基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)的血流感染致病菌早期檢測

張可昕，胡翀，陳琛，何賞，楊明，王成彬

由病原微生物引起的感染性疾病嚴(yán)重地威脅著人類的健康，其中以細(xì)菌感染最為常見，細(xì)菌性血流感染起病急、病情重、病死率高。近年來隨著各項臨床診療新技術(shù)的開展，侵入性治療手段顯著增多，患者接觸病原菌的機(jī)會大大增加，加之患者自身免疫力已受損，感染更容易發(fā)生，嚴(yán)重者會誘發(fā)多器官功能障礙綜合征，有極高的病死率[1]。目前，血流感染的診斷主要依賴血培養(yǎng)，但血培養(yǎng)鑒定周期過長，且標(biāo)本采集、送檢、培養(yǎng)過程中易受到眾多因素的干擾，易污染且陽性率不高[2]。因此，臨床亟須快速、敏感、準(zhǔn)確的血流感染診斷方法和技術(shù)。核酸質(zhì)譜技術(shù)在基因分型、核酸多態(tài)性研究、細(xì)菌耐藥性分析等方面已有廣泛研究與應(yīng)用[3]，現(xiàn)已成為快速檢測、鑒定微生物的新型生物技術(shù)[4]。基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrixassisted laser desorption/ionization，MALDI)是質(zhì)譜的一種高效電離方式[5]，本研究通過綜合解放軍總醫(yī)院檢驗科信息系統(tǒng)(laboratory information system，LIS)及國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)，統(tǒng)計血培養(yǎng)結(jié)果，篩選出10種常見病原菌，針對這10種常見病原菌建立基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)的檢測體系，并測定其靈敏度，以期指導(dǎo)感染性疾病的精準(zhǔn)診斷、精準(zhǔn)治療與精準(zhǔn)用藥。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 多重PCR、蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)消化、單堿基延伸過程采用的試劑盒MALDI-TOF-MS均購自Agena Bioscience公司(美國)；DNA提取試劑盒購自Qiagen公司(德國)。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 標(biāo)本 實驗所涉及的標(biāo)準(zhǔn)菌株包括金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusATCC25923、表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidisATCC12228、大腸埃希菌Escherichia coliATCC25922、變形桿菌Proteus mirabilisATCC29245、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosaATCC27853、肺炎克雷伯桿菌Klebsiella pneumoniaeATCC1144、鮑曼不動桿菌Acinetobacter baumanmiiATCC19606、肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniaeATCC49619、屎腸球菌Enterococcus faeciumATCC35667、糞腸球菌Enterococcus faecalisATCC29212，所有菌株均由解放軍302醫(yī)院檢驗科惠贈。

1.3 10種細(xì)菌血液感染模擬樣本 取新鮮培養(yǎng)12h的各菌株，分別配制0.5麥?zhǔn)蠁挝?約3×108CFU/ml)的菌液100μl，加入200μl純水中，得到約108CFU/ml的菌液，10倍梯度序列稀釋至10～108CFU/ml。將10種菌株隨機(jī)分為兩組，每組取5種上述制備的濃度梯度細(xì)菌懸液各100μl與500μl新鮮人EDTA抗凝血等體積混勻于1.5ml無菌Eppendorf管中。室溫放置30min后作為兩組模擬梯度濃度5重感染全血標(biāo)本用于后續(xù)實驗，同時以不加細(xì)菌的血液作為陰性對照。

1.4 菌血癥患者臨床血漿樣本 選取2017年3－5月解放軍總醫(yī)院急診科收治的疑似膿毒癥患者[發(fā)熱(體溫＞38℃)或低體溫(體溫＜36℃)，可伴有寒戰(zhàn)等全身中毒癥狀或中性粒細(xì)胞增多伴核左移等]33例，無菌操作采集患者外周靜脈血12ml，其中2ml注入EDTA抗凝管，混勻，低速離心取血漿1.5ml待檢；10ml注入血培養(yǎng)瓶(5ml/瓶)，送微生物科全自動血培養(yǎng)儀(自BioMeriuex生物公司，法國)進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。

1.5 細(xì)菌基因組DNA提取及特異性引物設(shè)計 細(xì)菌基因組DNA提取按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用DNAMAN軟件對各細(xì)菌毒力因子的基因序列進(jìn)行比對，找到每種細(xì)菌毒力因子序列的相對保守區(qū)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴(kuò)增引物，在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對引物的特異性和準(zhǔn)確性，在目標(biāo)位置設(shè)計單堿基延伸引物(表1)。

1.6 MALDI-TOF MS檢測 ①PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系5μl，包括10×Buffer 0.5μl，25mmol/L dNTP 0.1μl，25mmol/L MgCl20.4μl，0.5μmol/L混合引物1μl，5U/μlTaq酶0.2μl，DNA模板1μl，ddH2O 1.8μl；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2min，95℃變性30s、59℃退火30s、72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。②SAP消化反應(yīng)：共7μl體系，其中SAP酶混合液2μl(10×緩沖液0.17μl，1.7U/μl SAP酶0.3μl，無菌超純水1.53μl)，原PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl；PCR儀上37℃反應(yīng)40min，85℃孵育5min。③單堿基延伸反應(yīng)：總體積9μl，上一步反應(yīng)產(chǎn)物7μl，加入延伸混合引物2μl(延伸引物1μl，iPLEX緩沖液0.2μl，iPLEX終止液0.2μl，iPLEX酶0.041μl，無菌超純水0.559μl)；反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性30s、95℃變性5s、58℃退火5s、80℃延伸5s，內(nèi)部循環(huán)5次，共40個外部循環(huán)，72℃延伸3min。反應(yīng)完成后，反應(yīng)產(chǎn)物中加入16μl超純水，振蕩混勻，短時離心，將25μl體積混合液全部轉(zhuǎn)入384孔板中。加入6mg樹脂，純化反應(yīng)30min，樣品點靶，質(zhì)譜檢測，應(yīng)用Typer 4.0軟件檢測質(zhì)譜峰，根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀樣本感染細(xì)菌類型。

表1 各菌種單堿基延伸引物及延伸堿基Tab.1 Single base extension primers and extended bases for different bacterial strains

1.7 系統(tǒng)靈敏度檢測 同1.3所示，分別建立10種細(xì)菌模擬梯度濃度單重感染全血樣本，依次用本系統(tǒng)進(jìn)行檢測。細(xì)菌基因組DNA提取、檢測反應(yīng)體系及條件同上。

2 結(jié) 果

2.1 10種細(xì)菌感染菌血癥模擬樣本質(zhì)譜檢測 采用MALDI-TOF MS對模擬10種細(xì)菌感染的血液樣本進(jìn)行質(zhì)譜檢測，可同時檢測到兩組的10種細(xì)菌。第1組與第2組5種細(xì)菌膿毒癥感染樣本檢測結(jié)果如圖1A、圖2A所示，5個靶點均有延伸峰，其陰性對照樣本質(zhì)譜圖5個靶點均無延伸峰(圖1B、圖2B)。10種細(xì)菌膿毒癥感染模擬樣本經(jīng)MALDI-TOF MS分析鑒定成功。

2.2 系統(tǒng)靈敏度檢測 兩組MALDI-TOF核酸質(zhì)譜系統(tǒng)均能檢測到每毫升血液中100個菌落的單一細(xì)菌(圖3、4)，兩圖中所有菌株的延伸引物均被消耗，無引物峰出現(xiàn)。該系統(tǒng)檢測靈敏度為100CFU/ml。

2.3 臨床樣本MALDI-TOF MS檢測及其與血培養(yǎng)法的比較 33例臨床膿毒癥樣本中，血培養(yǎng)檢測陽性樣本有6例，分別為大腸埃希菌、糞腸球菌、摩氏摩根菌、人葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌，陽性率18.2%(6/33)，用時72～96h。核酸質(zhì)譜系統(tǒng)檢測陽性4例，分別是大腸埃希菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌，陽性率12.1%(4/33)，用時9.5h；有2例病原菌(摩氏摩根菌、人葡萄球菌)不包含在該檢測系統(tǒng)內(nèi)，故未檢出。

圖1 第1組5種細(xì)菌多重感染膿毒癥模擬樣本質(zhì)譜圖Fig.1 MALDI-TOF MS of mimic sepsis infected with 5 kinds of bacteria in group 1

圖2 第2組5種細(xì)菌多重感染膿毒癥模擬樣本質(zhì)譜圖Fig.2 MALDI-TOF MS of mimic sepsis infected with 5 kinds of bacteria in group 2

圖3 第1組5種細(xì)菌MALDI-TOF MS檢測靈敏度分析Fig.3 Sensitivity of 5 kinds of bacteria in group 1 detected by MALDI-TOF MS

3 討 論

血流感染的早期診斷是國內(nèi)外學(xué)者一直努力的目標(biāo)，目前病原微生物診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是血培養(yǎng)法[2]，但是其操作過程復(fù)雜、耗時長，通常需要2d以上才能觀察到結(jié)果，不能滿足臨床早期診斷的要求，尤其對營養(yǎng)要求較高的病原菌缺乏敏感性，很難培養(yǎng)出陽性結(jié)果[2]，嚴(yán)重影響了患者的治療和預(yù)后。血流感染致病菌的其他傳統(tǒng)檢測方法依據(jù)細(xì)菌形態(tài)學(xué)、染色特征及代謝特征進(jìn)行鑒定，分度低，操作繁瑣，不能準(zhǔn)確區(qū)分到細(xì)菌種屬，無法完全準(zhǔn)確地指導(dǎo)臨床進(jìn)行抗生素的合理使用。

在基于分子生物學(xué)技術(shù)的細(xì)菌分類鑒定方法中，普通PCR法需要瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物鑒定，不僅操作繁瑣，擴(kuò)增的產(chǎn)物還會造成氣溶膠污染，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性[4]；另外瓊脂糖凝膠電泳分辨率有限，對于低濃度的擴(kuò)增產(chǎn)物容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果。實時熒光定量的多重PCR技術(shù)受檢測儀器通道數(shù)的限制，每次只能檢測2～3種細(xì)菌[6]，而患者感染的發(fā)生往往不是由單一細(xì)菌引起，而是1～2種細(xì)菌的混合感染[7]，因此實時熒光定量PCR技術(shù)無法準(zhǔn)確地反映菌群的組成和多樣性。其他方法還包括DNA測序和病原體蛋白多肽特征指紋圖譜法。DNA測序操作復(fù)雜，成本昂貴且費時；病原體蛋白多肽特征指紋圖譜法通過MALDI-TOF MS對病原體中的蛋白多肽進(jìn)行檢測，但蛋白質(zhì)譜檢測需要不斷增加質(zhì)譜的細(xì)菌數(shù)據(jù)庫，建立每種細(xì)菌的特征指紋多肽圖譜，而且不同質(zhì)譜系統(tǒng)對同一類型細(xì)菌的鑒定正確率存在一定差異[8]。

圖4 第2組5種細(xì)菌MALDI-TOF MS檢測靈敏度分析Fig.4 Sensitivity of 5 kinds of bacteria in group 2 detected by MALDI-TOF MS

本研究建立的核酸質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，結(jié)合了簡單、可靠的多重PCR技術(shù)和先進(jìn)的Mass ARRAY iPLEX單堿基延伸技術(shù)、MALDI-TOF MS技術(shù)，通過判斷分子量的差異進(jìn)行感染細(xì)菌的基因檢測，只需在明確檢測目標(biāo)的堿基差異后，通過引物設(shè)計自動獲取并記錄不同檢測位點的分子量，隨后在檢測結(jié)果中根據(jù)各檢測位點分子量位置的出峰情況鑒別被檢樣品中病原微生物的種類，特異性極高。如果為多重感染，則能同時獲得多個對應(yīng)的延伸峰(如圖2所示)，清晰客觀地獲得檢測結(jié)果。與單純PCR擴(kuò)增和熒光定量PCR相比，核酸質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)一步提高了檢測的通量及靈敏度，一次可同時檢測384個樣本[9]，本實驗中每個樣本可一次檢測5個延伸位點；靈敏度高，能夠直接檢測到2個拷貝數(shù)的病原體[9]，本實驗檢測靈敏度為100CFU/ml；檢測時間短，一次檢測只需9～10h即可完成。

目前分子生物學(xué)技術(shù)直接用于臨床菌血癥樣本檢測的難點在于菌血癥患者血液中細(xì)菌數(shù)量少，細(xì)菌基因組難以獲得[10]，尤其以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭陽性球菌，細(xì)菌細(xì)胞壁厚，難以破壁[11]，在全血中提取尤為困難。本實驗摸索出全血樣品細(xì)菌基因組DNA的提取方法，在使用Qiagen試劑盒提取前，首先低速離心得到富含菌體的血漿，物理振蕩破碎菌體，該處理穩(wěn)定了全血樣品細(xì)菌基因組DNA提取技術(shù)，實現(xiàn)了無需血培養(yǎng)，對血流感染病原微生物直接、靈敏、準(zhǔn)確的鑒定，大大縮短了檢測時間。同時該檢測體系已通過少量臨床菌血癥患者血液標(biāo)本檢測，有望為臨床早期診斷提供一種新方法，下一步研究將收集大樣本的臨床標(biāo)本對該檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性和效能進(jìn)行驗證。

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