美洲大蠊多肽對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的作用研究

★ 杜華鈺 袁發(fā)璐 張蕊 彭芳

(大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院 云南 大理 671000)

前期對(duì)美洲大蠊(Periplanetaamericana)進(jìn)行了深入系統(tǒng)研究[1-14]，本課題組已研制出康復(fù)新、心脈龍、肝龍等多種以美洲大蠊為原料的新藥。近期研究發(fā)現(xiàn)美洲大蠊抗腫瘤活性部位CⅡ-3和脫脂膏有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)美洲大蠊CⅡ-3的基本組分為肽類分子，并分離出13個(gè)系列活性多肽，其中美洲大蠊多肽PAP-2具有良好的抗腫瘤作用，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步完善。

惡性腫瘤的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移與血管生成之間的密切關(guān)系已逐漸受到廣泛關(guān)注。本文將美洲大蠊多肽PAP-2與美洲大蠊抗腫瘤活性部位CⅡ-3 和脫脂膏進(jìn)行比較，采用雞胚絨毛尿囊膜(click embryo chorioallanoic membrane，CAM)模型，觀察美洲大蠊多肽對(duì)CAM血管生成的影響。以闡明美洲大蠊多肽分子在調(diào)控腫瘤血管生成中的作用機(jī)制及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，旨在為多肽類抗腫瘤藥物的開發(fā)提供新的理論參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，44～47日齡，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(川) 2013-17。

1.2 實(shí)驗(yàn)雞胚 受精種蛋，購于大理雞鳴江種雞有限公司。

1.3 藥物 美洲大蠊多肽PAP-2、美洲大蠊CⅡ-3和脫脂膏均由大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院提供。

1.4 試劑 沙利度胺(Sigma公司)；甲醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；生理鹽水(貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司)；水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)。

1.5 器材 數(shù)碼相機(jī)(Nikon相機(jī))；恒溫培養(yǎng)箱(上海恒科學(xué)儀器有限公司)；離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 含藥血清的制備及分組 將Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、沙利度胺組(200mg/kg)、美洲大蠊多肽PAP-2低、中、高劑量組(2.5、5、10mg/kg)、美洲大蠊CⅡ-3低、中、高劑量組(50 、100、200 mg/kg)、美洲大蠊脫脂膏低、中、高劑量組(50 、100、200mg/kg)，每組6只。各組動(dòng)物均連續(xù)灌胃給藥7d，空白對(duì)照組用生理鹽水灌胃。末次給藥1h后，用10 %水合氯醛麻醉動(dòng)物，腹主動(dòng)脈取血6～8 mL，放于離心機(jī)中，3000r / min離心10min，分離血清，將血清置于56 °C水浴中滅活30min后，用一次性0.22μm微孔濾器過濾除菌，分裝后于-20 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 假氣室的制備及給藥 取7日齡雞胚按上述分組。用75 %酒精棉球?qū)﹄u胚氣室表面進(jìn)行擦洗消毒，去除雞胚氣室端外殼，用眼科鑷輕輕撕掉內(nèi)膜，暴露含有豐富血管的尿囊膜組織。將濾紙片放于CAM上血管較稀疏的位置，實(shí)驗(yàn)組滴加不同濃度藥物的含藥血清，空白對(duì)照組加入生理鹽水注射液，每只雞胚滴加100μL。然后用無菌封口膜封閉卵殼開口，造成假氣室，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育。

2.3 載體制備 選擇0.22μm混合纖維素微孔濾膜為載體，用打孔器制成直徑0.5cm的圓形濾紙片，經(jīng)高壓滅菌后備用。

2.4 CAM模型的制作 加藥孵育48h后，在尿囊膜上滴加10 %的甲醛，室溫下固定30 min，待CAM的血管完全凝固后，用眼科剪剪下3cm×3 cm尿囊膜，放在載玻片上展開，并以濾紙為背景在自然光線下用數(shù)碼相機(jī)拍攝CAM血管，拍照時(shí)禁用閃光燈。利用Image-Pro Plus 6.0軟件處理圖像，測(cè)量各組CAM血管數(shù)目和血管面積。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析；結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)圖表采用Origin Pro 8.6進(jìn)行繪制。

3 結(jié)果

與空白對(duì)照組相比，經(jīng)美洲大蠊多肽PAP-2含藥血清和沙利度胺含藥血清作用后，CAM血管數(shù)目和血管面積明顯減少，且隨著劑量的增加，CAM血管數(shù)目和血管面積逐漸減小。沙利度胺含藥血清組對(duì)CAM的抑制作用優(yōu)于PAP-2低劑量和中劑量含藥血清組，但是不及PAP-2高劑量含藥血清組的效果好(P<0.05，0.01)。與空白對(duì)照組和沙利度胺含藥血清組相比，經(jīng)美洲大蠊CⅡ-3和脫脂膏作用后，CAM血管數(shù)目和血管面積明顯高于正常組，且隨著劑量的增加，血管數(shù)目和血管面積均增加(P<0.05，0.01)，結(jié)果見表1及圖1。

表1 美洲大蠊含藥血清對(duì)CAM血管生成的影響

注：各給藥組與空白血清組比，*P< 0.05，**P< 0.01；與沙利度胺含藥血清組比，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

4 討論

腫瘤血管生成是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜病理過程，受血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子的的雙重調(diào)控[15]。在正常情況下，血管生成促進(jìn)因子和抑制因子之間處于一個(gè)平衡的狀態(tài)，此時(shí)，血管生成不會(huì)被啟動(dòng)。而一旦它們之間的平衡信號(hào)被破壞，就會(huì)引起腫瘤血管生成的“開關(guān)”趨向開啟，使得腫瘤組織內(nèi)不斷形成新的血管，從而導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。目前已上市的靶向血管生成藥物中大部分都是化學(xué)藥物，例如舒尼替尼、貝伐單體、蘭尼單體和索拉非尼等，然而化學(xué)藥物帶來的副作用大大降低了這類藥物治療肝癌的效果。因此，從天然藥物中開發(fā)抗血管生成藥成為當(dāng)前治療癌癥的一個(gè)研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

A：空白血清組；B：沙利度胺含藥血清組；C：PAP-2低劑量組；D：PAP-2中劑量組；E：PAP-2高劑量組；F：CⅡ-3低劑量組；G：CⅡ-3中劑量組；H：CⅡ-3高劑量組；I：脫脂膏低劑量組；J：脫脂膏中劑量組；K：脫脂膏高劑量組

圖1 美洲大蠊含藥血清對(duì)CAM血管生成的影響

本課題組前期研究中已證明美洲大蠊活性部位CⅡ-3和脫脂膏有較強(qiáng)的抗肝癌作用。但由于CⅡ-3和脫脂膏僅僅只是美洲大蠊的抗肝癌活性部位，不是單體。于是課題組后期從美洲大蠊抗肝癌活性部位CⅡ-3中分離得到13個(gè)多肽類分子(命名為PAP系列多肽活性分子)。其中，具有Arg-Gly-Asp(RGD)肽的特征的PAP-1和PAP-2呈現(xiàn)出明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的活性。且前期研究表明，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用較好的是PAP-2，所以在本文中，選擇美洲大蠊多肽PAP-2制備不同濃度的含藥血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

CAM模型是血管生成研究領(lǐng)域的重要模型，據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)，在雞胚發(fā)育的第8～12 d，CAM中的血管將處于一個(gè)豐富的階段[16]，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇發(fā)育至第7天的雞胚進(jìn)行給藥。

結(jié)果表明，美洲大蠊多肽PAP-2含藥血清可以抑制CAM血管生成，且隨著劑量的增加，其抑制作用越明顯。而美洲大蠊CⅡ-3和脫脂膏卻促進(jìn)CAM血管的生成，促進(jìn)作用呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)合前期研究結(jié)果，推測(cè)美洲大蠊多肽可能是通過下調(diào)VEGF的表達(dá)抑制體內(nèi)血管生成，因此我們初步判斷美洲大蠊多肽抗血管生成過程

與VEGF相關(guān)通路息息相關(guān)，且近幾年來的研究表明，VEGFR不僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而且在多種腫瘤中也有表達(dá)[17-18]。但目前肝癌是否具有VEGF和VEGFR共表達(dá)，VEGF作用于VEGFR后是否促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及血管生成等問題，一直都是當(dāng)前靶向抗肝癌研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。因此，下一步研究可以以“VEGF/VEGFR相關(guān)靶點(diǎn)”為作用機(jī)制研究對(duì)象，重點(diǎn)闡明美洲大蠊多肽分子在調(diào)控VEGF/VEGFR信號(hào)通路以及其他信號(hào)通路中的作用機(jī)制及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，明確美洲大蠊多肽在抗腫瘤血管生成中的作用機(jī)制，旨在為多肽類抗腫瘤藥物的開發(fā)提供新的理論參考。

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