合物含量較低，為7.54 μg/kg。野生保加利亞乳桿菌D-8-S180-1高產(chǎn)乙酸乙酯，6 h可達(dá)165.59 μg/kg，能夠賦予酸乳較濃的果香味；野生保加利亞乳桿菌D-10-A169產(chǎn)酸類(lèi)和酮類(lèi)物質(zhì)最高，6 h時(shí)w(酸)可達(dá)195.03 μg/kg，w(酮)為86.14 μg/kg，在帶來(lái)果香味的同時(shí)還會(huì)有較重的酸味和刺激味。

表2 實(shí)驗(yàn)菌株在脫脂乳中的凝乳情況

“-”表示未凝乳。

對(duì)發(fā)酵脫脂乳樣品的揮發(fā)性風(fēng)味數(shù)據(jù)做主成分分析(PCA)，結(jié)果如圖4。不同菌株發(fā)酵乳的風(fēng)味差異顯著，按風(fēng)味物質(zhì)的組成及含量可分為2大類(lèi)，一類(lèi)是包括對(duì)照菌株C1在內(nèi)的5株保加利亞乳桿菌產(chǎn)生的發(fā)酵乳，第二類(lèi)是4株野生瑞士乳桿菌產(chǎn)生的風(fēng)味特征相似的發(fā)酵乳，且兩類(lèi)區(qū)別顯著。

結(jié)合風(fēng)味化合物的余弦平方值(表4)來(lái)看，主成分一所對(duì)應(yīng)的風(fēng)味化合物主要包括2,3-丁二酮、2-庚酮、乙偶姻、壬酮、乙酸、甲基正壬酮、丁酸、己酸和辛酸，主成分二所對(duì)應(yīng)的風(fēng)味化合物主要是乙醛、戊酮和戊醛，主成分三對(duì)應(yīng)的風(fēng)味物質(zhì)主要是壬酸，主成分四對(duì)應(yīng)的風(fēng)味物質(zhì)主要是苯甲醛。

從對(duì)發(fā)酵乳樣品分析而得的因子得分表(表5)來(lái)看，主成分一對(duì)應(yīng)的主要發(fā)酵乳樣品有C1、D-8-S180-1、D-2-A49、D-10-A169、D-11-A188，主成分二對(duì)應(yīng)的主要發(fā)酵乳樣品是D-9-A28、D- 4-A98，主成分三對(duì)應(yīng)的樣品是D-6-A122，主成分四對(duì)應(yīng)的樣品是D-5-A108。因此根據(jù)2,3-丁二酮、2-庚酮、乙偶姻、壬酮、乙酸、甲基正壬酮、丁酸、己酸和辛酸的含量高低可區(qū)分出樣品C1、D-8-S180-1、D-2-A49、D-10-A169、D-11-A188；根據(jù)乙醛、戊酮和戊醛的含量可區(qū)分樣品D-9-A28、D-4-A98，根據(jù)壬酸含量可區(qū)分樣品D-6-A122，另外根據(jù)苯甲醛的含量可區(qū)分樣品D-5-A108。

表3 單菌發(fā)酵脫脂乳的揮發(fā)性風(fēng)味組成

不同字母表示同一行數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異(p<0.05)。

圖4 單菌發(fā)酵脫脂乳揮發(fā)性風(fēng)味組成的主成分分析Fig.4 PCA of volatile flavor composition among experimental strains

F1F2F3F4乙醛01231059220120101295丙酮03356024750178600628丁酮02497011830340801534乙酸乙酯04463050510040400001戊酮01469063560206000022戊醛015430707800000003742，3?丁二酮07388008560075700072二甲基二硫醚04869013250193801026己醛037850410000337002282?庚酮09348000010003100050乙偶姻06666005470062000163辛醛03249014120131800714二甲基三硫醚03231036230021301835壬酮08748004030012700437乙酸05531025040000000504苯甲醛01110000560005106833甲基正壬酮09071000670001100171丁酸05861038260010700010苯甲酸甲酯04561049590036200004己酸05529042450006400001辛酸05377036520017500021壬酸00425000270605501485癸酸02220004940343602888苯甲酸03205026400126300005

綜上， 由9株實(shí)驗(yàn)乳桿菌的發(fā)酵篩選實(shí)驗(yàn)得知，保加利亞乳桿菌C1、D-8-S180-1、D-2-A49、D-10-A169、D-11-A188和瑞士乳桿菌D-5-A108、D-6-A122能夠在乳體系中快速生長(zhǎng)并產(chǎn)酸，6 h使脫脂乳凝固，達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)pH值4.7。經(jīng)酸乳的揮發(fā)性風(fēng)味測(cè)定實(shí)驗(yàn)分析得知，保加利亞乳桿菌C1、D-8-S180-1、D-10-A169和瑞士乳桿菌D-5-A108、D-6-A122發(fā)酵的酸乳中的揮發(fā)性風(fēng)味特征顯著，其中保加利亞乳桿菌C1、D-8-S180-1的酸乳以果香味呈味物質(zhì)即酯類(lèi)和醛類(lèi)最為突出，瑞士乳桿菌D-5-A108、D-6-A122的酸乳以酸味呈味物質(zhì)、硫味呈味物質(zhì)較為突出。因此，結(jié)合對(duì)照菌株C1，選用風(fēng)味物質(zhì)存在差異的德氏乳桿菌保加利亞亞種C1、D-8-S180-1、D-10-A169和瑞士乳桿菌D-5-A108、D-6-A122發(fā)酵牦牛乳，并進(jìn)行發(fā)酵乳樣品的揮發(fā)性風(fēng)味測(cè)定與感官品評(píng)，以研究發(fā)酵牦牛乳的風(fēng)味特征及不同菌株發(fā)酵牦牛乳樣品的風(fēng)味差異。

表5 PCA中各因子得分

2.2 乳桿菌發(fā)酵牦牛酸乳的特性研究

2.2.1牦牛酸乳的揮發(fā)性風(fēng)味組成差異分析

牦牛酸乳經(jīng)4 ℃冷藏1 d后的揮發(fā)性風(fēng)味組成結(jié)果如表6，共檢測(cè)出27種化合物，包括酸類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、醚類(lèi)、醇類(lèi)的6大類(lèi)物質(zhì)，其中酸類(lèi)物質(zhì)9種，酮類(lèi)物質(zhì)9種，醛類(lèi)物質(zhì)5種，酯類(lèi)物質(zhì)1種，醚類(lèi)物質(zhì)2種，醇類(lèi)物質(zhì)1種。對(duì)照菌株C1的牦牛酸乳含有495.84 μg/kg的酸類(lèi)化合物、405.89 μg/kg的酮類(lèi)化合物、210.36 μg/kg的醛類(lèi)化合物、5.05 μg/kg醚類(lèi)化合物、5.92 μg/kg的酯類(lèi)化合物以及6.18 μg/kg的醇類(lèi)化合物。野生菌株D-8-S180-1、D-10-A169的牦牛酸乳樣品的酸類(lèi)物質(zhì)含量與C1相近，酮類(lèi)物質(zhì)含量較低， 約為C1樣品的62%～73%，醛類(lèi)、醚類(lèi)、醇類(lèi)物質(zhì)含量均較低，其中菌株D-8-S180-1樣品的酯類(lèi)物質(zhì)含量最高，為9.82 μg/kg。Imhof等[23]在1995年研究單菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)時(shí)列舉了各種發(fā)酵菌株的風(fēng)味組成及其特征，其中保加利亞乳桿菌在38 ℃下經(jīng)30 h發(fā)酵后最高可產(chǎn)6.17 μg/kg的乙酸乙酯。野生菌株D-5-A108、D-6-A122的牦牛酸乳樣品的酸類(lèi)物質(zhì)含量最高，超過(guò)C1樣品的2倍，酮類(lèi)物質(zhì)含量與C1樣品相近，高于D-8-S180-1、D-10-A169的牦牛酸乳樣品，另外所含醛類(lèi)、醚類(lèi)物質(zhì)也較高，其中菌株D-6-A122的樣品中醛類(lèi)物質(zhì)含量最高，為228.42 μg/kg。

2.2.2牦牛酸乳的感官評(píng)價(jià)

牦牛酸乳樣品的感官評(píng)價(jià)結(jié)果如表7、表8。在氣味上，品評(píng)員的感官評(píng)定詞確定為總體氣味、甜味、酸味、奶香味、乳脂味、果香味、膻味、硫味、濃厚感以及喜好度；在滋味上，品評(píng)員的感官評(píng)定詞確定為總體滋味、甜味、酸味、澀味、奶香味、果香味、乳脂味、不自然感、膻味、硫味、喜好度。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，在氣味上，菌株D-8-S180-1發(fā)酵的牦牛酸乳的喜好度最高，以果香味最為突出，同時(shí)膻味、酸味、乳脂味、硫味較弱；菌株C1、D-10-A169、D-5-A108、D-6-A122發(fā)酵的牦牛酸乳在氣味的喜好度上的趨勢(shì)較為相近，其中菌株D-6-A122的樣品呈酸味和奶香味最強(qiáng)。在滋味上，菌株D-8-S180-1發(fā)酵的牦牛酸乳的喜好度仍保持最高， C1樣品喜好度最差，其余三者除酸味以外其他各物質(zhì)的呈味強(qiáng)度均相近，受品評(píng)者喜好的程度優(yōu)于C1牦牛酸乳，不及D-8-S180-1的牦牛酸乳。

2.2.3牦牛酸乳的風(fēng)味組成和感官的相關(guān)性分析

基于2.2.1的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成和2.2.2的氣味感受值，利用偏最小二乘回歸方程(PLS)分析兩者的相關(guān)性，結(jié)果如圖5。圖中有2個(gè)相關(guān)變量，一是揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成，二是氣味感受值。變量之間的距離越近，說(shuō)明呈正相關(guān)的可能性越大；距離越遠(yuǎn)，說(shuō)明呈負(fù)相關(guān)的可能性越大。2個(gè)變量距離軸心的距離代表相關(guān)性的顯著程度，距離越遠(yuǎn)，顯著性越強(qiáng)。由圖5可知，乙醛、辛醛、酯類(lèi)以及2,3-丁二酮的含量與氣味中的果香味、濃厚感及喜好度呈顯著正相關(guān)，大部分酸類(lèi)物質(zhì)、醚類(lèi)物質(zhì)以及一部分酮類(lèi)物質(zhì)、醛類(lèi)物質(zhì)的含量對(duì)膻味、乳脂味、硫味、奶香味等也有較顯著的貢獻(xiàn)。

3株保加利亞乳桿菌發(fā)酵的牦牛乳的氣味感官特征呈現(xiàn)出2種不同的趨勢(shì)，2株瑞士乳桿菌發(fā)酵的牦牛乳氣味感官特征相似，呈現(xiàn)出第3種趨勢(shì)。2株野生保加利亞乳桿菌D-8-S180-1、D-10-A169的牦牛酸乳的特征風(fēng)味物質(zhì)為2,3-丁二酮、辛醛、癸酸辛酯和乙醛，含量均高于其他牦牛酸乳樣品，其中2,3-丁二酮、癸酸乙酯、乙醛是酸乳的典型風(fēng)味物質(zhì)，能夠賦予酸乳果香味[24]。其中保加利亞乳桿菌D-8-S180-1的牦牛酸乳是氣味上最受品評(píng)員歡迎的樣品，從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成及含量來(lái)看，該樣品的w(酸)為366.51 μg/kg，w(酮)為294.54 μg/kg，w(醛)為174.64 μg/ kg，在所有牦牛酸乳樣品中均處于中等水平，另外較為突出的是w(酯)為9.82 μg/ kg，遠(yuǎn)高于其他牦牛酸乳樣品，這與該菌株發(fā)酵脫脂乳時(shí)高產(chǎn)酯類(lèi)物質(zhì)的情況保持一致，同時(shí)醚類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量比為0，在所有樣品中處于最低水平。市售保加利亞乳桿菌C1牦牛酸乳的風(fēng)味組成明顯區(qū)別于任何野生菌株的牦牛酸乳的風(fēng)味，C1牦牛酸乳中丙酮、戊酮、己醛、壬酸等物質(zhì)含量均最高，其中丙酮具有飼料味、牛膻味、甜味[25]，含量過(guò)高風(fēng)味則不佳，且酯類(lèi)物質(zhì)較少，醚類(lèi)物質(zhì)較多，導(dǎo)致果香味不突出。2株野生瑞士乳桿菌D-5-A108、D-6-A122的牦牛酸乳以大量酸類(lèi)、酮類(lèi)、醚類(lèi)物質(zhì)為主體風(fēng)味物質(zhì)，酸類(lèi)物質(zhì)中乙酸、丁酸、己酸、辛酸含量均在樣品中處于最高水平，有研究表明[26-27]，丁酸、己酸、辛酸都是膻味的呈味物質(zhì)，其中辛酸的俗名為羊脂酸，具有明顯的羊膻味，同時(shí)醚類(lèi)物質(zhì)具有硫味，因此這些物質(zhì)的含量超出一定范圍時(shí)，在賦予樣品酸香味的同時(shí)，還帶來(lái)令人不愉快的膻味、乳脂味、蒸煮味、硫味，使得酸乳整體風(fēng)味不佳。

表6 單菌發(fā)酵牦牛乳的揮發(fā)性風(fēng)味組成

不同字母表示同一行數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異(p<0.05)。

表7 牦牛酸乳氣味感官品評(píng)結(jié)果

不同字母表示同一列數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異(p<0.05)。

表8 牦牛酸乳滋味感官品評(píng)結(jié)果

不同字母表示同一列數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異(p<0.05)。

圖5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與氣味感受值的PLS相關(guān)性分析Fig.5 PLS analysis between volatile flavor composition and flavor attribute values

結(jié)果表明，無(wú)論是脫脂乳體系還是牦牛乳體系，不同菌株發(fā)酵而得的脫脂酸乳和牦牛酸乳在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成上均保持著顯著差異。在發(fā)酵過(guò)程中牦牛乳的脂肪易受激活因子脂蛋白的誘導(dǎo)被乳脂蛋白脂肪酶(LPL)酯解生成中短鏈游離脂肪酸，呈現(xiàn)出不潔風(fēng)味如膻味、蒸煮味、刺激性氣味等[27]，而牦牛酸乳中的酯類(lèi)、醛類(lèi)物質(zhì)可貢獻(xiàn)出果香味，部分酮類(lèi)物質(zhì)可貢獻(xiàn)甜味、奶香味；所以，在一定范圍內(nèi)，酯類(lèi)、醛類(lèi)和部分酮類(lèi)物質(zhì)含量的升高，酸類(lèi)與醚類(lèi)物質(zhì)含量的降低將有助于提高產(chǎn)品的喜好度。

3 結(jié)果與討論

能夠發(fā)酵脫脂乳且能產(chǎn)生差異顯著的揮發(fā)性風(fēng)味的乳桿菌在發(fā)酵牦牛乳后，牦牛酸乳之間也呈現(xiàn)出顯著的差異性。經(jīng)過(guò)對(duì)冷藏1 d后的牦牛酸乳進(jìn)行感官品評(píng)后，發(fā)現(xiàn)品評(píng)員對(duì)牦牛酸乳的喜好度依次受總體強(qiáng)度、不自然感、硫味、酸味、奶香味、果香味、乳脂味、膻味、澀味影響較大，結(jié)合揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定，可以看出喜好度高的產(chǎn)品含有較高的酯類(lèi)、醛類(lèi)物質(zhì)，其中酯類(lèi)質(zhì)量比在9.82 μg/kg左右，醛類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量比在174.64 μg/kg左右，而酸類(lèi)、醚類(lèi)、醇類(lèi)物質(zhì)含量在一定范圍內(nèi)處于較低水平，其中酸類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量比在366.51～495.84 μg/kg，醚類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量比在5.05 μg/kg及以下，醇類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量比在1.42 μg/kg及以下，這種風(fēng)味組合的牦牛酸乳更受人喜愛(ài)。

我國(guó)牦牛數(shù)量眾多，牦牛乳及其乳制品是當(dāng)?shù)厝嗣駱O其重要的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)來(lái)源，牦牛乳的生產(chǎn)和利用是亟需解決的問(wèn)題。牦牛乳制品的風(fēng)味是吸引消費(fèi)者的首要因素，研究篩選出可應(yīng)用于發(fā)酵牦牛乳并產(chǎn)生特色果香味的野生菌株，將來(lái)可在單菌發(fā)酵的基礎(chǔ)上優(yōu)化菌株組合和生產(chǎn)工藝，進(jìn)一步改善牦牛酸乳的品質(zhì)。

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