二甲雙胍對(duì)ALDH+胃癌干細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制

王一，向勇平，劉丹丹，劉理金，姜偉，李錦毅

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)是存在于腫瘤中的一小群特質(zhì)細(xì)胞[1]，既有類(lèi)似干細(xì)胞的自我更新、增殖、分化特性，同時(shí)有強(qiáng)致瘤能力[2-3]。1997年Bonnet等[4]首次在急性髓性白血病中發(fā)現(xiàn)CSC，隨后實(shí)體瘤乳腺癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結(jié)腸癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌等中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了CSC[5]。乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)是一種催化細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸、催化視黃醇氧化為視黃酸的細(xì)胞溶質(zhì)酶。研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)ALDH1是CSC及正常干細(xì)胞的共同特征[6-7]。二甲雙胍(metformin，Met)是治療2型糖尿病的傳統(tǒng)口服藥物，研究發(fā)現(xiàn)其可影響腫瘤細(xì)胞的代謝及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，具有抗腫瘤作用[8-10]。本研究通過(guò)ALDH標(biāo)志物分選胃癌干細(xì)胞，并進(jìn)一步探討Met對(duì)CSC的抑制作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和設(shè)備 細(xì)胞系MKN45由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB/c-nu小鼠，雌性，4周齡，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。主要試劑：RPMI 1640、DMEM/F12培養(yǎng)基、無(wú)血清添加劑N2、B27購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，重組人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(recombinant human epidermal growth factor，EGF)、重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子(recombinant human basic fibroblast growth factor，bFGF)購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司，胰酶、四甲基偶氮唑鹽(methabenzthiazuron，MTT)、焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，青霉素、鏈霉素購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，結(jié)晶紫購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，ALDEFLUOR?干細(xì)胞鑒定試劑盒購(gòu)自加拿大Stem Cell公司。普通和倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 ALDH+CSC細(xì)胞鑒定

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及ALDH+細(xì)胞分選 將人胃癌細(xì)胞系MKN45用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化后傳代。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備濃度為1×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液。標(biāo)記一個(gè)實(shí)驗(yàn)管和一個(gè)對(duì)照管

實(shí)驗(yàn)管：在細(xì)胞中加入活化的ALDEFLUOR?試劑5μl/ml，由于A(yíng)LDH能將氟硼二吡咯氨基乙醛(BAAA)轉(zhuǎn)化為綠色發(fā)光物氟硼二吡咯甘氨酸(BAA)，所以通過(guò)專(zhuān)用通道分選帶綠色熒光BAA的細(xì)胞，即為ALDH+細(xì)胞[11]。

對(duì)照管：作為陰性對(duì)照組。加入十二烷基三乙基溴化銨(DEAB) 5μl/ml，由于特殊抑制劑DEAB能抑制ALDH的作用，所以可抑制BAAA轉(zhuǎn)化為BAA，故分選出ALDH–細(xì)胞。反應(yīng)30min后，250×g離心5min，棄上清，用ALDEFLUOR?緩沖液重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)前加入碘化丙啶(PI)染色標(biāo)記死亡細(xì)胞。

1.2.1.2 自我更新能力實(shí)驗(yàn) 分選得到的ALDH+和ALDH–細(xì)胞分別用PBS清洗2次，懸浮于CSC培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為5000個(gè)/ml，每孔200μl接種于96孔板，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。分別于1、2、3、4、5、6、7、8d(以24h作為1d)時(shí)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞在570nm處的光密度(OD)值，并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.1.3 分化能力實(shí)驗(yàn) 將MKN45親本細(xì)胞及分選所得ALDH+細(xì)胞和ALDH–細(xì)胞以5×104個(gè)/ml接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1周后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MKN45親本細(xì)胞、ALDH+細(xì)胞和ALDH–細(xì)胞中ALDH+細(xì)胞所占比例。

1.2.1.4 致瘤實(shí)驗(yàn) 將ALDH+和ALDH–細(xì)胞懸浮于PBS與基質(zhì)膠(1:1)混合液中，分為ALDH+細(xì)胞組和ALDH–細(xì)胞組，每組接種5×104個(gè)細(xì)胞于BALB/c-nu小鼠皮下，每組接種6只小鼠，觀(guān)察出瘤情況，測(cè)量瘤體長(zhǎng)短徑，記錄瘤體出現(xiàn)的和間及個(gè)數(shù)。瘤體體積=1/2長(zhǎng)徑×短徑×短徑。

1.2.2 Met對(duì)ALDH+細(xì)胞生長(zhǎng)及相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用

1.2.2.1 ALDH+細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN45親本細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以1×106個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞。將加入終濃度分別為1、5mmol/L Met的細(xì)胞組作為1mmol/L Met組、5mmol/L Met組，以不加藥物的細(xì)胞為對(duì)照組(命名為MKN45細(xì)胞組)，各組處理48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)ALDH+細(xì)胞比例。

1.2.2.2 RT-PCR檢測(cè)干性相關(guān)基因Oct4、Sox2和AKT的表達(dá) 采用Trizol法提取1.2.2.1所述對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總RNA，取1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA產(chǎn)物為模板，分別加入Oct4、Sox2、AKT上下游引物，以GAPDH作為內(nèi)部參照。Oct4上游引物：5'-AGCGAACCAGTATCGAGAAC-3'，下游引物：5'-TTACAGAACCACACTCGGAC-3'；Sox2上游引物：5'-ACACCAATCCCATCCACACT-3'，下游引物：5'-GCAAACTTCCTGCAAAGCTC-3'；AKT上游引物：5'-TCTATGGCGCTGAGATTGTG-3'，下游引物：5'-CTTAATGTGCCCGTCCTTGT-3'；GAPDH上游引物：5'-CCGTCTAGAAAAACCTGCC-5'，下游引物：5'-GCCAAATTCGTTGTCATACC-5'。反應(yīng)體系含上下游引物各0.4μl，模板cDNA 1μl，ROX對(duì)照染料0.4μl，SYBR Premix ExTaq10μl，DEPC水7.8μl，共20μl。95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)。利用StepOne軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值為Ct值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料以百分率表示。兩組計(jì)量資料滿(mǎn)足正態(tài)、方差齊性的基礎(chǔ)上，采用t進(jìn)行比較，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ALDH+CSC的鑒定和驗(yàn)證

2.1.1 自我更新能力 如圖1所示，培養(yǎng)分選后的ALDH+和ALDH–細(xì)胞均持續(xù)生長(zhǎng)，3d后ALDH+組細(xì)胞生長(zhǎng)速度快于A(yíng)LDH–組細(xì)胞(P＜0.05)。

2.1.2 ALDH+細(xì)胞的分化能力 由圖2可見(jiàn)，MKN45親本細(xì)胞及其分選出的ALDH+和ALDH–細(xì)胞培養(yǎng)1周后，ALDH+的表達(dá)率分別為33.8%、37.7%和7.3%。

圖1 ALDH+細(xì)胞及ALDH–細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig. 1 Survival curves of ALDH+ and ALDH– cells

圖2 MKN45親本細(xì)胞及ALDH+、ALDH–細(xì)胞培養(yǎng)1周后ALDH+細(xì)胞的比例Fig. 2 Proportion of ALDH+ cell in MKN45 cells, ALDH+ cells and ALDH– cells 7 days after cultivation in vitro

2.1.3 ALDH+細(xì)胞的致瘤能力 由圖3可見(jiàn)，ALDH+細(xì)胞接種小鼠在第10天出現(xiàn)瘤體，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束致瘤率為66.7%；ALDH–細(xì)胞接種小鼠在第12天出現(xiàn)瘤體，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)致瘤率為50%(圖3)。ALDH+細(xì)胞接種小鼠的腫瘤體積39.8±33.9mm3，與ALDH–細(xì)胞組細(xì)胞(12.5±18.5m3)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)ALDH+細(xì)胞組、ALDH–細(xì)胞組移植瘤瘤體比較Fig. 3 The size of transplanted tumors in ALDH+ cell group and ALDH– cell group at the end of the experiment

2.2 Met對(duì)ALDH+細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 由圖4可見(jiàn)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MKN45細(xì)胞組、1mmol/L Met組、5mmol/L Met組中ALDH+細(xì)胞比例分別為29.9%、17.0%、8.7%。重復(fù)試驗(yàn)12次檢測(cè)后，MKN45細(xì)胞組、1mmol/L Met組、5mmol/L Met組ALDH+細(xì)胞比例分別為36.5%±5.4%、15.6%±1.9%和7.6±1.6%，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 Met對(duì)Oct4、Sox2和AKT基因表達(dá)的影響

2.3.1 Met對(duì)干性相關(guān)基因Oct4、Sox2 mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，Oct4 mRNA在1mmol/L Met組表達(dá)高于MKN45細(xì)胞組，5mmol/L Met組表達(dá)低于MKN45細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與MKN45細(xì)胞組相比，Sox2 mRNA在兩個(gè)Met處理組表達(dá)均下降，且隨Met濃度升高下降更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖5A、B)。

2.3.2 Met對(duì)AKT mRNA表達(dá)的影響 由圖5C可見(jiàn)，與MKN45細(xì)胞組相比，AKT mRNA在兩個(gè)Met處理組中均表達(dá)下降，且隨Met濃度升高下降更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 三組ALDH+細(xì)胞比例比較Fig. 4 The proportion of ALDH+ cells in the 3 groups of cells

圖5 三組Oct4、Sox2和AKT mRNA的表達(dá)Fig. 5 Expressions of Oct4, Sox2 and AKT mRNA in the 3 groups of cells

3 討 論

CSC的分選鑒定是CSC研究中的關(guān)鍵問(wèn)題。CSC的鑒定一般基于特殊標(biāo)志物，如膜蛋白或細(xì)胞酶[12]、側(cè)群細(xì)胞(SP細(xì)胞)[13]或CD133[14]等具有干細(xì)胞特性的分子標(biāo)志物。ALDH是存在于細(xì)胞內(nèi)的一種依賴(lài)NADP的氧化酶，在干細(xì)胞的自我保護(hù)、分化與增殖方面具有重要作用，是正常干細(xì)胞與CSC的主要標(biāo)志物[15]。在實(shí)體瘤中，ALDH可作為CSC的標(biāo)志物[16]。

本研究對(duì)ALDH的生物學(xué)特性進(jìn)行分析顯示，ALDH+細(xì)胞的生長(zhǎng)速度快于A(yíng)LDH–細(xì)胞，ALDH+和ALDH–細(xì)胞培養(yǎng)1周后，ALDH+細(xì)胞中分化出ALDH–細(xì)胞，分裂后的細(xì)胞中ALDH+表達(dá)比例接近MKN45親本細(xì)胞，該結(jié)果說(shuō)明ALDH+細(xì)胞可誘導(dǎo)分化出ALDH–細(xì)胞。而ALDH–細(xì)胞在培養(yǎng)后也出現(xiàn)了小部分的ALDH+細(xì)胞，這是由于具有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞才含有ALDH反應(yīng)產(chǎn)物，所以ALDEFLUOR?干細(xì)胞鑒定試劑不能對(duì)死細(xì)胞或沒(méi)有完整細(xì)胞膜的衰老細(xì)胞進(jìn)行鑒定。因此考慮是由于細(xì)胞的不均一性、培養(yǎng)條件的不均一性或處于不同細(xì)胞周期等因素導(dǎo)致ALDH–細(xì)胞培養(yǎng)后中有ALDH+細(xì)胞的出現(xiàn)。

致瘤實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證CSC的金標(biāo)準(zhǔn)[17]。本研究裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，ALDH+細(xì)胞致瘤率高、出瘤早、瘤體大、生長(zhǎng)速度快。以上結(jié)果從自我更新能力、分化能力和致瘤能力方面證實(shí)了胃癌ALDH+細(xì)胞具有CSC特性，表明ALDH+細(xì)胞可作為靶細(xì)胞用于胃癌的治療研究。

有報(bào)道證實(shí)，在乳腺癌、胰腺癌和惡性膠質(zhì)瘤中Met可抑制其CSC的生長(zhǎng)[18-19]，且Met可抑制卵巢癌CSC-ALDH+細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[20]。本實(shí)驗(yàn)研究了Met對(duì)ALDH+胃癌CSC的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度Met均可降低胃癌細(xì)胞MKN45中ALDH+細(xì)胞的比例，且隨著二甲雙胍濃度的升高，ALDH+細(xì)胞的比例明顯下降，表明Met對(duì)CSC具有抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步探索了Met對(duì)干性相關(guān)基因Oct4和Sox2表達(dá)的影響。RT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度的Met作用后，胃癌細(xì)胞系中Oct4和Sox2表達(dá)量均有變化。Oct4基因在1mmol/L Met作用后出現(xiàn)輕度上調(diào)，5mmol/L Met作用后表達(dá)明顯下降。Sox2基因在1mmol/L、5mmol/L Met作用后均表現(xiàn)為下調(diào)，且隨二甲雙胍濃度升高表達(dá)量逐漸下降。Oct4和Sox2基因表達(dá)量下降與干細(xì)胞量下降有關(guān)，此結(jié)果與Met抑制ALDH+細(xì)胞生長(zhǎng)相一致。AKT是PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)基因，PI3K/AKT信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生相關(guān)[21-22]，AKT過(guò)表達(dá)與腫瘤組織耐受化療有關(guān)[23]。有報(bào)道指出，Met可通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制ALDH+胰腺癌CSC[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Met作用后AKT基因表達(dá)量下降。由于前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)Met可抑制ALDH+細(xì)胞的增殖，且ALDH+細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，因此推測(cè)Met也是通過(guò)抑制AKT基因的表達(dá)，從而降低ALDH+胃癌干細(xì)胞的耐藥性，使ALDH+細(xì)胞的增殖受到抑制，進(jìn)而發(fā)揮抑制胃癌干細(xì)胞的作用。當(dāng)然，該推測(cè)還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，Met可抑制胃癌細(xì)胞系中ALDH+細(xì)胞生長(zhǎng)，即可抑制胃癌CSC的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制推測(cè)與Met抑制PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。同時(shí)Met也可為臨床治療胃癌提供選擇參考。

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